Summary
סרטון זה מדגים את הנהלים משמשים לגידול תרביות ראשוניות של עוברי
Abstract
מידע רב על הצימוד של זרמים יוניים presynaptic עם שחרורו של הנוירוטרנסמיטר הושג מהכנות חסרות חוליות, בעיקר התמנון הענקי 1 סינפסה. עם זאת, מלבד ההכנה שתוארה כאן, כמה הכנות חוליות קיימות בו ניתן לבצע מדידות בו זמניות של שחרור הנוירוטרנסמיטר וזרמים יוניים presynaptic. תאי עצב אחראים עובריים Xenopus ותאי שריר ניתן לגדל ביחד במדיום התרבות פשוט בטמפרטורת חדר, הם יהוו סינפסות פונקציונליות בתוך 12-24 שעות, והוא יכולים לשמש כדי לחקור עצב ופיתוח תאי שריר ואינטראקציות הסינפטי במשך כמה ימים (עד יתר מתרחש). יתרונות מסוימים של עמיתים לתרבויות אלה סביב הכנות חוליות אחרות כוללים את הפשטות של הכנה, את היכולת לשמור על התרבויות והעבודה בטמפרטורת חדר, ונגישות המוכנה של הסינפסות נוצרת 2-4. ההכנה כבר בשימוש נרחב כדי ללמוד את מאפייני biophysical של תעלות יונים presynaptic והרגולציה של שחרור משדר 5-8. בנוסף, ההכנה הלוותה עצמו לשימושים אחרים, כולל מחקר של התולדה וsynaptogenesis neurite 9-12, מנגנונים מולקולריים של הנוירוטרנסמיטר שחרור 13-15, התפקיד של שליחי diffusible בneuromodulation 16,17, ובפלסטיות הסינפטית מבחנה 18 - 19.
Protocol
1. הכנה שלפני הניסוי
- הכן את הפתרונים הבאים (ראה טבלה 1 ליצירות): (א) NFR 1 ליטר (רינגר צפרדע הרגיל), (ב) מי מלח 100 מ"ל, 10% (ג) 100 המ"ל CMF (Ca 2 + / Mg 2 פתרון +-חופשי ), (ד) 1 המ"ל שלו (אינסולין transferrin-סלניום, I1884 סיגמא), (ה) 100 מיליליטר מדיום L-15 תרבות, (ו) 10 מיליליטר HCG (גונדוטרופין כוריוני האנושי סיגמא CG-10), (ז) 100 מיליליטר K פתרון +-פנימי, (ח) 100 המ"ל K +-פתרון הפנימי לAmphotericin B. הכח האוסמוטי של פתרון 1 צריך להיבדק כדי לוודא שהוא כ 260 mOsM באמצעות osmometer לחץ אדים (למשל מודל Wescor # 5100C שברשות) .
- סנן לעקר פתרונות (ב) ו (ג). פתרונות (א) (ב) ו (ג) ניתן לאחסן עד שלושה חודשים ב 4 ° C. להכין תמיסה (ד) על ידי הוספת 1 מיליליטר H 2 O deionized לבקבוקון המכיל אבקת lyophilized באמצעות מחט 25 מד מזרק ומסנן מזרק. זה פתרון סופי גניתן לאחסן ב 4 ° C למשך 30 ימים.
- להכין תמיסה (ה) במכסת מנוע זרימה למינרית על ידי שילוב של כל הרכיבים בכוס או בקבוק. סנן לעקר את הפתרון הסופי ולהעביר 10 aliquots מ"ל לתוך צינורות צנטריפוגות סטריליים. חנות ב -20 ° C.
- הכן (הפתרון (ו)) HCG ידי הוספת 10 מ"ל deionized H 2 0 לבקבוקון המכיל אבקת lyophilized באמצעות מחט 25 מד מזרק ומסנן מזרק. פתרון סופי זה ניתן לאחסן ב 4 ° C למשך 30 ימים.
- לפברק לפחות שני כלי microdissection ידי הדבקת סיכת Minutien (26002-10, כלי מדע פיין) לסוף הכוס פסטר פיפטה עם דבק cyanoacrylate. לאפשר את הקצה החד של הסיכה להאריך מעבר לקצה פיפטה כ 0.5 סנטימטר.
- ימים לפני הכנת תרבויות, לגרום לגידול בהליך הבא. זהה את זוג הורים מוכן של Xenopus ידי התבוננות ביב בולט, אדמדם בפיגמנטציה כהה והנקבה בsu מישורייםrface מכפותיו הקדמיות של הזכר. אחד ובזמן, בניכוי כל צפרדע להחזיק אותו צד גחון על כיור ברשת, כך שהוא לא יכול לברוח. מזריק 1 מ"ל של פתרון (ו) דרך הרשת ומתחת לעור לתוך אחד מצקי הלימפה הגב.
- הנח את זוג ההורים יחד בטנק גלון מכוסה 10 של מים. כדי להבטיח שבעלי החיים לא ירמסו את הביצים שמטילות חדשה ומופרות, התקנת רצפה מרושתת עם גודל רשת של כ ½ "כ 1-2 סנטימטרים מצוידים מעל תחתית המכל (איור 1 א).
- השאר צפרדעים באין מפריעים במשך 12-48 שעות עד שבעלי החיים הם בamplexus וביצים מופרות הם נצפו על הרצפה מתחת למסך (1B איור).
- הסר את בעלי החיים מהטנק, אבל משאיר את הביצים באין מפריעות במשך לפחות 24 שעות ארוכות יותר. זה זוג צפרדעים ניתן מחדש התרבה לאחר שישה שבועות.
- שחרר את העוברים מתחתית המכל ולהעבירם לפולחן ארבעה או חמישה מ"מ 60x15מאכלים המכילים יור מלוח 10% (פתרון ב). מיין את העוברים בשלב בהתאם לתכנית של Niewkoop ופייבר (אסמכתא 20). עוברים שימושיים יהיו אלה בשלב 22-24. 2A האיור מראה עובר בשלב 22 תוך כ 2B האיור מראה עובר כי הוא רחוק מדי יחד בפיתוח כדי להיות שימושי (כ שלב 28). חשוב לבחור עוברים שאינם בריאים: אלה שהם חלקים במראה בגוון החום בהירים ומנומר לבנים הם אידיאליים. עוברים שכתמים שחורים או לבנים גדולים הם בדרך כלל לא בריאים ולא תקינים.
2. Microdissection של עוברי Xenopus
- בתוך מינרית זרימת מכסה מנוע, תווית ולמלא כשלוש 60x15 אמצע מנות מ"מ סטריליים תרבות עם תמיסת מלח 10%, ואחת עם CMF.
- שימוש, העברת סטרילי זכוכית פיפטה פסטר 09:55 שלב 22-24 עוברים לאחד המאכלים המכילים תמיסת מלח 10%. בעזרת זום סטריאו לנתחמיקרוסקופ ing בתוך מכסה המנוע (0.6-5x עם 10 עיניים x), להסיר את מעייל הריבה וקרום vitelline מכל עובר באמצעות שני זוגות מלקחיים סטריליים # 5 (11251-30, כלי מדע פיין). (ראה 3A ו 3 מספרים.)
- שטוף את העוברים החשופים על ידי עובר אותם, אחד בכל פעם, באמצעות שתי המנות הנותרות של תמיסת מלח 10% ולבסוף לתוך הקערה ובי CMF. השתמש פיפטה חדשה, סטרילית עבור כל העברה ולמזער את עוצמת הקול של פתרון הועבר ממנה למנה.
- בתורו, החזק כל עובר בעדינות אך בתקיפות עם זוג מלקחיים ו, באמצעות כלי microdissection עצב בשלב 1.5, להסיר את הצינור העצבי וmyotomes קשורים אשר ממוקם בהיבט הגבי ביותר של בעלי החיים. עשה זאת על ידי ביצוע שלוש פרוסות, אחד בכל צד של המיקום של הצינור העצבי ושליש רק גחון אליו (איור 4 א). העבר כל צינור עצבי גזור / myotome לחלק נקי של המנה מהחלמון granules ופסולת אחרת (איור 4 ב). הציר הגבה-הגחון, ואת המיקומים של הצינור העצבי וmyotomes מסומנים באיור 4.
- לאחר כ 15 דקות בפתרון זה (CMF) מלקחי שימוש כדי להרים את העור ללא פיגמנט הרקמה הגזורה וזורקים. לאחר 30-60 דקות נוספות, התאים יהוו "ערימת חול" כפי שהם היינו מנותקים אחד מהשני (4C איור).
3. הכנת עצבי שרירי Co-תרבויות
- הפשר שפופרת 10 מ"ל של מדיום התרבות והסביבה נקיה מחיידקים להוסיף 70 μl ו35 ng / ml-BDNF (סיגמא B3795).
- תווית ולמלא 35 מנות מ"מ סטריליים תרבות (FD35-100 מכשירי Precision העולם) בערך באמצע עם מדיום L-15 תרבות (פתרון (ה)), אחד עבור כל עובר הגזור.
- לפברק פיפטה ציפוי ידי אחיזה כל קצה של זכוכית פיפטה פסטר תוך החזקת החלק המחודד מעל להבה. לפרק את הקצוות לכ 10 סנטימטר ואז לשבור את הקצה להניב קצה של כ -0.2 מ"מ.
- השתמש פיפטה הציפוי להתחנף "ערימת החול" שעובר אחד מהפחתת כמות הפתרון נמשכת. לגרש את התאים על תחתית צלחת תרבות. פלייט את התאים לכמה שורות. שים לב לא עברו התמיינות תאים מצופים (האיור 5A ו5B).
- להשאיר את הכלים של תאי ציפוי ללא הפרעה במשך לפחות 15 דקות כדי לאפשר זמן התאים לצרף לתבשיל.
4. סינפסות clamping תיקון עצבי שרירים
- לאחר 12-24 שעות בתרבות, תאי ציפוי לקחת על מאפיינים מורפולוגיים שונים: תאי שריר הופכים דמויים כישור והנוירונים שדרה להרחיב את תהליכים ארוכים (איור 6). קשר הסינפטי תפקודי בין varicosities neurite ותאי שריר יכול להיות מאושר עם הקלטות אלקטרו סימולטניים לזווג. "ז", "S" ו "V" מתייחסים בהתאמה לתאי השריר, תאי עצבהסומא וvaricosity סינפטי.
- הכן שתי אלקטרודות תיקון להקלטה: אחד עבור varicosity presynaptic ואחד לתא השריר.
- על האלקטרודה presynaptic, להכין פתרון amphotericin המכיל כדלקמן: הוסף DMSO μl 100 לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל המכיל 5 מ"ג amphotericin B (סיגמה A4888). מערבולת פתרון זה עבור 10 שניות. לאחר מכן, להוסיף 10 μl של פתרון זה לצינור microcentrifuge שני המכיל 625 K +-μl פתרון הפנימי לAmphotericin B (פתרון (ח)). מערבולת כאמורה לעיל.
- מלא את האלקטרודה מראש הסינפטית עם K amphotericin המכיל פתרון +-פנימי שהוכן בשלב 4.3 והאלקטרודה פוסט סינפטי עם פתרון K +-פנימי (פתרון (ז)).
- החלף תקשורת במנת התרבות עם NFR ולהעביר אותו למיקרוסקופ ההפוך מצוידים באופטיקה לעומת השלב.
- מקם את שתי האלקטרודות בדיוק מעל היעדים שלהם. השג את השיתוף כל התאnfiguration עם אלקטרודה תא השריר לפני תצורת התיקון המחוררת עם אלקטרודה varicosity.
- כדי לאשר את הפונקציונליות של סינפסה, depolarize varicosity עם מגבר מהדק תיקון (למשל Axopatch 200B, התקנים מולקולריים) תחת שליטת תוכנה (למשל על ידי 9 pCLAMP, התקנים מולקולריים) ולבחון את זרמי presynaptic וpostsynaptic בו זמנית. איור 7 מציג את הזרמים ראו בתגובה לצעדי depolarizing של מתח הניתנים לvaricosity presynaptic בהפרשים קבועים של 10 MV מ-30 mV ל40 mV. הזרמים פנימה ראו בתא presynaptic מתבצעים על ידי Na + ו Ca 2 + והזרמים החיצוניים על ידי + K. זרמים שנרשמו בתא postsynaptic הם תגובות לנוירוטרנסמיטר שוחרר מvaricosity ומתבצעים בעיקר על ידי + Na בערוצי הקולטן אצטילכולין ניאציניות.
Representative Results
האיור 4B מראה נוף הגבי של חוט שדרה / myotome מבודד מייד לאחר הסרתו משלב 22 Xenopus העובר 4C. איור מראה כי, לאחר הסרת עור ודגירה בCa 2 +-Mg 2 +-פתרון חופשי (CMF, פתרון ( ג)), תאי לנתק ל" ערימת חול "והם מוכנים לציפוי. מייד לאחר ציפוי לתאים בינוניים התרבות יפגין שונות מורפולוגית קטנות (איור 5 ב), אבל קח בצורות שונות לאחר עשרים וארבעה שעות בתרבות. תאי שריר הופכים בצורת הציר זמן שנוירונים יישארו כדוריים תוך neurites הארכה שvaricosites המשוכלל בסינפסות עם תאי שריר (איור 6). הקלטת סימולטני לזווג תיקון מvaricosity סינפטי ותא השריר סינפטי (איור 7) חושפת את הזרמים פנימה והחוצה presynaptic קשורים בשחרור של נוירוטרנסמיטר וresultant מעורר זרמי postsynaptic.
איור 1:.. זוג רבייה של צפרדעים בדלי הזדווגות על גבי מסך ב ': צפרדעים בamplexus עם ביצים מופרות.
איור 2:.. שלב "מתאים" 22 עובר B: שלב "לא מתאים" 28 עובר. סרגל קנה מידה מייצג 1 מ"מ.
איור 3: 22. עובר שלב לפני הסרת vitelline הקרום ומעייל ריבה. החץ מצביע על הקצה החיצוני של מעייל הריבה. קרום vitelline שומר באופן הדוק לembrיו והוא כמעט בלתי נראה ב ':. עובר חשוף. סרגל קנה מידה מייצג 1 מ"מ.
איור 4: 22 עובר במה עם קו מקווקו מציין לביתור חלק ב ':.. חלק הגבה מבודד חריפות של עובר; "ד" ו "V" מתייחסים להיבטי הגב וגחון של העוברים, ואילו "מ" ו" n "מציין את המיקום המשוער של mytomes והצינור עצבי C:." ערימת חול "של תאים לאחר 60 דקות בCMF. סרגל קנה מידה מייצג 1 מ"מ ול0.5 מ"מ לB ו-C.
איור 5:. נוף 5x כוח של תאים בתרבית מייד לאחר ציפוי. ב ': את התרבות ב40X. סולםבר מייצג 40 מיקרומטר ול5 מיקרומטר לB.
איור 6. צומת Neuromuscular בתרבות עם זיהוי של סומה העצבית (S), varicosity presynaptic (V), ותא השריר postsynaptic (M). סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר.
איור 7. זרמי presynaptic (למעלה) וpostsynaptic (תחתון) ראו בתגובה לבקשה של מתח 10 mV מצטבר צעדים שהוצגו לvaricosity presynaptic מ-30 mV ל40 mV. צעדי מתח מופיעים לצד כמה מעקבות presynaptic. הפוטנציאל מחזיק עבור שני התאים היה -70 mV.
Discussion
שלבים עיקריים בשיתוף culturing המוצלח של תאי עצב אחראים ותאי שריר הנם שימוש במבוים עוברים נוצרים מהגידול המושרה של צפרדעי Xenopus כראוי, ונתיחה האספטי המדוקדקת של נוירונים בעמוד השדרה עברו התמיינות וmyoblasts. ביצים מופרות יש להשאירו כפי שעד שהם יגיעו לכ לביים 10 או כדי להעביר אותם במוקדם לעתים קרובות עוצר את התפתחותם. עוברים בריאים מזוהים במראה חלק וחום וצביעה מנומרת לבנה. 22-24 עוברי שלב הם שימושיים ביותר, כי זו היא הנקודה במהלך פיתוח רק לאחר סגירת הצינור העצבית ולפני myocytes שהבדיל באופן משמעותי. בנוסף, תאים מעוברים מבוגרים לא מצליחין לנתק גם בCMF. יש להקפיד בעת הסרת קרום vitelline כפי שהוא שומר מאוד לעובר. הקרום צריך לקרוע באמצעות מלקחיים חדים כך שהעובר יוצא ללא פגע. נוסף precautio החשובn הוא למקם את התאים בזהירות על תחתית צלחת התרבות (ולא לתת להם להתיישב שם). זוהי השיטה מועדפת כמו זה מגדיל את הסיכוי שהתאים ידבקו במנת התרבות.
עצבי תפקודית בין העצב ושריר ניתן לקבוע עם הקלטה פשוט postsynaptic ולעתים קרובות ניתן לקביעה על ידי התצפית של התכווצות שרירים ספונטנית לאחר עצבוב. תאי שריר בלתי innervated לא מפרפרים בתרבות. הקלטת postsynaptic לבד שימושית עבור הקלטת זרמים זעירים endplate או פוטנציאלים, אך מדידות של שחרור עורר דורשות גירוי סינפטי, ומתאם של זרמים לפני וpostsynaptic דורש תיקון-מהדק כפול.
מלבד שיטת ההקלטה לזווג-תיקון המתואר כאן, ההכנה הזאת מציעה את ההזדמנות להציג את פיפטה שלישית בסומה העצבית 5 זה מאפשר את הדור של פוטנציאל פעולה thaלא יכול להפיץ לvaricosity presynaptic ולהוביל לשחרור של נוירוטרנסמיטר. בנוסף, סוכנים משוערים, כי הם חשבו שיתווכו או לווסת את ההעברה הסינפטית יכולים להיות הציגו את שני צדי סינפסה: באמצעות פיפטה תא השריר או באמצעות דיפוזיה מפיפטה 3 הוצבה בסומה.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
ממומן על ידי NSF (0854551).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||
| Insulin-Transferrin-Selenium | Sigma | I1884 | |||||||||||||||
| Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG-10 | |||||||||||||||
| Vapor Pressure Osmometer | Wescor | 5100C | |||||||||||||||
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |||||||||||||||
| Amphotericin B | Sigma | A4888 | |||||||||||||||
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |||||||||||||||
|
|||||||||||||||||
Table 1. |
|||||||||||||||||
References
- Augustine, G. J., Eckert, R. Divalent cations differentially support transmitter release at the squid giant synapse. J. Physiol. 346, 257-271 (1984).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641 (1976).
- Weldon, P. R., Cohen, M. W. Development of synaptic ultrastructure at neuromuscular contacts in an amphibian cell culture system. J. Neurocytol. 8, 239-259 (1979).
- Tabti, N., Poo, M. -M. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, Massachusetts. 137-153 (1991).
- Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses. J. Neurosci. 17, 2990 (1997).
- DiGregorio, D. A., Peskoff, A., Vergara, J. L. Measurement of action potential-induced presynaptic calcium domains at a cultured neuromuscular junction. J. Neurosci. 19, 7846 (1999).
- Yazejian, B., Sun, X. P., Grinnell, A. D. Tracking presynaptic Ca2+ dynamics during neurotransmitter release with Ca2+-activated K+ channels. Nat. Neurosci. 3, 566 (2000).
- Sun, X. P., Chen, B. M., Sand, O., Kidokoro, Y., Grinnell, A. D. Depolarization-induced Ca2+ entry preferentially evokes release of large quanta in the developing Xenopus neuromuscular junction. J. Neurophysiol. 104 (5), 2730-2740 (2010).
- Xie, S. P., Poo, M. M. Initial events in the formation of neuromuscular synapse: rapid induction of acetylcholine release from embryonic neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7069 (1986).
- Li, P. P., Chen, C., Lee, C. W., Madhavan, R., Peng, H. B. Axonal filopodial asymmetry induced by synaptic target. Mol. Biol Cell. 22 (14), 2480-2490 (2011).
- Feng, Z., Ko, C. P. Schwann cells promote synaptogenesis at the neuromuscular junction via transforming growth factor-beta1. J. Neurosci. 28 (39), 9599-9609 (2008).
- Song, H. J., Ming, G. L., Poo, M. M. cAMP-induced switching in turning direction of nerve growth cones. Nature. 17 (6639), 275-279 (1997).
- Morimoto, T., Wang, X. H., Poo, M. M. Overexpression of synaptotagmin modulates short-term synaptic plasticity at developing neuromuscular junctions. Neuroscience. 82 (4), 969-978 (1998).
- Lu, B., Czernik, A. J., Popov, S., Wang, T., Poo, M. M., Greengard, P. Expression of synapsin I correlates with maturation of the neuromuscular synapse. Neuroscience. 74 (4), 1087-1097 (1996).
- Schaeffer, E., Alder, J., Greengard, P., Poo, M. M. Synapsin IIa accelerates functional development of neuromuscular synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (9), 3882-3886 (1994).
- Liou, J. C., Tsai, F. Z., Ho, S. Y. Potentiation of quantal secretion by insulin-like growth factor-1 at developing motoneurons in Xenopus cell culture. J. Physiol. 553 (Pt. 3), 719-7128 (2003).
- Peng, H. B., Yang, J. F., Dai, Z., Lee, C. W., Hung, H. W., Feng, Z. H., Ko, C. P. Differential effects of neurotrophins and schwann cell-derived signals on neuronal survival/growth and synaptogenesis. J. Neurosci. 23 (12), 5050-5060 (2003).
- Dan, Y., Poo, M. M. Hebbian depression of isolated neuromuscular synapses in vitro. Science. 12 (5063), 1570-1573 (1992).
- Xiao, Q., Xu, L., Spitzer, N. C. Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity. J. Neurosci. 30 (16), 5792-5801 (2010).
- Niewkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , North-Holland, Amsterdam. (1967).
