Samtidig Pre-og postsynaptiske Elektrofysiologisk Opptak fra Published: March 11, 2013 doi: 10.3791/50253

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Bruce Yazejian¹, Rita M. Yazejian¹, Rachel Einarsson², Alan D. Grinnell¹

¹Department of Physiology, David Geffen School of Medicine at UCLA, ²Natural Science Division, Pepperdine University

Summary

Denne videoen demonstrerer Fremgangsmåtene anvendt til vokse primære kulturer av embryonale

Abstract

Mye informasjon om koblingen av presynaptiske ioniske strømmer med utgivelsen av nevrotransmitter er innhentet fra virvelløse preparater, særlig blekksprut gigantiske synapse ^en. Imidlertid, bortsett fra for fremstilling som er beskrevet her, er det få virveldyr preparater eksisterer der det er mulig å foreta samtidige målinger av neurotransmitterfrigjørelse og presynaptisk ioniske strømninger. Embryoniske Xenopus motoneurons og muskelceller kan dyrkes sammen i enkel kultur medium ved romtemperatur, de vil danne funksjonelle synapser innen 12-24 timer, og kan brukes til å studere nerve og muskel celle utvikling og synaptiske interaksjoner i flere dager (inntil overvekst forekommer). Noen fordeler disse co-kulturer over andre virveldyr preparater omfatter enkelhet av forberedelse, muligheten til å opprettholde de kulturer og arbeid ved romtemperatur, og den klare tilgjengeligheten synapsene dannet ²-4. Preparatet har blitt brukt mye til å studere biofysiske egenskaper presynaptiske ionekanaler og regulering av senderen utgivelse ^5-8. I tillegg har forberedelse lånes seg til andre bruksområder, inkludert studier av neurite utvekst og synaptogenesis ^9-12, molekylære mekanismer av nevrotransmitter ^13-15 utgivelse, rollen diffusjonsevne budbringere i neuromodulation ^16,17, og in vitro synaptisk plastisitet ^{18 - 19.}

Protocol

1. Pre-eksperimentell Forberedelse

1. Forbered følgende løsninger (se tabell 1 for komposisjoner): (a) 1 liter NFR (Normal Frog Ringers), (b) 100 ml 10% saltvann, (c) 100 ml CMF ^{(Ca2 +} / Mg ^{2 +-fri} løsning ), (d) 1 ml ITS (insulin-transferrin-selen, I1884 Sigma), (e) 100 ml L-15 dyrkningsmedium, (f) 10 ml HCG (humant korionisk gonadotropin Sigma CG-10), (g) 100 ml K ^+-interne løsninger, (h) 100 ml K ^+-interne løsning for amfotericin B. Det osmotiske styrken av oppløsningen 1 bør kontrolleres for å sikre at det er ca 260 mOsm ved hjelp av en damptrykk osmometer (f.eks Wescor Model # 5100C) .
2. Filtrer sterilisere løsninger (b) og (c). Løsninger (A) (B) og (c) kan lagres opptil tre måneder ved 4 ° C. Forbered løsning (d) ved tilsetning av 1 ml avionisert H ₂ O til hetteglasset med lyofilisert pulver via en 25 gauge kanyle og sprøytefilter. Denne endelige løsning cen bli lagret ved 4 ° C i 30 dager.
3. Forbered løsning (E) i en laminær strømningshette ved å kombinere alle komponenter i et begerglass eller kolbe. Filtrer sterilisere den endelige løsningen og overfør 10 ml alikvoter i sterile sentrifugerør. Oppbevares ved -20 ° C.
4. Klargjør HCG (løsning (f)) ved tilsetning av 10 ml avionisert H ₂ 0 til hetteglasset med lyofilisert pulver via en 25 gauge kanyle og sprøytefilter. Denne endelige løsningen kan lagres ved 4 ° C i 30 dager.
5. Dikte minst to mikrodisseksjon verktøy ved liming av et Minutien tapp (26002-10, Fine Science Tools) til enden av et glass Pasteur-pipette med cyanoakrylat lim. Tillat den skarpe enden av nålen for å forlenges forbi enden av pipetten ca 0,5 cm.
6. To dager før forbereder kulturer, indusere avl med følgende prosedyre. Identifisere en avl-klar par Xenopus ved å observere en fremtredende, rødlig Cloaca på kvinnelige og mørk pigmentering på den plane surface av forbeina av den mannlige. En av gangen, netto hver frosk og hold den ventrale siden ned på en vask med nettet slik at det ikke kan unnslippe. Injiser 1 ml oppløsning (f) gjennom nettet og subkutant inn i en av de dorsale lymph sekker.
7. Plasser avl paret sammen i en dekket ti gallon tank med vann. For å sikre at dyrene ikke vil tråkke de nylagte og befruktede egg, installere en vist etasje med en mesh størrelse på ca ½ "montert omtrent 1-2 inches over bunnen av tanken (figur 1A).
8. La frosker uforstyrret for 12-48 timer før dyrene er i amplexus og befruktede egg er observert på gulvet under skjermen (Figur 1B).
9. Fjern dyrene fra tanken, men la eggene uforstyrret i minst 24 timer lenger. Dette paret av frosker kan bli re-avlet etter seks uker.
10. Løsne embryoer fra bunnen av tanken og overføre dem til fire eller fem 60x15 mm kulture retter inneholdende 10% saltløsning (oppløsning b). Sortere embryoer ved scenen i henhold til ordningen med Niewkoop og Faber (ref. 20). Nyttige embryoer vil være de på scenen 22-24. Figur 2A viser et embryo på ca stadium 22 mens figur 2B viser et embryo som er for langt i utviklingen til å være nyttig (ca. stadium 28). Det er viktig å velge embryo som er sunt: ​​de som er glatt i utseende med lys brun og hvit mottling er ideelle. Embryo som har store sorte eller hvite flekker er generelt usunn og ubrukelig.

2. Mikrodisseksjon av Xenopus embryo

1. Inne i en laminær hette, etikett og fyll ca halvveis tre 60x15 mm sterile kultur retter med 10% saltvann, og ett med CMF.
2. Ved hjelp av en steril, glass Pasteur pipette overføring fem på ti trinn 22-24 embryoer inn en av retter inneholdende 10% saltvann. Ved hjelp av en stereo zoom dissekereing mikroskop inne i hetten (0,6-5x med 10 x okularer), fjerne gelé pels og vitelline membran fra hver embryo med to par sterile nr 5 tang (11251-30, Fine Science Tools). (Se figurene 3A og 3B).
3. Vask bare embryoer ved å sende dem, en om gangen, gjennom de resterende to retter på 10% saltvann og til slutt inn i parabolen inneholder CMF. Bruk en ny, steril pipette for hver overføring og minimere volumet av løsningen overført fra parabol til antenne.
4. I sin tur, holder hver embryo forsiktig men bestemt med en pinsett, og ved hjelp av verktøyet mikrodisseksjon fashioned i trinn 1,5, fjern nevralrøret og tilhørende myotomes som er plassert på den mest dorsal aspektet av dyret. Gjøres ved at tre stykker, en i hver ende av plasseringen av nevralrøret og en tredje bare ventral det (Figur 4A). Flytte hver dissekerte nevralrøret / myotome til en ren del av parabolen bort fra eggeplomme granules og annet rusk (figur 4B). Den dorsale-ventral aksen, og plasseringen av nevralrøret og myotomes er indikert i figur 4.
5. Etter ca femten minutter i denne løsningen (CMF) bruker tang for å løfte den pigmentert hud fri for dissekert vev og kast. Etter ytterligere 30-60 minutter, vil cellene danne en "sandhaugen" som de blir skilt fra hverandre (figur 4C).

3. Utarbeidelse av nerve-muskel Co-kulturer

1. Tine en 10 ml tube av kultur medium og aseptisk legge 70 ul ITS og 35 ng / ml BDNF (Sigma B3795).
2. Produsent og fyll sterile 35 mm kultur retter (FD35-100 Verden presisjonsinstrumenter) omtrent halvveis med L-15 kulturmediet (løsning (E)), en for hver embryo dissekert.
3. Fremstill en plating pipette ved å ta tak i hver ende av et glass Pasteur-pipette ved å holde den koniske parti over en flamme. Trekk endene fra hverandre til omtrent 10 cm og deretter bryte av enden for å gi en spiss på omtrent 0,2 mm.
4. Bruk plating pipette for å suge opp "sandhaugen" fra ett embryo minimere mengden trekkes oppløsningen. Utvise cellene mot bunnen av en kultur tallerken. Plate cellene i flere linjer. Observere gullbelagte udifferensierte celler (figur 5A og 5B).
5. La retter av belagt celler uforstyrret i minst femten minutter, slik at cellene tid til å feste til parabolen.

4. Patch Clamping nerve-muskel Synapser

1. Etter 12-24 timer i kultur, belagt celler ta på forskjellige morfologiske egenskaper: muskelceller blir spindel-formet og spinal nevroner utvide lange prosesser (figur 6). Funksjonell synaptisk kontakt mellom neurite varicosities og muskelceller kan bekreftes med samtidige sammenkoblede elektrofysiologiske opptak. "M", "S" og "V" refererer henholdsvis til muskel celle, neuronalsoma og presynaptisk åreknute.
2. Forbered to patch elektroder for opptak: en for den presynaptiske åreknute og en for muskelcellen.
3. For den presynaptiske elektroden, forberede en amfotericin-holdige løsning som følger: Tilsett 100 ul DMSO til et 1,5 ml mikrosentrifugerør inneholdende 5 mg amfotericin B (Sigma A4888). Vortex denne løsningen i 10 sek. Deretter tilsettes 10 ul av denne løsning til en andre mikrosentrifugerør som inneholder 625 pl K ^+-interne løsning for amfotericin B (oppløsning (H)). Vortex som ovenfor.
4. Fyll den presynaptiske elektrode med amfotericin-inneholdende K ^+-interne oppløsning fremstilt i trinn 4.3 og den postsynaptiske elektrode med K ^+-interne oppløsning (oppløsning (g)).
5. Erstatt media i kulturen parabolen med NFR og flytter den til en omvendt mikroskop utstyrt med fasekontrast optikk.
6. Plasser begge elektrodene rett over sine respektive mål. Få tak i den hel-celle configuration med muskelcelle elektroden før den perforerte patch konfigurasjon med åreknute elektroden.
7. For å bekrefte funksjonaliteten av synapsen, depolarize den åreknute med en patch clamp forsterker (f.eks Axopatch 200B, Molecular Devices) under programvare kontroll (for eksempel ved 9 pCLAMP, Molecular Devices) og observere de samtidige presynaptiske og postsynaptiske strøm. Figur 7 viser strømmene sett i respons til depolariserende trinn spenning gitt til presynaptiske åreknute i 10 mV trinn fra -30 mV til +40 mV. Innover strømmer sett i den presynaptiske cellen er gjennomført av Na ⁺ og Ca ^{2 +} og de ​​ytre strømmer av K ^+. Strømninger registrert i den postsynaptiske cellen er svar på nevrotransmitter frigjøres fra åreknute og føres det meste av Na ⁺ gjennom nikotin-acetylcholin reseptor-kanaler.

Representative Results

Figur 4B viser dorsal visning av en isolert ryggmargen / myotome umiddelbart etter at den fjernes fra en scene 22 Xenopus embryo. Figur 4C viser at etter hud fjerning og inkubasjon i Ca ^{2 +-Mg 2 +-free} løsning (CMF, oppløsning ( c)), celler dissosiere inn i en "sandhaugen" og er klar for plating. Umiddelbart etter plating inn dyrkingsmedium celler viser lite morfologiske variasjon (figur 5B), men ta på forskjellige former etter tjuefire timer i kultur. Muskelceller blir spindel-formet, mens nervecellene forblir sfærisk mens strekker neurites at forseggjort varicosites på synapser med muskelceller (figur 6). Simultan sammenkoblet patch opptak fra presynaptiske åreknute og postsynaptisk muskelcelle (Figur 7) avslører presynaptiske indre og ytre strømmer forbundet med frigjøring av neurotransmitter og resultant eksitatoriske postsynaptiske strømninger.

Figur 1 A:.. Avl par frosker i parring bøtte oppå skjermen B: Frosker i amplexus med befruktede egg.

Figur 2:.. "Egnet" scenen 22 embryo B: "uegnet" scenen 28 embryo. Skala bar representerer 1 mm.

Figur 3 A:. Stage 22 embryo før fjerning av vitelline membran og gelé strøk. Pilen peker til den ytre kanten av gelé strøk. Den vitelline membran følger tett til embryo og er nesten usynlig B:. Bare embryo. Skala bar representerer 1 mm.

Figur 4 A: Stage 22 embryo med en stiplet linje som indikerer å-være dissected del B:.. Akutt isolert dorsal del av embryo, "d" og "v" refererer til den dorsale og ventrale deler av embryoene, mens "m" og "n" indikerer den omtrentlige plassering av mytomes og nevralrørsdefekter C:. "Sand haug" av celler etter 60 min i CMF. Skala strek representerer 1 mm for en, og 0,5 mm for B og C.

Figur 5 A:. 5x kraft visning av celler i kultur umiddelbart etter plating. B: Samme kultur på 40x. Skalabar representerer 40 mikrometer for A og 5 mikrometer for B.

Figur 6. Nevromuskulære krysset på kultur med identifisering av neuronal soma (S), presynaptiske åreknute (V), og postsynaptisk muskelcelle (M). Målestokk: 5 mikrometer.

Figur 7. Presynaptiske (øverst) og postsynaptisk (nederst) strømmer sett i respons til påføring av 10 mV inkrementell spenning trinnene forelagt presynaptiske åreknute fra -30 mV til +40 mV. Spennings trinn er indikert ved siden av noen av de presynaptiske spor. Den holder potensial for begge cellene var -70 mV.

Discussion

Avgjørende trinn i vellykkede co-dyrkning av motoneurons og muskelceller er bruk av hensiktsmessig iscenesatte embryoene produsert fra den induserte avl av Xenopus frosker, og forsiktig aseptisk disseksjon av de udifferensierte spinal nevroner og myoblaster. Befruktede egg bør overlates uforstyrret helt til de når omtrent scenen 10 eller så som å flytte dem før ofte stopper deres utvikling. Friske fostre blir identifisert av en glatt utseende og en brun og hvit spettet farge. Stage 22-24 fostre er mest nyttig fordi dette er det punktet under utvikling like etter nevralrøret lukkes og før myocytes har differensiert betydelig. I tillegg, celler fra eldre embryoer mislykkes å dissosiere godt i CMF. Forsiktighet bør tas når du fjerner vitelline membran som det fester seg sterkt til embryoet. Membranen skal rives i stykker med skarpe tang slik at embryoet kommer intakt. En annen viktig precaution er å nøye plassere cellene på bunnen av kulturen parabolen (heller enn å la dem avgjøre det). Denne metoden er foretrukket som dette øker sannsynligheten for at cellene skal følge den kulturen parabolen.

Funksjonell nevrotransmisjon mellom nerve og muskel kan avgjøres med bare postsynaptiske opptak og ofte kan fastslås ved observasjon av spontane muskel sammentrekning etter innervasjon. Un-innerverte muskelceller ikke nappe i kultur. Postsynaptiske opptak alene er nyttig for innspilling miniatyr gavl strøm eller potensial, men målinger av fremkalt utgivelsen krever presynaptisk stimulering, og korrelasjon av pre-og postsynaptiske strømmer krever dobbel patch-clamp.

Foruten parvise patch opptak som beskrives her, tilbyr dette preparatet muligheten til å presentere en tredjedel pipette på neuronal soma ⁵ Dette gjør at generasjonen av et aksjonspotensial that kan overføres til den presynaptiske åreknute og føre til frigjøring av nevrotransmitter. I tillegg kan putative agenter som er tenkt å mediere eller modulere synaptisk transmisjon bli introdusert til hver side av synapsen: via muskelcelle pipette eller via diffusjon fra en tredje pipette plassert på soma.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Insulin-Transferrin-Selenium	Sigma	I1884
Human Chorionic Gonadotropin	Sigma	CG-10
Vapor Pressure Osmometer	Wescor	5100C
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Amphotericin B	Sigma	A4888
Forceps	Fine Science Tools	11251-30
Solution Name Recipe (a) NFR (Normal Frog Ringer (in mM) 116 NaCl, 2 KCl, 1.8 CaCl2, 5 Na+-HEPES, pH 7.35. (b) 10% saline 10 ml NFR+90 ml deionized H2O (c) CMF (Ca2+ /Mg2+-free solution) 125 NaCl, 2 KCl, 1.2 EDTA, 5 Na+-HEPES, pH 7.35. (e) L-15 Culture Media 50 ml L-15 media (Sigma L1518) + 50 ml NFR. (g) K+-internal solution (in mM) 116 KCl, 1 NaCl, 1 MgCl2, 10 EGTA, 5 HEPES, pH 7.3 (h) K+-internal solution for Amphotericin B (in mM) 52 K2SO4, 38 KCl, 1 EGTA, 5 HEPES, pH 7.3
Table 1.