Summary
Este video muestra los procedimientos utilizados para cultivar cultivos primarios de embrión
Abstract
Mucha información sobre el acoplamiento de presinápticas corrientes iónicas con la liberación de neurotransmisor se ha obtenido a partir de preparaciones de invertebrados, especialmente el calamar gigante sinapsis 1. Sin embargo, excepto para la preparación descrito aquí, existen pocos preparativos vertebrados en el que es posible realizar mediciones simultáneas de la liberación de neurotransmisores presinápticos y corrientes iónicas. Motoneuronas embrionarias Xenopus y células musculares se pueden cultivar juntas en un medio de cultivo simple a temperatura ambiente, sino que se forman sinapsis funcionales dentro de doce hasta veinticuatro horas, y puede ser usado para estudiar nervio y el desarrollo de las células musculares y las interacciones sinápticas durante varios días (hasta crecimiento excesivo ocurre). Algunas de las ventajas de estos co-cultivos preparados a base de otros vertebrados incluyen la simplicidad de la preparación, la capacidad de mantener las culturas y el trabajo a temperatura ambiente, y la fácil accesibilidad de las sinapsis formadas 2-4. La preparación se ha utilizado ampliamente para estudiar las propiedades biofísicas de los canales de iones presináptica y la regulación de la liberación del transmisor 5-8. Además, la preparación se ha prestado a otros usos, incluyendo el estudio del crecimiento de neuritas y la sinaptogénesis 9-12, los mecanismos moleculares de la liberación de neurotransmisores 13-15, el papel de mensajeros difusibles en la neuromodulación 16,17, y en la plasticidad sináptica in vitro 18 - 19.
Protocol
1. Pre-experimental Preparación
- Preparar las soluciones siguientes (véase el cuadro 1 para las composiciones): (a) 1 litro NFR (Ringer Frog Normal), (b) 100 ml de solución salina al 10%, (c) 100 ml CMF (Ca 2 + / Mg 2 + sin solución ), (d) 1 ml ITS (insulina-transferrina-selenio, Sigma I1884), (e) 100 ml de medio L-15 de la cultura, (f) 10 ml de HCG (gonadotropina coriónica humana Sigma CG-10), (g) 100 ml K +-solución interna, (h) 100 ml K +-interna solución de anfotericina B. La fuerza osmótica de la solución 1 se debe comprobar para asegurarse de que es aproximadamente 260 mOsM utilizando un osmómetro de presión de vapor (por ejemplo, modelo Wescor # 5100C) .
- Filtrar esterilizar soluciones de (b) y (c). Soluciones (a) (b) y (c) se pueden almacenar hasta tres meses a 4 ° C. Preparar la solución de (d) mediante la adición de 1 ml de H2O desionizada al vial que contiene el polvo liofilizado a través de una aguja de calibre 25 y jeringa filtro de jeringa. Esta última solución cun ser almacenado a 4 º C durante 30 días.
- Preparar la solución de (e) en una campana de flujo laminar mediante la combinación de todos los componentes en un vaso de precipitados o matraz. Esterilizar por filtración la solución final y transferir alícuotas de 10 ml en tubos de centrífuga estériles. Conservar a -20 ° C.
- Preparar la HCG (solución (f)) mediante la adición de 10 mL de agua desionizada H 2 0 al vial que contiene el polvo liofilizado a través de una aguja de calibre 25 y jeringa filtro de jeringa. Esta solución final se puede almacenar a 4 ° C durante 30 días.
- Fabricar al menos dos herramientas de microdisección por pegado un pasador Minutien (26002-10, herramientas Fine Science) al extremo de una pipeta Pasteur de vidrio con pegamento de cianoacrilato. Permitir que el extremo afilado de la espiga se extienda más allá del extremo de la pipeta de aproximadamente 0,5 cm.
- Dos días antes de la preparación de cultivos, inducir la cría con el siguiente procedimiento. Identificar una pareja reproductora-ready de Xenopus mediante la observación de una cloaca prominente, de color rojizo en la pigmentación de la mujer y la oscuridad en el su planorface de las patas delanteras de la masculina. Uno a la vez, neta de cada rana y manténgalo lado ventral hacia abajo sobre un lavadero con la red de modo que no puede escapar. Inyectar 1 ml de la solución de (f) a través de la red y por vía subcutánea en uno de los sacos linfáticos dorsales.
- Coloque la pareja reproductora juntos en un tanque de diez cubiertas de agua. Para asegurarse de que los animales no se pisotean los huevos recién puestos y fertilizados, instale un piso de malla con un tamaño de malla de aproximadamente ½ "provistos de aproximadamente 1-2 cm por encima del fondo del tanque (Figura 1A).
- Deja ranas perturbadas durante 12-48 horas hasta que los animales están en amplexus y los huevos fertilizados se observan en el piso debajo de la pantalla (Figura 1B).
- Quite los animales del tanque, pero dejan los huevos en reposo durante al menos 24 horas más. Este par de ranas se puede volver a criados después de seis semanas.
- Aflojar los embriones desde la parte inferior del tanque y transferirlos a cuatro o cinco culto mm 60x15ure platos que contienen 10% de solución salina (solución B). Clasificar los embriones por etapa según el esquema de Niewkoop y Faber (ref. 20). Embriones de interés serán aquellos en la etapa 22-24. Figura 2A muestra un embrión en etapa de aproximadamente 22, mientras que la Figura 2B muestra un embrión que es demasiado avanzado en el desarrollo de su utilidad (aproximadamente etapa 28). Es importante elegir embriones que son sanos: las que son lisas en apariencia con marrón claro y moteado blanco son ideales. Los embriones que tienen grandes manchas de color negro o blanco son generalmente insalubres e inutilizable.
2. Microdisección de embriones de Xenopus
- Dentro de una campana de flujo laminar, etiquetar y llenar hasta la mitad aproximadamente tres 60x15 mm platos estériles de cultivo con 10% de solución salina, y una de ellas con CMF.
- Uso de una solución estéril, Pasteur de vidrio de pipeta de transferencia nueve y cincuenta y cinco etapa 22-24 embriones en una de las placas que contienen 10% de solución salina. Con la ayuda de un zoom estéreo diseccionarmicroscopio ing interior de la campana (0,6-5x con oculares 10 x), retire la capa gelatinosa y la membrana vitelina de cada embrión con dos pares de pinzas estériles º 5 (11251-30, herramientas Ciencias Artes). (Ver Figuras 3A y 3B.)
- Lavar los embriones desnudos haciendo pasar ellos, uno a la vez, a través de los otros dos platos de 10% de solución salina y finalmente en el plato que contiene el CMF. Utilizar una pipeta estéril nueva para cada transferencia y minimizar el volumen de solución transferida de plato a plato.
- A su vez, mantenga cada embrión suave, pero firmemente con un par de pinzas y, utilizando la herramienta de microdisección formado en el paso 1,5, extraer el tubo neural y miotomas asociados que están situados en el aspecto más dorsal del animal. Para ello, haciendo tres sectores, uno en cada extremo de la ubicación del tubo neural y la tercera sólo ventral a la misma (Figura 4A). Mover cada tubo neural diseccionado / miotoma a una parte limpia de la placa alejado de la yema GRANULES y otros desechos (Figura 4B). El eje dorso-ventral, y las localizaciones del tubo neural y miotomas se indica en la Figura 4.
- Después de unos quince minutos en esta solución (CMF) pinzas de uso para levantar la piel pigmentada libre de los tejidos disecados y descarte. Después de un adicional de 30-60 min, las células se formará una "pila de arena", como se disocian el uno del otro (Figura 4C).
3. Preparación del nervio-músculo Co-culturas
- Descongelar un tubo de 10 ml de medio de cultivo y añadir asépticamente 70 l ITS y 35 ng / ml de BDNF (Sigma B3795).
- Etiqueta y llenar 35 cajas de cultivo estériles mm (FD35-100 World Precision Instruments) aproximadamente a mitad de camino con el medio de cultivo L-15 (solución de (e)), una para cada embrión disecado.
- Se fabrica una pipeta chapado sujetando cada extremo de una pipeta Pasteur de vidrio mientras se mantiene la parte cónica sobre una llama. Tire de los extremos separados a 10 cm y se interrumpe el extremo para proporcionar una punta de aproximadamente 0,2 mm.
- Use la pipeta para aspirar plating la "pila de arena" de un embrión minimizar la cantidad de solución dibujada. Expulsar las células en la parte inferior de una placa de cultivo. Placa de las células en varias líneas. Observe chapados en células no diferenciadas (Figura 5A y 5B).
- Deja los platos de células establecidas inalteradas durante al menos quince minutos para que el tiempo las células se unan al plato.
4. Patch clamp nervio-músculo Sinapsis
- Después de 12-24 horas en cultivo, las células chapados asumir distintas características morfológicas: las células musculares se vuelven en forma de huso y las neuronas espinales ampliar los procesos largos (Figura 6). Contacto funcional sináptica entre las varices neuritas y células musculares se puede confirmar con parejas simultáneas registros electrofisiológicos. "M", "S" y "V" se refieren respectivamente a la célula muscular, neuronalsoma y várices presináptica.
- Preparar dos electrodos de parche para la grabación: una para la variz presináptica y uno para la célula muscular.
- Para el electrodo presináptica, preparar una solución que contiene anfotericina como sigue: Añadir 100 l de DMSO a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 5 mg de anfotericina B (Sigma A4888). Vortex esta solución durante 10 sec. A continuación, añadir 10 l de esta solución a un tubo de microcentrífuga que contiene 625 segundos K +-l interno solución de anfotericina B (solución de (h)). Vortex como anteriormente.
- Llenar el electrodo pre-sináptica con la K que contiene anfotericina +-interna solución preparada en el paso 4,3 y el electrodo de post-sináptica con K +-interna solución (solución (g)).
- Vuelva a colocar los medios de comunicación en la placa de cultivo con NFR y lo traslada a un microscopio invertido equipado con óptica de contraste de fase.
- Coloque los dos electrodos justo por encima de sus respectivos objetivos. Obtener la cooperación de células enterasnfiguration con el electrodo de la célula muscular antes de la configuración de parche perforado con el electrodo de varicosidad.
- Para confirmar la funcionalidad de la sinapsis, despolarizar la variz con un amplificador de patch clamp (por ejemplo Axopatch 200B, Molecular Devices) bajo control de software (por ejemplo, por pCLAMP 9, Molecular Devices) y observar las corrientes simultáneas presinápticos y postsinápticos. Figura 7 muestra las corrientes visto en respuesta a la despolarización pasos de voltaje a que la variz presináptica en incrementos de 10 mV desde -30 mV a +40 mV. Las corrientes hacia el interior se observan en la célula presináptica se realizan por Na + y Ca 2 + y las corrientes hacia el exterior de K +. Corrientes registradas en la célula postsináptica son respuestas a neurotransmisores liberados de la variz y se realizan principalmente por Na + a través de canales de receptores de acetilcolina nicotínicos.
Representative Results
La figura 4B muestra la vista dorsal de un cordón espinal aislada / miotoma inmediatamente después de su extracción de una etapa 22 embriones de Xenopus. Figura 4C muestra que, después de la solución eliminación de la piel y la incubación en Ca 2 +-Mg 2 +-solución libre (CMF, ( c)), las células se disocian en una "pila de arena" y están listos para el revestimiento. Inmediatamente después de la siembra en medios de cultivo las células presentan poca variabilidad morfológica (Figura 5 B) sino que adquieren distintas formas después de veinticuatro horas de cultivo. Convertirse en células musculares en forma de huso mientras que las neuronas permanecen esférica mientras se extienden neuritas que varicosites elaborados en las sinapsis con las células musculares (Figura 6). Grabación simultánea emparejado parche de la varicosidad presináptica y postsináptica célula muscular (Figura 7) muestra las corrientes presinápticos entrada y de salida asociados con la liberación de neurotransmisores y resulta elnt excitatorios postsinápticos corrientes.
Figura 1 A:.. Par Cría de ranas en balde apareamiento encima de la pantalla B: Ranas en amplexus con huevos fertilizados.
Figura 2 A:. B "adecuado" etapa embrionaria 22:. "Inadecuado" etapa 28 embriones. La barra de escala representa 1 mm.
Figura 3 A:. Stage 22 embriones antes de la extracción de la membrana vitelina y la capa de gelatina. La flecha apunta hacia el borde exterior de la capa gelatinosa. La membrana vitelina se adhiere estrechamente a la EMBRyo y es virtualmente invisible B:. embrión desnudo. La barra de escala representa 1 mm.
Figura 4: Etapa 22 embriones con una línea discontinua indica a ser diseccionado parte B:.. Porción dorsal agudo aislado de embriones, "d" y "v" se refieren a las caras dorsal y ventral de los embriones, mientras que "m" y "n" indican la ubicación aproximada de las mytomes y el tubo neural C:. "montón de arena" de las células después de 60 minutos en CMF. La barra de escala representa 1 mm para A, y 0,5 mm para B y C.
Figura 5 A:. Vista potencia 5x de células en cultivo inmediatamente después de placas. B: la misma cultura a 40x. Escalabarra representa 40 micras para A, y 5 micras para B.
Figura 6. Unión neuromuscular en cultivo con identificación de soma neuronal (S), varicosidades presináptica (V), y células del músculo postsináptico (M). Barra de escala: 5 m.
Figura 7. Presinápticos (parte superior) y postsinápticos (inferior) corrientes observadas en respuesta a la aplicación de voltaje de 10 mV incremental de pasos presentados a la variz presináptica de -30 mV a +40 mV. Pasos de voltaje se indican junto a algunas de las huellas presinápticos. El potencial de mantenimiento para ambas células fue -70 mV.
Discussion
Los pasos clave en el éxito de co-cultivo de las neuronas motoras y las células musculares son el uso de etapas apropiadamente embriones producidos a partir de la reproducción inducida de ranas Xenopus, y la cuidadosa disección aséptica de las neuronas espinales y mioblastos indiferenciados. Los huevos fertilizados se debe dejar reposar hasta que alcancen aproximadamente etapa 10 más o menos como en movimiento se detiene antes a menudo su desarrollo. Los embriones sanos se identifican por un aspecto suave y un color marrón y coloración blanco moteado. Etapa 22-24 embriones son las más útiles porque este es el punto durante el desarrollo justo después del cierre del tubo neural y antes de que los miocitos se han diferenciado significativamente. Además, las células de los embriones no mayores de disociar bien en CMF. Se debe tener cuidado al retirar la membrana vitelina, ya que se adhiere fuertemente al embrión. La membrana debe ser desgarrado utilizando pinzas cortantes para que el embrión emerge intacto. Otra importante precaution es cuidadosamente colocar las células en la parte inferior de la placa de cultivo (en lugar de dejar que establecerse allí). Este método es preferido ya que esto aumenta la probabilidad de que las células se adhieran a la placa de cultivo.
Neurotransmisión funcional entre el nervio y el músculo se puede determinar con la grabación sólo postsináptica y, a menudo se puede determinar mediante la observación de la contracción muscular espontánea después de inervación. Un-inervados células musculares no crisparse en la cultura. Grabación Postsináptica solo es útil para grabar las corrientes de placa terminal en miniatura o potenciales, pero las mediciones de liberación provocada requiere estimulación presináptica, y la correlación de las corrientes de pre y postsinápticos requiere doble patch-clamp.
Además del método de grabación de dos a dos parche descrito aquí, esta preparación ofrece la oportunidad de introducir una pipeta tercero en el soma neuronal 5 Esto permite la generación de un potencial de acción THAt se puede propagar a la variz presináptica y conducir a la liberación de neurotransmisores. Además, los agentes putativos que se cree que mediar o modular la transmisión sináptica puede ser introducido en cualquiera de los lados de la sinapsis a través de la pipeta célula muscular o a través de la difusión desde una pipeta tercero colocado en el soma.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Financiado por la NSF (0854551).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||
| Insulin-Transferrin-Selenium | Sigma | I1884 | |||||||||||||||
| Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG-10 | |||||||||||||||
| Vapor Pressure Osmometer | Wescor | 5100C | |||||||||||||||
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |||||||||||||||
| Amphotericin B | Sigma | A4888 | |||||||||||||||
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |||||||||||||||
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Table 1. |
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References
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