Summary
이 동영상은 배아의 주 문화를 성장하는 데 사용되는 절차를 설명합니다
Abstract
신경 전달 물질의 방출과 presynaptic 이온 전류의 커플 링에 대한 많은 정보는 특히 invertebrate 준비, 오징어 거대한 시냅스 1 일부터 취득했습니다. 그러나, 준비를 제외하고 여기에 설명 된, 몇 가지 척추의 준비는 신경 전달 물질 자료와 presynaptic 이온 전류의 동시 측정을 할 수 있습니다있는 존재합니다. (때까지 12-24시간 내에 기능 시냅스를 형성하고, 며칠 동안 신경과 근육 세포 개발과 신경의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수있는, 배아 Xenopus의 motoneurons와 근육 세포는 실온에서 간단한 문화 매체에서 함께 성장하실 수 있습니다 전면에 자라 난)가 발생합니다. 다른 척추 동물의 준비 이상이 공동 문화의 장점은 준비의 단순함, 상온에서 문화와 작업을 유지 할 수있는 능력, 2를 형성 시냅스의 준비 접근성을 포함-4. 준비는 presynaptic 이온 채널과 송신기 릴리스 5-8의 규정에의 biophysical 속성을 공부하고 널리 사용되었습니다. 또한, 준비는 9-12 neurite 가지와 synaptogenesis 연구, 신경 전달 물질 릴리스 13-15, neuromodulation 16,17의 diffusible 메신저의 역할의 분자 메커니즘, 그리고 체외 신경 소성 18 등 다른 용도로 자신을 빌려하고 있습니다 - 19.
Protocol
1. 사전 실험 준비
- 다음과 같은 솔루션을 (작품에 대한 표 1 참조) 준비 : () 1리터의 NFR (일반 개구리 벨소리), (B) 100 ML 10 % 염분, (C) 100 ML CMF (CA 2 + / MG 2 + - 무료 솔루션 ), (D) 1 ML ITS (인슐린 - 트랜스페린 - 셀레늄, 시그마 I1884), (E) 100 ML L-15 배양액 (F) 10 ML HCG (인간 chorionic 생식샘 자극 호르몬 시그마 CG-10), (g)는 100 ML K + - 내부 솔루션, 솔루션 1의 삼투 강도가 그 증기 압력 osmometer (예를 들면 Wescor 모델 # 5100C)를 사용하여 약 260 mOsM되어 있는지 확인하기 위해 확인해야 Amphotericin B.에 대한 (H) 100 ML K +-내부 솔루션 .
- (B) 솔루션을 소독 필터링 및 (c). 솔루션 (A) (B)하며 (C) 4 ° C. 3 개월까지 저장할 수 있습니다 25 게이지 주사기 바늘과 주사기 필터를 통해 동결 건조 분말이 들어있는 유리 병에 1 ML deionized H 2 O를 추가하여 솔루션 (D)를 준비합니다. 이 최종 해결책 'C30 일 동안 4 ° C에 보관.
- 비커 나 플라스크에있는 모든 구성 요소를 결합하여 층류 후드에 솔루션 (전자)를 준비합니다. 최종 솔루션을 소독하고 멸균 원심 분리기 튜브에 10 ML aliquots을 전송 필터링 할 수 있습니다. -20 ° C.에 저장
- 25 게이지 주사기 바늘과 주사기 필터를 통해 동결 건조 분말이 들어있는 유리 병에 H 2 0을 deionized 10 ML을 추가하여 HCG (솔루션 (F)) 준비합니다. 이 최종 솔루션은 30 일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 접착 시아 노 아세틸렌 접착제와 유리 파스퇴르 피펫의 끝 부분에 Minutien 핀 (26002-10 좋아, 과학 도구)에 의해 적어도 두 개의 microdissection 도구를 제조. 피펫 약 0.5 cm의 끝을 지났 확장하는 핀의 날카로운 끝을 허용합니다.
- 준비 문화 이틀전 일 다음 절차 번식을 유도. 평면 스와의 여성과 검게 착색되어 눈에 잘 띄는, 붉은 배설강을 관찰하여 Xenopus의 번식 - 준비 쌍을 식별남성의 전면 발 rface. 이 탈출 할 수 있도록 시간 순 각 개구리 하나는은 그물과 싱크에 복부 측면을 누른 상태로 유지합니다. 등쪽의 림프 주머니의 그물과 피하에 하나를 통해 솔루션 1 ML (F)를 주입.
- 물을 대상 십갤런 탱크에서 함께 번식 쌍을 배치합니다. 동물 새로 마련 및 수정 된 알을 짓밟되지 않도록하려면 약의 메쉬 크기 ½ 탱크의 바닥 (그림 1A) 위의 "장착되어 약 1-2인치와 스크린 층을 설치합니다.
- 동물 amplexus에 있고 수정 된 계란이 화면 아래에있는 층 (그림 1b)에 관찰 될 때까지 12-48 시간에 방해받지 개구리 둡니다.
- 탱크에서 동물을 제거하지만, 더 이상 최소 24 시간의 알은 그대로 두십시오. 개구리의이 한 쌍의 6 주 후에 다시 사육 할 수 있습니다.
- 탱크의 바닥에서 배아를 느슨하게 4, 5 60x15 mm의 컬트로 전송10 %의 생리 (솔루션 B)를 포함 우레 요리. Niewkoop와 페이버 (ref. 20)의 계획에 따라 단계로 배아를 정렬하십시오. 유용한 배아 무대 22-24에 해당 될 것입니다. 그림 2B는 (약 무대 28) 유용 할 개발에 따라 너무 멀리있는 배아를 표시 할 경우 그림 2A는 약 스테이지 22 배아를 보여줍니다. 그것은 건강한 배아를 선택하는 것이 중요합니다 : 빛 갈색과 흰색 mottling과 외관에 부드러운되어있는이 이상적입니다. 큰 검은 색 또는 흰색 패치가 태아는 일반적으로 건강에 해로운되어 사용할 수 있습니다.
2. Xenopus의 태아의 Microdissection
- 층류 흐름 후드, 라벨 내부와 약 절반 세 60x15 mm 멸균 문화 10 % 식염수에 요리 기입하고, CMF과 하나가 있습니다.
- 10 %의 염분이 포함 된 요리 중 하나에 살균, 유리 파스퇴르 피펫 전송 5-10 단계 22-24 배아를 사용합니다. 스테레오 줌의 도움이 해부와후드 내부 ING 현미경 (10 × 접안 렌즈와 0.6-5 배)는 무균 # 5 포셉 (11251-30 좋아, 과학 도구)의 두 쌍을 사용하여 각 배아에서 젤리 코트와 vitelline 막을 제거합니다. (인물 3A 및 3B를 참조하십시오.)
- 10 % 식염수의 나머지 2 요리를 통해 마지막으로 CMF를 포함하는 요리로, 한 번에 하나의 그들에게 전달하여 맨 배아를 씻으십시오. 각 전송을 위해 새로운 멸균 피펫을 사용하고 요리에서 요리에 전송 솔루션의 볼륨을 최소화합니다.
- 회전 단계 1.5에서 만들었 microdissection 도구를 사용하여, 포셉 한 쌍의 완만하지만 단단히 각각의 배아를 개최하고, 신경 튜브과 동물의 가장 등쪽 부분에 위치하고 있습니다 연관된 myotomes를 제거합니다. 세 조각, 신경 튜브의 위치와 (그림 4A) 있도록 외부 단지 복부의 양쪽 끝에 한을 만들어이 작업을 수행합니다. 거리에 난황 granul에서 요리의 깨끗한 부분으로 각 해부 신경 튜브 / myotome 이동에스와 다른 부스러기 (그림 4B). 등쪽 - 복부 축, 그리고 신경 튜브와 myotomes의 위치는 그림 4에 표시됩니다.
- 이 솔루션에서 15 분 정도 후 (CMF) 사용 포셉 해부 조직의 무료 색소 피부를 리프트 및 삭제합니다. 그들은 서로 (그림 4C)에서 dissociated 될 때 추가로 30-60 분 후, 세포는 "모래 더미"를 형성합니다.
3. 신경 근육 공동 문화의 작성
- 문화 매체의 10 ML 튜브를 해동하고 무균 70 μl를 추가 ITS 35 NG / ML BDNF (시그마 B3795).
- 라벨 및 멸균 35mm 문화 요리 (FD35-100 세계 정밀 계측기) 약 반 L-15 배양액 (솔루션 (E)), 해부하는 각 배아에 대한 하나를 채 웁니다.
- 불꽃 위에 테이퍼 부분을 누른 상태 유리 파스퇴르 피펫의 각 끝을 쥐었고하여 도금 피펫을 제조. 에 대한 1로 끝을 분리 당겨0cm 후 약 0.2 mm의 팁을 얻을 수 있도록 끝을 중지.
- 그린 솔루션의 양을 최소화 한 배아에서 "모래 더미를"빨아 도금 피펫을 사용합니다. 배양 접시의 바닥에 세포를 배출. 여러 줄에 플레이트 세포를. 도금 undifferentiated 세포를 (그림 5A 및 5B) 관찰.
- 셀 시간이 접시에 부착 할 수 있도록 적어도 15 분 동안 방해받지 도금 세포의 요리를 둡니다.
4. 패치 클램핑 신경 근육 시냅스
- 근육 세포가 스핀들 모양이되어 척추 뉴런이 긴 프로세스 (그림 6) 연장 : 문화에 12-24 시간 후, 도금 전지는 별개의 형태학의 특성에 걸릴. neurite varicosities와 근육 세포 사이의 시냅스 기능 연락처를 동시 페어링 electrophysiological 레코딩을 확인 할 수 있습니다. "M", "S"와 "V"는 neuronal, 근육 세포를 각각 참조소마와 presynaptic varicosity.
- presynaptic varicosity 한과 근육 세포에 대해 하나 : 기록을위한 두 패치 전극을 준비합니다.
- presynaptic 전극 들어, 다음과 같이 amphotericin 함유 솔루션을 준비 : 5 밀리그램 amphotericin B (시그마 A4888)를 포함하는 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 100 μl DMSO를 추가합니다. 10 초에 소용돌이이 솔루션입니다. 다음으로, Amphotericin B (솔루션 (H))에 대한 + - 내부 솔루션 625 μl K가 포함 된 두 번째 microcentrifuge 튜브에이 솔루션을 10 μl를 추가합니다. 위와 같이 와동.
- amphotericin 함유 K 단계 4.3에서 조리 + - 내부 솔루션과 K +-내부 솔루션 (솔루션 (g))과 후 신경 전극과 미리 신경 전극을 입력합니다.
- NFR과 배양 접시에서 미디어를 교체하고 위상 대비 광학가 장착 역 현미경으로 변경합니다.
- 단지 각각의 목표 위의 두 전극을 배치합니다. 전체 셀 공동을 확보varicosity 전극으로 구멍 패치 구성하기 전에 근육 세포 전극과 nfiguration.
- 시냅스의 기능을 확인하려면, 소프트웨어 제어하에 (예 : Axopatch 200B, 분자 장치) 패치 클램프 증폭기로 varicosity을 depolarize (pCLAMP 9, 분자 장치의 예)와 동시 presynaptic과 postsynaptic 전류를 관찰합니다. 그림 7은 본 전류를 보여줍니다 40 뮤직 비디오에 -30 뮤직 비디오에서 10 뮤직 비디오 단위의 presynaptic varicosity에게 전압의 단계를 depolarizing에 대응 인치 presynaptic 셀에 볼 안쪽으로 전류가 그렇단 + 및 CA 2 +와 K +를하여 외부 전류에 의해 실행됩니다. postsynaptic 셀에 기록 된 전류는 varicosity에서 출시 된 신경 전달 물질에 반응하고 nicotinic 아세틸 콜린 수용체 채널을 통해 오세영의 +에 의해 주로 수행하고 있습니다.
Representative Results
그림 4B는 즉시 22 Xenopus의 배아. 그림 4C 그, CA 2 +-MG 2 + 무료 솔루션 피부 제거 및 부화 (CMF, 솔루션 후 (표시하는 단계에서의 제거 후 코드 / myotome 격리 된 척추의 등보기를 보여줍니다 C)), 셀은 "모래 더미"로 해리와 도금을위한 준비가되어 있습니다. 문화 매체 세포에 도금 약간의 형태학의 변화 (그림 5B)를 전시하지만, 문화에 이십사시간 후 독특한 모양에 걸릴 즉시. 뉴런이 확장 neurites하면서 구형 유지하면서 근육 세포는 스핀들 모양이 될 근육 세포와 시냅스 (그림 6)에서 정교한 varicosites.주세요 presynaptic varicosity과 postsynaptic 근육 세포 (그림 7)에서 동시 페어링 패치 녹음이 신경 전달 물질의 방출과 resulta과 관련된 presynaptic 안쪽과 바깥쪽으로 전류를 보여NT postsynaptic 전류를 흥분성의.
그림 1 A :.. 화면 꼭대기에 결합 양동이의 개구리 사육 쌍 B : 수정 된 계란과 amplexus에 개구리.
그림 2 A :.. "적합"단계 22 배아 B : "적합"단계 28 배아. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다.
그림 3 :. 스테이지 22 배아 vitelline 막과 젤리 코트의 제거 전에. 화살표는 젤리 코트의 바깥 쪽 가장자리로 가리 킵니다. vitelline 막이 embr에 밀접하게 준수야와 거의 보이지 않는 B는 :. 맨 배아. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다.
그림 4 A : 될 수있는 해부하는 부분 B를 나타내는 점선이있는 스테이지 22 배아 :.. 배의 심하게 격리 등쪽 부분을, "D"와 "V"는 배아의 등 및 복부 측면을 참조하는 동안 "m" 와 "N"은 mytomes과 신경 튜브의 대략적인 위치를 나타냅니다 C는 :. CMF에서 60 분 후 세포의 "모래 더미". 스케일 바는 1 음, 그리고 B와 C에 대한 0.5 mm를 나타냅니다.
그림 5 A :. 바로 도금 후 문화에 세포의 5 배 전력 전망이 있습니다. B : 40x에서 같은 문화. 규모바 40 μm 및 B. 5 μm을 나타냅니다
그림 6. neuronal 소마 (S), presynaptic varicosity (V) 및 postsynaptic 근육 세포 (M)의 식별과 문화에 신경 근육 접합부. 규모 바 : 5 μm.
10 MV 증분 전압의 응용 프로그램에 대한 응답으로 보는 그림 7. Presynaptic (위)와 postsynaptic (하단) 전류가 -30 뮤직 비디오에서 40 뮤직 비디오에 presynaptic varicosity에 제출 단계를 반복합니다. 전압 단계는 presynaptic 흔적의 일부 옆에 표시됩니다. 두 세포의 개최 가능성은 -70 MV했다.
Discussion
motoneurons 및 근육 세포의 성공적인 공동 배양의 주요 단계를 적절하게 Xenopus 개구리 유도 사육에서 생산 배아를 조작의 사용 및 undifferentiated 척추 뉴런과 myoblasts의주의 무균 해부 있습니다. 빨리 자주 개발을 halts 이동로가 약 정도 (10) 개최에 도달 할 때까지 수정 된 달걀은 그대로 남아있을 것입니다. 건강한 태아는 부드러운 모양과 갈색과 흰색 얼룩덜룩 한 색소에 의해 식별됩니다. 이 근세포가 크게 차별화 한 단지 신경 튜브 닫히면 후에 전에 개발 중에 지점이기 때문에 스테이지 22-24 태아가 가장 유용합니다. 또한, 이전 배아의 세포는 CMF에 잘 해리하지. 그 배에 강력하게 준수로 vitelline 막 제거 할 때주의가 필요합니다. 배아는 그대로 나옵니다 있도록 막은 날카로운 집게를 사용하여 해체해야합니다. 또 다른 중요한 precaution은 배양 접시 (오히려이 정착 두는 것보다)의 하단에 세포를주의 깊게을 배치하는 것입니다. 이 세포가 배양 접시를 준수 될 확률이 높아집니다으로이 방법을 사용하는 것이 좋습니다.
신경과 근육 사이의 기능 neurotransmission 단 postsynaptic 기록으로 결정 할 수 있으며, 자주 innervation 후 자발적인 근육 수축의 관찰에 의해 ascertained 수 있습니다. 취소 innervated 근육 세포는 문화에 경련하지 않습니다. 혼자 Postsynaptic 녹음이 미니어처 endplate 전류 또는 전위하지만 evoked 출시 측정 사전 및 postsynaptic 전류 presynaptic 자극, 그리고 상관 관계 패치 - 클램프 더블을 필요로 필요를 기록하는 데 유용합니다.
여기에 설명 된 페어 - 패치 녹화 방법 외에,이 준비는이 수있는 neuronal 소마 5 삼분의 일 피펫을 소개 할 수있는 기회를 제공하는 행위 가능성이 THA의 생성t는 presynaptic varicosity에 전파하고 신경 전달 물질의 방출을 유도 할 수 있습니다. 또한, 중재 할 생각이 신경 전달을 조절 아르 putative 대리인은 시냅스의 양쪽에 도입 될 수있다 : 근육 세포 피펫을 통해 또는 소마에 배치 삼분의 일 피펫의 확산을 통해.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
NSF (0,854,551)에 의해 기금을 마련했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||
| Insulin-Transferrin-Selenium | Sigma | I1884 | |||||||||||||||
| Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG-10 | |||||||||||||||
| Vapor Pressure Osmometer | Wescor | 5100C | |||||||||||||||
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |||||||||||||||
| Amphotericin B | Sigma | A4888 | |||||||||||||||
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |||||||||||||||
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Table 1. |
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References
- Augustine, G. J., Eckert, R. Divalent cations differentially support transmitter release at the squid giant synapse. J. Physiol. 346, 257-271 (1984).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641 (1976).
- Weldon, P. R., Cohen, M. W. Development of synaptic ultrastructure at neuromuscular contacts in an amphibian cell culture system. J. Neurocytol. 8, 239-259 (1979).
- Tabti, N., Poo, M. -M. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, Massachusetts. 137-153 (1991).
- Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses. J. Neurosci. 17, 2990 (1997).
- DiGregorio, D. A., Peskoff, A., Vergara, J. L. Measurement of action potential-induced presynaptic calcium domains at a cultured neuromuscular junction. J. Neurosci. 19, 7846 (1999).
- Yazejian, B., Sun, X. P., Grinnell, A. D. Tracking presynaptic Ca2+ dynamics during neurotransmitter release with Ca2+-activated K+ channels. Nat. Neurosci. 3, 566 (2000).
- Sun, X. P., Chen, B. M., Sand, O., Kidokoro, Y., Grinnell, A. D. Depolarization-induced Ca2+ entry preferentially evokes release of large quanta in the developing Xenopus neuromuscular junction. J. Neurophysiol. 104 (5), 2730-2740 (2010).
- Xie, S. P., Poo, M. M. Initial events in the formation of neuromuscular synapse: rapid induction of acetylcholine release from embryonic neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7069 (1986).
- Li, P. P., Chen, C., Lee, C. W., Madhavan, R., Peng, H. B. Axonal filopodial asymmetry induced by synaptic target. Mol. Biol Cell. 22 (14), 2480-2490 (2011).
- Feng, Z., Ko, C. P. Schwann cells promote synaptogenesis at the neuromuscular junction via transforming growth factor-beta1. J. Neurosci. 28 (39), 9599-9609 (2008).
- Song, H. J., Ming, G. L., Poo, M. M. cAMP-induced switching in turning direction of nerve growth cones. Nature. 17 (6639), 275-279 (1997).
- Morimoto, T., Wang, X. H., Poo, M. M. Overexpression of synaptotagmin modulates short-term synaptic plasticity at developing neuromuscular junctions. Neuroscience. 82 (4), 969-978 (1998).
- Lu, B., Czernik, A. J., Popov, S., Wang, T., Poo, M. M., Greengard, P. Expression of synapsin I correlates with maturation of the neuromuscular synapse. Neuroscience. 74 (4), 1087-1097 (1996).
- Schaeffer, E., Alder, J., Greengard, P., Poo, M. M. Synapsin IIa accelerates functional development of neuromuscular synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (9), 3882-3886 (1994).
- Liou, J. C., Tsai, F. Z., Ho, S. Y. Potentiation of quantal secretion by insulin-like growth factor-1 at developing motoneurons in Xenopus cell culture. J. Physiol. 553 (Pt. 3), 719-7128 (2003).
- Peng, H. B., Yang, J. F., Dai, Z., Lee, C. W., Hung, H. W., Feng, Z. H., Ko, C. P. Differential effects of neurotrophins and schwann cell-derived signals on neuronal survival/growth and synaptogenesis. J. Neurosci. 23 (12), 5050-5060 (2003).
- Dan, Y., Poo, M. M. Hebbian depression of isolated neuromuscular synapses in vitro. Science. 12 (5063), 1570-1573 (1992).
- Xiao, Q., Xu, L., Spitzer, N. C. Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity. J. Neurosci. 30 (16), 5792-5801 (2010).
- Niewkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , North-Holland, Amsterdam. (1967).
