Summary
本视频演示了用来种植原代培养的胚胎的程序
Abstract
已取得的无脊椎动物的准备工作，最显着的鱿鱼巨大的突触的突触前神经递质释放的离子电流的耦合多的信息。然而，除了用于制备这里描述的，存在几脊椎动物制剂，它能够使神经递质释放和突触前的离子电流的同时测量。胚胎爪蟾运动神经元和肌肉细胞中，可以在简单的培养基在室温下一起成长，它们将形成功能性突触在1224小时内，并且可以被用来研究数天的神经和肌肉细胞的发育和突触的相互作用（直到过度生长）。这些共培养超过其他脊椎动物制剂的一些优点包括简单的准备，保持文化和在室温下工作的能力，和突触形成2就绪无障碍-4。制品被广泛地用于研究的生物物理特性的离子通道及突触前递质释放的调节5-8。此外，准备借给其他用途，包括研究神经轴突生长和突触9-12，神经递质的释放13日至15日 ，在神经调节16,17扩散使者的作用的分子机制，并在体外突触可塑性18 - 19。
Protocol
1。实验前的准备工作
- 准备以下的解决方案（见表1的组合物）：（一）NFR1升（普通青蛙林格氏），（二），100毫升10％的盐水，（三）100毫升CMF（Ca 2 +的2 +的溶液/镁）和（d）1毫升ITS（胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒，Sigma公司I1884）和（e）100毫升的L-15培养基和（f）10毫升HCG（人绒毛膜促性腺激素西格玛CG-10），（克）100毫升K +-内部溶液和（h）100毫升K +-内部溶液为两性霉素B溶液1的渗透强度应进行检查，以确保它是约260毫渗使用的蒸气压渗透压计（ 例如 WESCOR模型＃5100C） 。
- 过滤消毒的解决方案（b）和（c）所示。解决方案（一）（b）和（c）可以被存储长达三个月在4℃下准备药瓶含有冻干的粉末通过25号注射器针头和注射器过滤器通过加入1毫升去离子水H 2 O的溶液（d）。这最后的溶液c可在4℃下存储30天。
- 准备溶液（e）在层流罩，通过组合所有的组件在一个烧杯或烧瓶。过滤消毒的最终解决方案，并转移到无菌的离心管10毫升等分。贮存于-20℃下
- 准备的HCG（溶液（f）段），加入10毫升去离子水H 2 O药瓶含有冻干的粉末通过25号注射器针头和注射器过滤器。此最终的解决方案可以在4℃下存储30天。
- 制作至少两个显微切割工具通过胶合一个Minutien引脚（26002-10，精细科学工具）与氰基丙烯酸酯胶的玻璃巴斯德吸管的端。允许引脚的锋利的末端延伸过去的吸液管的端部约0.5厘米。
- 前两天准备的文化，诱导育种以下步骤。通过观察泄殖腔突出，红色的女性和黑暗的色素沉着的平面苏识别的滋生准备对非洲爪蟾制品表面的前爪的男性。的时间，净重青蛙和保持它的腹侧面的净水槽，因此，它不能逃脱。通过网和皮下背淋巴囊注射1毫升溶液（F）。
- 将养殖对在有盖的水10加仑的油箱。为了确保动物不会肆意践踏新铺设和受精的鸡蛋，安装的屏蔽层与网目尺寸约1.5“安装约1-2英寸以上的罐底（ 图1A）。
- 不受干扰12-48小时，直到离开青蛙的动物是在抱，受精卵观察屏幕下方的地板上（ 图1B）。
- 从油箱中取出的动物，但静置至少24小时不再离开的鸡蛋。六个星期后，这对青蛙可以重新孕育。
- 松开胚胎从罐底，然后将其转移到四，五60x15毫米崇拜URE菜肴，含有10％食盐水（溶液b）。根据计划Niewkoop和Faber（见20），排序的胚胎阶段。有用的胚胎将是那些在阶段22-24。 图2A示出了在约级22胚胎太多的发展是有用的（约级28），而图2B示出的胚胎。重要的是要选择健康的胚胎，在外观上与浅棕色和白色的斑点是光滑的理想。胚胎有大的黑色或白色斑块，一般都是不健康的，无法使用。
2。 非洲爪蟾胚胎的显微切割
- 层流罩，标签内，并，填补约一半60x15毫米无菌培养皿用10％盐水;和与CMF之一。
- 使用无菌，玻璃巴斯德移液管转移五至十个阶段22-24的胚胎成一个含有10％食盐水的菜肴。援助的立体声变焦解剖显微镜油烟机内（0.6〜5倍与10倍的目镜），取出的果冻大衣，卵黄膜从每个胚胎，使用两对不育＃5镊子（11251-30，精细的科学工具）。 （请参阅图3A和3B）。
- 通过他们的时间，通过剩余的10％的盐水的两道菜，最后放入菜含有CMF清洗裸露的胚胎。使用新的，为每个传输和无菌移液管从培养皿转移到培养皿的溶液的体积减至最小。
- 反过来，轻轻地但坚定持有每个胚胎与对钳子，并使用显微切割工具，塑造在步骤1.5中，移除位于最背侧的方面的动物的神经管和相关的肌节。做到这一点，通过使三片，在任一端的位置的神经管和三分之一只是腹侧（ 图4A）中的一个。将的每个解剖神经管/肌节的菜到一个干净的部分，从蛋黄造粒es和其他碎片（ 图4B）。背腹轴和神经管和肌节的位置， 如图4中所示。
- 经过约15分钟，在这个解决方案（CMF）使用镊子，解除皮肤色素沉着的解剖组织，并丢弃。一个额外的30-60分钟后，将细胞将形成“砂桩”，因为它们变得脱离彼此（ 图4C）。
3。制备神经肌肉文化的
- 解冻的10毫升管的培养基和无菌条件下添加70微升ITS和35纳克/毫升，脑源性神经营养因子（Sigma公司B3795）。
- 标签和填写无菌的35 mm培养皿（世界精密仪器FD35-100）约一半的L-15培养基（解决方案（E）），每个胚胎解剖。
- 制作镀敷玻璃巴斯德吸管的每一端，而锥形部分保持在一个火焰通过抓住移液器。拉出的端部除了至约10厘米，然后折断端产生约0.2毫米的尖端。
- 使用电镀移液器吸“砂桩”来自一个胚胎的最小化的溶液的量绘制。上驱逐细胞培养皿的底部。板的细胞分成几行。观察镀敷未分化的细胞（ 图5A和图5B）。
- 发表镀细胞，静置至少15分钟的菜肴，让细胞附着的菜。
4。膜片钳神经肌肉突触
- 镀细胞培养12-24小时后，采取不同的形态特征：肌肉细胞变得纺锤状和脊髓神经元延伸很长的过程（ 图6）。可以确认，同时对电生理记录功能的突触神经轴突膨体和肌肉细胞之间的联系。 “M”，“S”和“V”分别指的平滑肌细胞，神经元胞体和突触前静脉曲张。
- 准备2块电极记录：突触前静脉曲张的肌肉细胞。
- 对于突触前电极，准备一个解决方案如下：两性霉素含含5毫克两性霉素B（适马A4888）至1.5 mL离心管中加入100μlDMSO。涡此溶液中10秒。接下来，添加10微升该溶液的第二微量离心管中，其中包含625微升ķ两性霉素B（溶液（小时））+内部 溶液。涡如上。
- 填充的突触前电极与两性霉素-含有K +步骤4.3中制备的内部溶液与K +-内部溶液（溶液（g））和突触后电极。
- 更换介质与NFR在培养皿中，并重新将其配有相衬光学倒置显微镜。
- 两个电极定位高于各自的目标。获取全细胞合作nfiguration与肌细胞的前穿孔修补程序配置的静脉曲张电极的电极。
- 以确认功能的突触，去极化静脉曲张膜片钳放大器（ 例如 Axopatch 200B中，Molecular Devices公司）在软件的控制下（ 例如，通过膜片钳pClamp 9，Molecular Devices公司）和观察的同时突触前和突触后电流。 图7示出了电流在突触前静脉曲张，以10 mV递增，从-30毫伏至+40 mV的去极化电压的步骤。在突触前细胞观察的内向电流进行由Na +和Ca 2 +和K +的外向电流。电流在突触后细胞是静脉曲张的神经递质释放的反应，主要是由Na +通过烟碱型乙酰胆碱受体通道。
Representative Results
图4B显示了一个孤立的脊髓/肌节立即移走后，从22 爪蟾胚胎。 图4C示出的阶段后，在Ca 2 +-Mg系2 +的溶液的皮肤去除和孵化（CMF，溶液（背视图c）条），细胞离解成一个“砂桩”，并准备好用于电镀。电镀后立即很少表现为培养基细胞形态变化（ 图5B），但不同的形状后二十四小时文化。肌肉细胞变成纺锤状，而神经元保持球形，而延伸的神经突起，与肌肉细胞突触的精心varicosites在（ 图6）。同时从突触前的静脉曲张和突触后肌细胞（ 图7）显示配对的膜片钳记录突触前抵港及离港的电流与神经递质的释放和resultaNT兴奋性突触后电流。
图1：A：繁殖对的青蛙交配屏幕桶之上。B：青蛙抱受精卵。
图2。答：“适合”的阶段，22胚B：“不适合”第28期胚胎。比例尺为1毫米。
图3：A：第一阶段前22胚胎卵黄膜和透明带的去除。箭头指向果冻外套的外边缘。卵黄膜紧贴的电磁制动哟，几乎是无形的。B：裸露的胚胎。比例尺为1毫米。
图4 A：22胚胎阶段用虚线表示被解剖的部分。B：急性分离的胚胎背侧部，“D”和“V”是指背部和腹部方面的胚胎，而“M”和“n”表示的mytomes和神经管的大约位置。C：“沙桩”的细胞60分钟后，在CMF。比例尺为 A，表示1毫米和0.5毫米，B和 C。
图5。A：细胞在培养后，立即电镀电源鉴于5倍。 B：40倍相同的文化。规模酒吧A，代表40微米和5微米B.
图6。识别的神经元胞体（S），突触前的静脉曲张（Ⅴ），和突触后的平滑肌细胞（M），在培养的神经肌肉接合。比例尺：5微米。
图7。突触前（顶部）和突触后电流（底部）见于响应于应用10 mV的电压增量步骤提交到从-30毫伏至40毫伏的突触前的静脉曲张。电压的步骤，表示旁边一些的突触前的痕迹。这两种细胞的潜力-70毫伏。
Discussion
成功的运动神经元和肌肉细胞共培养的关键步骤是使用适当的上演了从非洲爪蛙的人工繁殖胚胎的未分化脊柱神经细胞和成肌细胞，并仔细无菌解剖。受精卵应保持原状，直到他们达到约10级左右移动他们更快停止他们的发展。健康的胚胎，确定一个平滑的外观和棕色和白色斑驳的色素。第一阶段22日至24日的胚胎是最有用的，因为这是点后神经管闭合之前，在开发过程中的心肌细胞已分化显着。此外，从旧的胚胎细胞未能，在CMF分离。护理时，应采取删除，因为它牢固地粘附在胚胎的卵黄膜。被撕裂膜应使用锋利的镊子，使胚胎出现完整的。另一个重要的precaution是小心地将细胞在培养皿的底部（而不是让他们在那里定居）。这是首选方法，因为这增加的可能性，这些细胞将坚持培养皿中。
功能神经传导神经和肌肉之间可以就在突触后记录，并常可观察自发神经支配肌肉收缩后确定。联合国神经支配的肌肉细胞的不抽搐文化的。突触后记录单是有用的小终板电流或电位，但诱发发布的测量需要突触前和突触后电流的刺激，以及相关的需要双膜片钳记录。
这里描述的除了配对补丁的记录方法，该制剂提供了机会，介绍第三吸管在神经元的胞 体5，这使得动作电位的产生THAt可以传播到突触前的静脉曲张，导致神经递质的释放。此外，假定，被认为是介导或调节突触传递的代理可以被引入到两侧的突触：通过肌肉细胞移液管或通过扩散从三分之一的移液管，放置在苏摩。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
由美国国家科学基金会（0854551）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||
| Insulin-Transferrin-Selenium | Sigma | I1884 | |||||||||||||||
| Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG-10 | |||||||||||||||
| Vapor Pressure Osmometer | Wescor | 5100C | |||||||||||||||
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |||||||||||||||
| Amphotericin B | Sigma | A4888 | |||||||||||||||
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |||||||||||||||
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Table 1. |
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References
- Augustine, G. J., Eckert, R. Divalent cations differentially support transmitter release at the squid giant synapse. J. Physiol. 346, 257-271 (1984).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641 (1976).
- Weldon, P. R., Cohen, M. W. Development of synaptic ultrastructure at neuromuscular contacts in an amphibian cell culture system. J. Neurocytol. 8, 239-259 (1979).
- Tabti, N., Poo, M. -M. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, Massachusetts. 137-153 (1991).
- Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses. J. Neurosci. 17, 2990 (1997).
- DiGregorio, D. A., Peskoff, A., Vergara, J. L. Measurement of action potential-induced presynaptic calcium domains at a cultured neuromuscular junction. J. Neurosci. 19, 7846 (1999).
- Yazejian, B., Sun, X. P., Grinnell, A. D. Tracking presynaptic Ca2+ dynamics during neurotransmitter release with Ca2+-activated K+ channels. Nat. Neurosci. 3, 566 (2000).
- Sun, X. P., Chen, B. M., Sand, O., Kidokoro, Y., Grinnell, A. D. Depolarization-induced Ca2+ entry preferentially evokes release of large quanta in the developing Xenopus neuromuscular junction. J. Neurophysiol. 104 (5), 2730-2740 (2010).
- Xie, S. P., Poo, M. M. Initial events in the formation of neuromuscular synapse: rapid induction of acetylcholine release from embryonic neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7069 (1986).
- Li, P. P., Chen, C., Lee, C. W., Madhavan, R., Peng, H. B. Axonal filopodial asymmetry induced by synaptic target. Mol. Biol Cell. 22 (14), 2480-2490 (2011).
- Feng, Z., Ko, C. P. Schwann cells promote synaptogenesis at the neuromuscular junction via transforming growth factor-beta1. J. Neurosci. 28 (39), 9599-9609 (2008).
- Song, H. J., Ming, G. L., Poo, M. M. cAMP-induced switching in turning direction of nerve growth cones. Nature. 17 (6639), 275-279 (1997).
- Morimoto, T., Wang, X. H., Poo, M. M. Overexpression of synaptotagmin modulates short-term synaptic plasticity at developing neuromuscular junctions. Neuroscience. 82 (4), 969-978 (1998).
- Lu, B., Czernik, A. J., Popov, S., Wang, T., Poo, M. M., Greengard, P. Expression of synapsin I correlates with maturation of the neuromuscular synapse. Neuroscience. 74 (4), 1087-1097 (1996).
- Schaeffer, E., Alder, J., Greengard, P., Poo, M. M. Synapsin IIa accelerates functional development of neuromuscular synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (9), 3882-3886 (1994).
- Liou, J. C., Tsai, F. Z., Ho, S. Y. Potentiation of quantal secretion by insulin-like growth factor-1 at developing motoneurons in Xenopus cell culture. J. Physiol. 553 (Pt. 3), 719-7128 (2003).
- Peng, H. B., Yang, J. F., Dai, Z., Lee, C. W., Hung, H. W., Feng, Z. H., Ko, C. P. Differential effects of neurotrophins and schwann cell-derived signals on neuronal survival/growth and synaptogenesis. J. Neurosci. 23 (12), 5050-5060 (2003).
- Dan, Y., Poo, M. M. Hebbian depression of isolated neuromuscular synapses in vitro. Science. 12 (5063), 1570-1573 (1992).
- Xiao, Q., Xu, L., Spitzer, N. C. Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity. J. Neurosci. 30 (16), 5792-5801 (2010).
- Niewkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , North-Holland, Amsterdam. (1967).
