Summary
Denne video viser de procedurer, der anvendes til at vokse primære kulturer af embryonale
Abstract
Mange oplysninger om koblingen af præsynaptiske ionstrømme med frigivelsen af neurotransmitter er blevet opnået fra hvirvelløse præparater, især blæksprutte gigant synapse 1. Men bortset fra den, der er beskrevet her, få vertebrate præparater findes i hvilket det er muligt at foretage samtidige målinger af neurotransmitterfrigivelse og præsynaptiske ionstrømme. Embryoniske Xenopus motoneuroner og muskelceller kan dyrkes sammen på simpel dyrkningsmedium ved stuetemperatur, vil de danne funktionelle synapser inden for 12 til 24 timer, og kan anvendes til undersøgelse af nerve-og muskel celleudvikling og synaptiske interaktioner i flere dage (indtil tilgroning forekommer). Nogle af fordelene ved disse co-kulturer flere andre hvirveldyr præparater omfatter enkelhed fremstillingen, evnen til at opretholde kulturerne og arbejde ved stuetemperatur, og den lette adgang af synapserne dannede 2-4. Præparatet er blevet brugt i vid udstrækning til at studere de biofysiske egenskaber af præsynaptiske ionkanaler og regulering af transmitterfrigivelse 5-8. Endvidere er præparatet egnet sig til andre formål, herunder undersøgelse af neuritudvækst og synaptogenesen 9-12, molekylære mekanismer i neurotransmitterfrigivelse 13-15, hvilken rolle diffunderbare budbringere i neuromodulation 16,17, og in vitro-synaptisk plasticitet 18 - 19.
Protocol
1. Pre-eksperimentel Forberedelse
- Fremstille følgende opløsninger (se tabel 1 for sammensætninger): (a) 1 liter NFR (Normal Frog Ringer), (b) 100 ml 10% saltvand, (c) 100 ml CMF (Ca2 + / Mg2 +-fri opløsning ), (d) 1 ml ITS (insulin-transferrin-selen, Sigma I1884), (e) 100 ml L-15 dyrkningsmedium, (f) 10 ml HCG (humant choriongonadotropin Sigma CG-10), (g) 100 ml K +-intern opløsning, (h) 100 ml K +-intern opløsning Amphotericin B. Den osmotiske styrke af opløsning 1 bør kontrolleres for at sikre, at den er omtrent 260 mOsM under anvendelse af en damptryk osmometer (f.eks Wescor model # 5100C) .
- Filtrere sterilisere opløsninger (b) og (c). Opløsninger (a) (b) og (c) kan opbevares i op til tre måneder ved 4 ° C. Fremstille opløsningen (d) ved tilsætning af 1 ml deioniseret H2O til hætteglasset indeholdende den lyofiliserede pulver via en 25 gauge sprøjte nål og sprøjte filter. Denne endelige løsning cen opbevares ved 4 ° C i 30 dage.
- Fremstille opløsningen (e) i en laminar strømningshætte ved at kombinere alle komponenter i et bæger eller kolbe. Filtrere sterilisere den endelige opløsning og overfører 10 ml portioner i sterile centrifugerør. Opbevar ved -20 ° C.
- Forbered HCG (opløsning (f)) ved tilsætning af 10 ml deioniseret H 2 0 til hætteglasset indeholdende det lyofiliserede pulver via en 25 gauge sprøjte nål og sprøjte filter. Denne endelige opløsning kan opbevares ved 4 ° C i 30 dage.
- Fremstille mindst to mikrodissektions værktøjer ved at lime en Minutien pin (26002-10, Fine Science Tools) til enden af en glas Pasteur-pipette med cyanoacrylat-lim. Tillad den skarpe ende af nålen for at strække sig forbi enden af pipetten cirka 0,5 cm.
- To dage før forbereder kulturer, fremkalde avl med følgende procedure. Identificer en avl-ready par Xenopus ved at observere en fremtrædende, rødlig kloak på den kvindelige og mørk pigmentering på den plane surface af forpoterne af den mandlige. Én ad gangen, netto hver frø og hold den ventrale side nedad på en vask med nettet, så det ikke kan undslippe. Injiceres 1 ml opløsning (f) gennem nettet og subkutant i en af de dorsale lymfeknuder sække.
- Placer ynglende par sammen i en overdækket ti gallon tank med vand. For at sikre, at dyrene ikke vil trampe de nyligt fastsatte og befrugtede æg, installere et skærmet gulv med en maskestørrelse på ca ½ "monteret ca 1-2 inches over bunden af tanken (figur 1A).
- Lad frøer uforstyrret i 12-48 timer, indtil dyrene er i amplexus og befrugtede æg er observeret på gulvet under skærmen (figur 1B).
- Fjern dyrene fra tanken, men lad æggene uforstyrret i mindst 24 timer længere. Dette par frøer kan genbruges avlet efter seks uger.
- Løsne embryoner fra bunden af tanken og overføre dem til fire eller fem 60x15 mm culture skåle indeholdende 10% saltvand (opløsning b). Sorter de embryoner trin i henhold til ordningen med Niewkoop og Faber (ref. 20). Nyttige embryoer vil være dem i trin 22-24. Figur 2A viser et embryon på ca trin 22, mens figur 2B viser et foster, der er for langt i udviklingen at være nyttig (ca. trin 28). Det er vigtigt at vælge embryoner, der er sunde: dem, der er glat i udseende med lys brun og hvid marmorering er ideelle. Embryoner, der har store sorte eller hvide pletter er generelt usundt og ubrugelig.
2. Mikrodissektion af Xenopus embryoer
- Inde i en laminar strømningshætte, etiket og fyld cirka halvvejs tre 60x15 mm sterile dyrkningsskåle med 10% saltvand, og et med CMF.
- Anvendelse af en steril, glas Pasteur-pipette transfer 5-10 trin 22-24 embryoner i en af de skåle indeholdende 10% saltvand. Ved hjælp af en stereo zoom dissekereING mikroskop inde i emhætten (0,6-5x med 10 x okularer), fjern gelé frakke og vitellinmembranen fra hvert foster ved hjælp af to par sterile # 5 pincet (11.251-30, Fine Science Tools). (Se figur 3A og 3B.)
- Vask den nøgne embryoner ved at passere dem, en ad gangen, gennem de resterende to skåle på 10% saltvand og til sidst ind i skålen, der indeholder CMF. Brug en ny, steril pipette for hver overførsel og minimere mængden af opløsning overført fra fad til fad.
- Til gengæld embryonets hold forsigtigt, men fast med en pincet eller lignende, og ved hjælp af mikrodissektion værktøjet formet i trin 1.5, fjernes neuralrøret og tilhørende myotomes som er placeret i den mest dorsale side af dyret. Gør dette ved at tre skiver, en i hver ende af placeringen af neuralrøret og en tredje lige ventral til den (figur 4A). Flyt hver dissekeret neuralrøret / myotome til en ren del af skålen væk fra æggeblomme granules og andet affald (figur 4B). The dorsal-ventral-aksen, og placeringen af neuralrøret og myotomes er angivet i figur 4.
- Efter omkring femten minutter i denne løsning (CMF) bruge pincet til at løfte pigmenteret hud fri af dissekerede væv og kasseres. Efter yderligere 30-60 min, vil cellerne danne en "sand bunke", som de bliver adskilt fra hinanden (figur 4C).
3. Fremstilling af Nerve-muskel Co-kulturer
- Optø en 10 ml tube dyrkningsmedium og der tilsaettes aseptisk 70 pi ITS og 35 ng / ml BDNF (Sigma B3795).
- Etiket og fylde sterile 35 mm dyrkningsskåle (FD35-100 Verden Precision Instruments) omtrent halvvejs med L-15-kulturmedium (opløsning (e)), en for hver dissekeret embryo.
- Fremstille et plating pipette ved at gribe hver ende af en glas Pasteur-pipette, mens holder den tilspidsede del over en flamme. Træk enderne fra hinanden til cirka 10 cm og derefter bryde ud i slutningen for at give et tip på ca 0,2 mm.
- Brug plating pipette til at suge op "sand bunke" fra den ene embryon minimere mængden af trækkes opløsningen. Udvise cellerne på bunden af en dyrkningsskål. Plade cellerne til flere linjer. Observere belagte udifferentierede celler (figur 5A og 5B).
- Lad de retter af udpladede celler uforstyrret i mindst femten minutter, så cellerne tid til at knytte til fadet.
4. Patch Spændeværktøj Nerve-muskel synapser
- Efter 12-24 timer i kultur, tager udpladede celler på forskellige morfologiske karakteristika: muskelceller bliver spindel-formet og spinale neuroner strækker lange processer (figur 6). Funktionel synaptisk kontakt mellem neurit varicosities og muskelceller kan bekræftes med samtidige parrede elektrofysiologiske optagelser. "M", "S" og "V" omhandler henholdsvis muskel celle, neuronalsoma og præsynaptisk åreknudesyndromet.
- Fremstille to patch-elektroder til optagelse: en for den præsynaptiske varicosity og en til muskelceller.
- For den præsynaptiske elektrode, udarbejde en amphotericin-opløsning som følger: Tilsæt 100 pi DMSO til et 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 5 mg amphotericin B (Sigma A4888). Vortex denne opløsning i 10 sek. Dernæst tilsættes 10 ul af denne opløsning til et andet mikrocentrifugerør der indeholder 625 pi K +-intern opløsning Amphotericin B (opløsning (h)). Vortex som ovenfor.
- Fyld den præsynaptiske elektrode med amphotericin-holdige K +-intern opløsning fremstillet i trin 4.3 og den postsynaptiske elektrode med K +-intern opløsning (opløsning (g)).
- Udskiftning af medie i dyrkningsskålen med NFR og flytte det til et omvendt mikroskop forsynet med fasekontrastoptik.
- Anbring begge elektroder lige over deres respektive mål. Opnåelse af helcelle-configuration med muskelcelle elektroden inden den perforerede patch konfiguration med varicosity elektroden.
- For at bekræfte funktionaliteten af synapsen, depolarisere varicosity med en patch-clamp-forstærker (f.eks Axopatch 200B, Molecular Devices) under softwarekontrol (f.eks pCLAMP 9, Molecular Devices) og observere samtidige præsynaptiske og postsynaptiske strømme. Figur 7 viser set strømme som reaktion på depolariserende trin spænding givet til præsynaptiske varicosity i 10 mV trin fra -30 mV til +40 mV. For aktiv strømme set i præsynaptiske celle bæres af Na + og Ca2 +, og de ydre strømme af K +. Strømme optaget i den postsynaptiske celle er svar på neurotransmitter frigivet fra varicosity og bæres hovedsageligt af Na + med nikotine acetylcholin-receptor-kanaler.
Representative Results
Figur 4B viser den dorsale billede af en isoleret rygmarv / myotome umiddelbart efter fjernelse fra en fase 22 Xenopus embryo. Figur 4C viser, at efter huden fjernelse og inkubering i Ca2 +-Mg2 +-fri opløsning (CMF-opløsning ( c)), celler dissociere til en "sand bunke" og er klar til udpladning. Umiddelbart efter udpladning i dyrkningsmedium celler udviser ringe morfologisk variation (fig. 5B), men antage forskellige former efter 24 timer i kultur. Muskelceller bliver spindel-formet, mens neuroner stadig sfæriske og udvider neuritter at udarbejde varicosites ved synapser med muskelceller (figur 6). Samtidig parret patch optagelse fra den præsynaptiske varicosity og postsynaptiske muskel celle (fig. 7) afslører de præsynaptiske indad og udad strømme i forbindelse med frigivelsen af neurotransmitter og resultant excitatoriske postsynaptiske strømme.
Figur 1 A:.. Breeding par frøer i parring spand på toppen skærm B: Frogs i amplexus med befrugtede æg.
Figur 2 A:.. "Egnede" trin 22 embryo B: "uegnet" fase 28 embryo. Scale bar betegner 1 mm.
Figur 3 A:. Stage 22 embryo før fjernelse af vitellinmembranen og gelé pels. Pilen peger på den yderste kant af gelé pels. Vitellinmembranen klæber tæt til Bryo og er næsten usynlig B:. Bare foster. Scale bar betegner 1 mm.
Figur 4 A: Stage 22 embryo med en stiplet linje angiver til-være dissekeret portion B:.. Akut isoleret dorsale del af embryon; "d" og "v" henviser til de dorsale og ventrale aspekter af embryoner, mens "m" og "n" angiver de omtrentlige placeringer af mytomes og neuralrørsdefekter C:. "Sand bunke" af celler efter 60 min i CMF. Scale bar repræsenterer 1 mm for A, og 0,5 mm for B og C.
Figur 5 A:. 5x power baggrund af celler i kultur umiddelbart efter udpladning. B: Samme kultur på 40x. Scalesøjle repræsenterer 40 um for A, og 5 um til B.
Figur 6. Neuromuskulære forbindelse i kultur med identifikation af neuronal soma (S), præsynaptisk varicosity (V), og postsynaptiske muskelceller (M). Målestok: 5 um.
Figur 7. Præsynaptisk (øverst) og postsynaptiske (bund) strømme ses som reaktion på anvendelse af 10 mV trinvis spændingstrin præsenteret for præsynaptiske varicosity fra -30 mV til +40 mV. Spændingstrin er angivet ved siden af nogle af de præsynaptiske spor. Den holdepotentiale for begge celler var -70 mV.
Discussion
Vigtige skridt i den vellykkede co-dyrkning af motoneuroner og muskelceller er anvendelse af passende iscenesat embryoner produceret fra den inducerede opdræt af Xenopus frøer, og den omhyggelige aseptisk dissektion af de udifferentierede neuroner i rygmarven og myoblaster. Befrugtede æg bør overlades uforstyrret, indtil de tilnærmelsesvis nå fase 10 eller så som at flytte dem før ofte standser deres udvikling. Sunde fostre er identificeret ved et glat udseende og en brun og hvid meleret farve. Stage 22-24 embryoer er de mest nyttige, fordi dette er det punkt i udviklingen lige efter de neurale rør lukket og før myocytterne er differentieret betydeligt. Desuden undlader celler fra ældre fostre at dissociere godt i CMF. Der bør udvises omhu ved fjernelse af ægmembran som det klæber stærkt til embryoet. Membranen skal rives fra hinanden ved hjælp af skarpe tang, således at embryonet opstår intakt. Et andet vigtigt precaution er omhyggeligt at placere celler på bunden af dyrkningsskålen (i stedet for at lade dem slå sig ned). Denne fremgangsmåde foretrækkes, da dette forøger sandsynligheden for, at cellerne vil klæbe til dyrkningsskålen.
Funktionel neurotransmission mellem nerve og muskel kan bestemmes med blot postsynaptisk optagelse og ofte kan konstateres ved observation af spontan muskel sammentrækning efter innervation. Un-innerverede muskelceller ikke spjæt i kultur. Postsynaptiske optagelse alene er nyttig til optagelse miniature endepladen strømme eller potentialer, men målinger af fremkaldte frigivelse kræver præsynaptiske stimulering, og korrelation af præ-og postsynaptiske strømme kræver dobbelt patch-clamp.
Udover parret-patch optagelse beskrevet her, tilbyder dette præparat mulighed for at indføre en tredje pipette på den neuronale soma 5 Dette tillader generation af en handling potentiale that kan forplante sig til den præsynaptiske varicosity og føre til frigivelsen af neurotransmitter. Desuden kan putative midler, der menes at mediere eller modulere synaptisk transmission indføres til hver side af synapsen: via muskelceller pipette eller ved diffusion fra en tredje pipette anbragt på soma.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Finansieret af NSF (0.854.551).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||
| Insulin-Transferrin-Selenium | Sigma | I1884 | |||||||||||||||
| Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG-10 | |||||||||||||||
| Vapor Pressure Osmometer | Wescor | 5100C | |||||||||||||||
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |||||||||||||||
| Amphotericin B | Sigma | A4888 | |||||||||||||||
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |||||||||||||||
|
|||||||||||||||||
Table 1. |
|||||||||||||||||
References
- Augustine, G. J., Eckert, R. Divalent cations differentially support transmitter release at the squid giant synapse. J. Physiol. 346, 257-271 (1984).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641 (1976).
- Weldon, P. R., Cohen, M. W. Development of synaptic ultrastructure at neuromuscular contacts in an amphibian cell culture system. J. Neurocytol. 8, 239-259 (1979).
- Tabti, N., Poo, M. -M. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, Massachusetts. 137-153 (1991).
- Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses. J. Neurosci. 17, 2990 (1997).
- DiGregorio, D. A., Peskoff, A., Vergara, J. L. Measurement of action potential-induced presynaptic calcium domains at a cultured neuromuscular junction. J. Neurosci. 19, 7846 (1999).
- Yazejian, B., Sun, X. P., Grinnell, A. D. Tracking presynaptic Ca2+ dynamics during neurotransmitter release with Ca2+-activated K+ channels. Nat. Neurosci. 3, 566 (2000).
- Sun, X. P., Chen, B. M., Sand, O., Kidokoro, Y., Grinnell, A. D. Depolarization-induced Ca2+ entry preferentially evokes release of large quanta in the developing Xenopus neuromuscular junction. J. Neurophysiol. 104 (5), 2730-2740 (2010).
- Xie, S. P., Poo, M. M. Initial events in the formation of neuromuscular synapse: rapid induction of acetylcholine release from embryonic neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7069 (1986).
- Li, P. P., Chen, C., Lee, C. W., Madhavan, R., Peng, H. B. Axonal filopodial asymmetry induced by synaptic target. Mol. Biol Cell. 22 (14), 2480-2490 (2011).
- Feng, Z., Ko, C. P. Schwann cells promote synaptogenesis at the neuromuscular junction via transforming growth factor-beta1. J. Neurosci. 28 (39), 9599-9609 (2008).
- Song, H. J., Ming, G. L., Poo, M. M. cAMP-induced switching in turning direction of nerve growth cones. Nature. 17 (6639), 275-279 (1997).
- Morimoto, T., Wang, X. H., Poo, M. M. Overexpression of synaptotagmin modulates short-term synaptic plasticity at developing neuromuscular junctions. Neuroscience. 82 (4), 969-978 (1998).
- Lu, B., Czernik, A. J., Popov, S., Wang, T., Poo, M. M., Greengard, P. Expression of synapsin I correlates with maturation of the neuromuscular synapse. Neuroscience. 74 (4), 1087-1097 (1996).
- Schaeffer, E., Alder, J., Greengard, P., Poo, M. M. Synapsin IIa accelerates functional development of neuromuscular synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (9), 3882-3886 (1994).
- Liou, J. C., Tsai, F. Z., Ho, S. Y. Potentiation of quantal secretion by insulin-like growth factor-1 at developing motoneurons in Xenopus cell culture. J. Physiol. 553 (Pt. 3), 719-7128 (2003).
- Peng, H. B., Yang, J. F., Dai, Z., Lee, C. W., Hung, H. W., Feng, Z. H., Ko, C. P. Differential effects of neurotrophins and schwann cell-derived signals on neuronal survival/growth and synaptogenesis. J. Neurosci. 23 (12), 5050-5060 (2003).
- Dan, Y., Poo, M. M. Hebbian depression of isolated neuromuscular synapses in vitro. Science. 12 (5063), 1570-1573 (1992).
- Xiao, Q., Xu, L., Spitzer, N. C. Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity. J. Neurosci. 30 (16), 5792-5801 (2010).
- Niewkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , North-Holland, Amsterdam. (1967).
