Summary
Zebrafisk er en voksende system til modellering af humane forstyrrelser i skeletmuskulatur. Vi beskriver en hurtig og effektiv metode til at isolere skeletmuskulaturen myofibre fra embryonale og larve zebrafisk. Denne metode giver en høj densitet myofiber forberedelse egnet til undersøgelse af enkelt skeletmuskulatur fiber morfologi, protein subcellulære lokalisering, og muskel fysiologi.
Abstract
Zebrafisken har vist sig at være en værdifuld model for at udforske skeletmuskulatur funktion og for at studere humane muskelsygdomme. Trods de mange fordele ved in vivo-analyse af skeletmuskel i zebrafisk, visualisere komplekset og fint struktureret protein miljø ansvarlige for muskelfunktion, især i hele embryoner, kan være problematisk. Denne hindring stammer fra den lille størrelse af zebrafisk skeletmuskulatur (60 um) og den endnu mindre størrelse af sarkomer. Her beskriver vi, og vise en enkel og hurtig metode til at isolere skelet myofibre fra zebrafisk embryoner og larver. Vi har også omfatter protokoller, som illustrerer efterfølgende forberedelse teknikker er nyttige til analyse muskel struktur og funktion. Konkret har vi detalje den efterfølgende immuncytokemiske lokalisering af skeletmuskulaturen proteiner og kvalitativ analyse af stimuleret calcium frigivelse via live celle calcium imaging. Samlet set denne videoartikel giver en ligetil og effektiv fremgangsmåde til isolering og karakterisering af zebrafisk skelet myofibre, en teknik, som tilvejebringer en ledning for myriader efterfølgende undersøgelser af muskel struktur og funktion.
Introduction
Skeletmuskel er en højt specialiseret væv er ansvarlig for generering af kontraktile nødvendige styrker til motilitet. Sammentrækning initieres gennem en proces, der kaldes excitation-kontraktion (EF) kobling, der konverterer elektriske signaler til calcium frigivelse fra intracellulære lagre 1,2. Intracellulært calcium release aktiverer sarkomer at afkorte og generere kraft. De mange specifikke komponenter af molekylære maskineri forestår formidlingsarbejdet neuromuskulær transmission 3, EF kobling 4,5, og actin-myosin afhængige sammentrækninger 6 fortsat være den løbende genstand for intens forskning. Endvidere har proteiner, der stabiliserer muskelmembranernes under sammentrækning 7,8 og som medierer signalering mellem myofiber og den ekstracellulære matrix 7,9 blevet identificeret og undersøgt i detaljer.
Mutationer i en række gener, der er vigtige for muskel struktur ennd funktion er blevet identificeret som årsag til human skeletmuskulatur sygdomme ( http://www.musclegenetable.org/ ). Disse sygdomme, klassificeret bredt som skelet muskellidelser og muskeldystrofier baseret på kliniske og histopatologiske funktioner, der er forbundet med muskelsvaghed, livslang invaliditet og tidlig dødelighed 10,11. Zebrafisken har vist sig at være en fremragende system til modellering og studere human skeletmuskulatur sygdomme 8,12,13. Det er blevet ansat til at validere nye genmutationer 8, definere nye aspekter af sygdommen patofysiologi 14,15, og identificere nye terapeutiske tilgange 15,16. Den effekt af zebrafisk til at studere menneskelig muskelsygdom vedrører det store antal afkom, den hurtige udvikling af muskel struktur og funktion, den optiske klarhed zebrafisk foster, og den lethed af genetiske og farmakologiske manipulation af udviklingslandene zebrafisk 17.
Vi og andre 12,18,19 har for nylig udviklet en simpel teknik til hurtig og effektiv isolering af myofibre fra udviklingslandene zebrafisk. Denne metode har muliggjort en undersøgelse af myofibre nærmere, end der kan ydes af hele embryo analyse. Teknikken har været udnyttet til karakterisering af protein subcellulære lokalisering 20, samt til identifikation af vigtige histopatologiske karakteristika som en del af valideringsundersøgelser i nyudviklede sygdomsmodeller 21. Desuden kan isolerede myofibre desuden bruges til direkte billedvisning og elektrofysiologiske studier 22, teknikker, der giver mulighed for afhøring af centrale aspekter af muskelfunktion. Den specifikke protokol for myofiber isolation, sammen med to eksempler på efterfølgende analytiske eksperimenter, er nærmere beskrevet i den resterende del af dette manuskript.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Fremstilling af poly-L-lysin Coated Dækglas (tid: 1 time)
Coating dækglas giver mulighed for hurtig myofiber bosættelse og vedhæftning. Dette kan udføres under dissociation trin af myofiber isolation (trin 2 nedenfor).
- Klip og placere Parafilm på bunden af en 60 mm petriskål (alle mærker).
- Placer mikroskop dækglas glider (12 mm diameter) på Parafilm i en 60 mm vævskulturskål eller placere dem enkeltvis i enkelt brønde af 24-brønds plader.
Note 1: Disse små runde dækglas med til at koncentrere myofiber numre og reducere overskydende antistof brug.
Note 2: Andre størrelse dækglas vil arbejde, men vil mængden af reagenser og embryoner, der anvendes skal justeres i overensstemmelse hermed.
- Pipetter 50-200 ul af poly-L-lysin opløsning (0,01%) på hver dækglasset i petriskålen.
- Tillad dækglassene sidde mindst en hour ved 37 ° C. Længere inkubationer ikke har en negativ indflydelse på resultatet.
- Fjern poly-L-lysin løsning fra dækglasset og vaskes to gange med et minimum på 100 ul 1x PBS.
- Tillad dækglas tørre.
- Dækglas er nu klar til myofibre.
Note 3: For at sikre sterilitet, kan belægningen gøres på en hætte og autoklaveres dækglas.
Note 4: Hold 60 mm petriskål med Parafilm på bunden. Denne opsætning vil blive brugt i løbet af myofiber yderklædningen og immunolabeling (senere trin).
Alternativ 1: I stedet for belægning dækglas umiddelbart før brug, en belagt dækglas bestand kan bruges. En 60 mm petriskål, der indeholder mindst 2 ml poly-L-lysin kan opbevares ved 4 ° C, indeholdende mange dækglas. Med dette alternativ starte på trin 1.5 til at behandle dækglas for myofibre.
Alternativ 2: Vi har også pels dækglas i poly-L-ornithin. Thans er mere arbejdskrævende, men er nyttig for længere sigt dyrkning fordi poly-L-ornithin belagte dækglas kan være UV behandlet. Med UV-behandling og omhyggelig steril teknik levende myofibre typisk kan opretholdes i kultur fra 4-7 dage.
2. Dissociation af zebrafisk embryoner og plettering af myofibre (Time: 1 til 3 timer)
Bemærk: standard protokol gælder bedst til 3 dpf (dage efter befrugtning) embryoner.
- Overfør zebrafisk embryoner i en standard 1,5 ml centrifugeglas, og fjerne så meget overskydende fisk vand som muligt. Typisk kan der anvendes 10-20 embryoer pr rør, selvom mindre. Brug af mere end 20-25 embryoer ofte resulterer i et præparat af overdreven tæthed.
- Fjern chorions før dissociation, manuelt ved hjælp # 5 pincet. Alternativt er kemisk chorion fjernelse opnås med en 10-15 min pronase behandling. Typisk er kun nødvendig den tidligere fjernelse af chorion når forudgående bekræftelse af en mutant fænotype eller morfologi er påkrævet, eller ved brug af etaper, hvor embryoner er naturligt udklækket fra deres chorion.
- Tilføj 900 pi CO 2 uafhængige medier til røret indeholder embryoner.
- Tilsæt 100 ul kollagenase type II, endelig koncentration 3,125 mg / ml (Stock collagenaseopløsning på 31,25 mg / ml fortyndet i 1x PBS) for at begynde dissociation. Collagenase IV kan også anvendes til dissociation.
- Drej embryoner på en orbitalryster og tritureres hver 30 minutter ved stuetemperatur under anvendelse af en P1000 Pipetman for triturering.
Note 2: Nøje overvåge foster dissociation, over eller under dissociation (især over) er de mest almindelige årsager til protokol fiasko. Tider til nedbrydning vil variere afhængigt af intensiteten af triturering antal embryoner pr rør og alder af embryoner. Det er også ofte mindre (i forhold til vilde typer) for embryoner fra skeletmuskulatur mutanter.
Bemærk3: Gennemsnitlig fordøjelse tid pr embryo alder: 1 dpf = 1 time, 2 dpf = 1,5 timer, 3 dpf = 2 timer og 4 dpf = 2-2,5 time.
- Stop fordøjelse når der ikke hele embryoner er synlige, men alligevel solide stykker er stadig synlige - det er vigtigt at forhindre overspaltning.
- Centrifugerør med dissocierede embryoner på 0,8-2,3 xg i 3-5 min til pellet celler.
- Fjern supernatanten fra pelleterede celler og vask 2x med CO 2 uafhængige medier.
- Tilføj frisk CO 2 uafhængige medier for at resuspendere cellerne. 1 ml anvendes typisk til preps på 10-20 embryoner. Lydstyrken kan skaleres baseret på embryo-nummer.
- Ved hjælp af en P1000 pipette passere embryo suspensionen gennem et 70 um filter. Dette hjælper med at fjerne uønsket snavs fra prep.
Note 4: Embryo Suspensionen kan filtreres en anden gang gennem en 40 um filter for yderligere at fjerne uønskede rester. Fra et dobbelt filtrering, opsving er approximbart 800 ul fra en start volumen på 1 ml.
- Tilsæt ca 50-100 ul myofiber suspension til hver poly-L-lysin belagt dækglas.
Note 5: Udfør trin 2.9 i petriskåle med Parafilm på bunden, tidligere fremstillede. Parafilmen holder myofiber suspension løbe fra de belagte dækglas. Hold petriskåle dækket for at forhindre fordampning.
- Tillad myofibre at afvikle ca 1 time på de coatede dækglas ved stuetemperatur.
Note 6: myofibre vil begynde at slå sig ned i 5-10 min. For god myofiber vedhæftet fil, er et minimum på 1 time (1-2 timer) anbefales dog. Tillade myofibre at bosætte sig i længere tid, vil ikke skade prep. Ved længere inkubationer (herunder natten over), kan antibiotika hvormed medierne. Med antibiotika og steril teknik levende kulturer kan typisk opretholdes i 1-2 dage.
- Live-myofibers kan observeres på dette punkt. Myofibre fra embryoner 2 dpf og senere vil blive set som tværstribet og aflange celler (Figur 1). På dette tidspunkt myofibre er nu klar til levende analyse eller immunolabeling.
Note 7: Skeletmuskel fra 1. dpf embryoner ikke plade som aflange og tydeligt tværstribede fibre. I stedet store myoballs er synlige. Desuden under pelletering fase efter dissociation (trin 2.6), 1 dpf myoballs skal centrifugeres i mindst 8 minutter ved 5.000 x g for at opnå en pellet. Til analyse af embryoner på dette tidspunkt, anbefales det at anvende den transgene linje udtrykker EGFP specielt i skeletmuskulatur 23. Dette vil gøre det muligt at identificere celler fra muskel oprindelse i forhold til andre kilder.
3. Fluorescens Immunfarvning af Dissocierede Zebrafisk myofibre (Time: ca 1 dag)
3.1. Immunolabeling
- Fjerne en del afmedier fra myofibre klæbet til den coatede dækglas
- Lave celler under anvendelse af 4% paraformaldehyd eller methanol. For PFA fjerne ½ mængden af medier og erstatte med den samme mængde PFA. Fix i 10 min ved RT, og fjern derefter samlede volumen, erstatte med 50-100 pi PFA, og fastsætte yderligere 10 min. For alkohol fiksering iskold methanol eller acetone kan anvendes ved 4 ° C i 10 minutter eller 5 min hhv.
- Vask myofibre mindst 3-5x med 1x PBS eller 1x PBS plus 0,1% Tween. Gennemsnitlig vaskevolumen er 50-100 ul pr dækglas.
- Læg blokerende opløsning til myofibre (arbejdslager) og inkuberes 20-60 minutter ved stuetemperatur. Blokerende opløsning vil variere afhængigt af de primære og sekundære antistoffer. De to mest almindelige, der anvendes i laboratoriet, er (1) 1x PBS, 2 mg / ml BSA, 1% fåreserum, 0,25% Triton X-100 endelig og (2) 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml (0,2 % BSA) og 5% fåre / gedeserum.
- Fjern blokerende opløsning og tilføje en primær antistof fortyndet i enten blåsning opløsning eller PBS. Inkuber myofibre natten over ved 4 ° C. Sørg for at hverken Parafilm eller wrap i Saran wrap petriskålen indeholdende myofiber-loaded dækglas overtrukket med antistof. Små stykker af fugtet køkkenrulle kan tilføjes for at skabe et fugtigt kammer.
- Fjern primært antistof fra dækglas og vaske dækglas 3-5x i 5 min med PBS eller blokerende opløsning.
- Tilføj sekundært antistof ved passende koncentration fortyndes i 1x PBS eller blokeringsopløsning i 1-2 timer ved stuetemperatur.
- Fjern sekundær antistof og vask myofibre 3-5x i PBS i 5 minutter hver ved stuetemperatur.
3.2. Montage dækglas
- Påfør 1-2 dråber antiblegemiddel reagens til et objektglas.
- Pick-up forsigtigt belagt og immunolabled dækglas med pincet og sted (myofibre ned) dækglasset på antiblegemiddel reagens på mikroskopobjektglasset.
Note 1: Opmærksomhed på orientering af coated dækglas er kritisk.
- Læg 1-2 Kimwipes på en hård fast overflade. Hurtigt invertere slide med de belagte dækglas hvilende på antiblegemiddel reagens og placere den (dækglas ned) på Kimwipes.
- Påfør let tryk til hjørner af objektglasset for at fjerne overskydende antiblegemiddel og danne en tæt forsegling mellem dias og dækglasset
- Tillad det antiblegemiddel resterende tørre i 5-10 minutter ved stuetemperatur, derefter myofibre er klar til billede (figur 2A og B) eller opbevares ved 4 ° C.
4.. Live-Cell Calcium Imaging Brug GCaMP3
Levende celle eksperimenter kan udføres på myofibre før fiksering (følgende trin 2.10). Følgende protokol beskriver levende billeddannelse i myofibre udtrykker GCaMP3 24, en genetisk kodet calcium indikator, udtrykt ved skeletmuskelspecifikt zebrafisk α-actinpromotor (pSKM) 23. Alternativtdenne teknik let kan tilpasses til at bruge calcium indikatorfarvestoffer såsom Fura-2.
- Injicere embryoner med pSKM: GCaMP3 konstruere på 1-2 cellestadium
- Ved 3 dpf, indsamle larver og forberede myofibre som beskrives i afsnit 1 og 2. Tillad myofibre at holde i mindst 1 time. Til denne teknik, forbereder dækglas i 24-brønds skåle påkrævet.
- Fjern omhyggeligt overskydende medier og tilføje 300 pi frisk CO 2 uafhængige medier ved RT.
- Overhold celler under et inverteret mikroskop. GCaMP3 positive myofibre skal være synlig under grøn fluorescens.
- Opsætning kamera til optagelse, hvis det ønskes.
- Forbered en 30 mM koffein løsning i CO 2 uafhængige medier. For at stimulere celler, blidt pipette 300 pi koffein løsning i brønden under forstørrelse. Indenfor 5-10 sek bør GCaMP positive myofibre reagere på koffein med en hurtig stigning i fluorescens (figur 3). Myofibers kan også kontrakt. Notatet, koffein inducerer calcium frigivelse fra sarkoplasmiske reticulum butikker 25. Andre midler, såsom KCI 26 og ryanodine 4, kan anvendes til at studere inducerbare calcium release.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorescerende immunmærkning af myofibre (figur 2)
Billeder, der viser forventede fluorescerende mærkning mønster fra myofibre immunofarvede efter vellykket isolering og plettering. De myofibre er blevet mærket med enten anti-ryanodine receptor (1:100) (figur 2A) eller anti-α-actinin (1:100) (figur 2B) antistoffer og viser immunfarvning af triaden og Z-båndet hhv. Sekundære antistoffer blev anvendt, var Alexa Fluor 555 (1:500). Billeder taget med konfokal mikroskopi.
Induceret calcium frigivelse fra en myofiber (figur 3)
Panel-serie viser den repræsentative calcium frigivelse fra en isoleret myofiber behandlet med koffein. Kort fortalt blev zebrafisk embryoner injiceret på den ene celle scenen med pSKM: GCaMP3 konstruktion. Ved 3 dpf blev embryoner dissocieret og udpladet som beskrevet i PRotocol. Til analyse blev GCaMP3 udtrykker myofibre valgt, som indikeret ved tilstedeværelsen af grøn fluorescens ved baseline. Med en mikropipette for drug administration, blev den valgte fiber badet i en 30 mM koffein løsning til at fremkalde calcium udgivelse. Videooptagelse blev startet før koffein ansøgning og fortsatte indtil peak fluorescens blev nået. Denne figur viser normal koffein-induceret calcium frigivelse, og teknikken kan bruges til at afhøre excitation-kontraktion kobling apparat via live billedbehandling.
Figur 1. Skematisk Tidslinje for Embryo Dissociation. Successive paneler (top til bund) illustrere de enkelte trin, timing og udstyr, der kræves for embryo dissociation. A) Valg af embryoner til dissociation. Skala bar 500 um. B) Jegmage af dissociation setup. Fostre er i medier og collagenase samtidig være drejes, indtil tilstrækkeligt dissocieret (Protokol trin 2) C) Billede af begge myofiber plating teknikker. Runde dækglas eller 24 brønde (Protokol trin 1 og 4, henholdsvis) D) En lys-felt. Billede af levende dissocierede zebrafisk myofibre belagt på poly-L lysin coatede dækglas. Pile angiver aflange myofibre fra 48 HPF zebrafisk. Scale bar 30 pm.
Figur 2. Immunolabeling af individuelle myofibre isoleret fra 48 HPF zebrafisk embryoner. A) Myofiber mærket med anti-ryanodine receptor (RYR1), afslører en stribede mønster langs fiberen i overensstemmelse med lokalisering til treklangen / EF kobling apparat. B) Myofiber mærket med anti-α -actinin, visualizin g riller (rød) langs myofiber lokalisere til sarkomeret og fremhæve de Z bånd. I begge billeder er kerner mærket med DAPI, ses som blå ovaler. Skær viser højere forstørrelse billeder af myofiber i det store billede. A) og B) Målestokken 30 um.
Figur 3. Repræsentant induceret calcium frigivelse svar fra en enkelt isoleret zebrafisk myofiber. Alle paneler viser en pseudocolored zebrafisk myofiber udtrykker GCaMP3. Tidsforløbet viser stigningen i GCaMP3 fluorescens (rød farve) som reaktion på anvendelse af 30 mM koffein. Optagelse startede før koffein ansøgning (0 ms) og fortsatte med at maksimal fluorescens respons (992 ms). Scale bar 30 pm.nk "> Klik her for at se større figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafisk er en kraftfuld hvirveldyr model system til at studere muskel udvikling og funktion in vivo 25,27,28. De har også vist sig som et værdifuldt aktiv for modellering af menneskelige muskelsygdomme 14,15,20,29. Selv om der er taget store skridt til at fremme brug og anvendelse af zebrafisk for studiet af muskel funktion og muskel sygdom, der er en konstant kritisk behov for at udvikle værktøjer, der vil give mere tilbundsgående analyse, komplimenter genetiske, morfologiske, adfærdsmæssige og funktionelle fordele zebrafisk tilbyder allerede 17. Vi har derfor tilpasset og udviklet en enkel og robust teknik til karakterisering af zebrafisk myofibre fra dissocierede hele embryoner.
Brugen af de enkelte myofibre er hverdagskost i undersøgelser, hvor musemodel system. Hos mus har dette tilladt for undersøgelser og analyser, der er upraktisk eller umuligt i hele dyr, inklusiveding subcellulære protein lokalisering undersøgelser 30, live cell imaging 31, og elektrofysiologiske målinger 32. I zebrafisk, har lignende dissociation teknikker tidligere blevet udviklet til specifikt at identificere og undersøge motoriske neuroner 33 samt Rohon-Beard sensoriske neuroner 34, og disse teknikker har gjort det muligt detaljeret analyse af disse neuron undertyper.
Den brede anvendelighed af isolerede myofibre, kombineret med de mange unikke fordele for zebrafisk tilbyder som et hvirveldyr model 17, er det, der motiverede os til at udvikle en teknik til at isolere og karakterisere embryonale og larvernes zebrafisk myofibre. Vi har brugt isolerede myofibre i tidligere undersøgelser for at fastslå subcellulære lokalisering af muskelproteiner 20,21, for at studere lokalisering af chimerically udtrykte transgener 35 og at fastlægge særlige myofiber parametre, herunder især størrelse
Grabner og kolleger har også brugt myofiber systemet til stor succes 19,22,36. De er den eneste gruppe at rapportere langvarig dyrkning af isolerede fibre. Desuden har de været i stand til at bruge fibrene til at måle de elektrofysiologiske egenskaber af musklen. Specifikt har de testede virkningerne af tab af beta-underenheden af dihydropyridin-receptoren på calcium frigivelse og måles evnen af et sæt af transgener til at redde sikkerhcts i denne udgivelse. Disse undersøgelser belyse nogle af de meget kraftige mulige anvendelser af isolerede myofibre.
En anden gruppe til at indberette brugen af myofiber prep for at studere muskel sygdom er Nixon et al. Der brugte myofibre at undersøge virkningen af morfolino medieret caveolin 3 knockdown på muskel udvikling og muskel struktur 18. Disse forfattere ikke kun undersøgte parametre ved lysmikroskopi, men også undersøgt fibrene ved hjælp af elektronmikroskopi. Deres arbejde identificerer endnu en anden fordel af den isolerede myofiber system: evnen til at undersøge ultrastrukturen af myofiber isoleret og kontrolleret indstilling.
Disse undersøgelser, sammen med vores arbejde, pege på den potentielle vidtrækkende nytte af denne teknik. Yderligere programmer er sikker på at blive udviklet, såsom måling af hurtige calcium pigge hjælp indikatorer såsom Fura-2. Derudover dette præparat giver mulighed for at observe elektrisk aktivitet, som handling potentialer via spænding følsomme farvestoffer (Di-4-ANEPPS) eller direkte elektrofysiologiske optagelse. Det synes klart, at alle de nuværende teknikker, der anvendes på murine myofibre bør gælde for zebrafisk myofibre. Hertil kommer, at evnen til at udtrykke forskellige transgener i udviklingslandene zebrafisk, samt tilgængeligheden af et stort og voksende antal af transgene zebrafisk udtrykke forskellige markørproteiner ( www.zfin.org ) tilføjer et ekstra lag af kompleksitet og anvendelighed til system. Vi demonstrere dette faktum med myofibre kulturperler fra GCaMP3 udtrykker zebrafisk, hvor vi udnytter evnen til at udtrykke GCaMP3 i musklen for at studere induceret calcium imaging i realtid i isolerede fibre (Figur 3).
Som med de fleste teknikker, er der også nogle klare begrænsninger for isolerede myofiber system. Disse problemer er i tillæg til stativetard mangler at studere en celletype in vitro, der fungerer som en tredimensionel syncytia in vivo og at udføre elektrofysiologiske eksperimenter med ikke-fysiologiske stimuli. Ved hjælp af vores metode, man ikke er i stand til at opnå en ren forberedelse af myofibre. Dette er ikke et problem for immunfarvning eller elektrofysiologiske målinger, men det er til hinder for visse eksperimentelle tilgange. For eksempel har vi endnu til at bestemme en egnet metode til at identificere en ren population af myofibre for transkriptom analyse. Vi har forsøgt FACS sortering af GFP udtrykker myofibre efterfulgt af myofiber forberedelse, men det har ikke resulteret i en ren kultur med et passende antal myofibre til enten RNA eller protein analyse.
En anden udfordring er den langsigtede dyrkning af myofibre. Vi har været i stand til at holde kulturer i cirka 24 timer, og Grabner og kolleger rapporterer et præparat, der har været suitaBle til flere dage af eksperimenter 19. Udfordringen i forbindelse med dette aspekt af teknikken forhindrer forurening, som disse kulturer (meget gerne murine myofiber preps) er ofte svært at holde sterile. Der er behov for stor omhu, hvis man skal forsøge langvarige kulturer. Vi anbefaler også brugen af antimikrobielle stoffer, herunder svampemidler.
I alt viser vi en praktisk metode til isolering af zebrafisk myofibre samt omrids, hvordan man udfører fluorescerende immunolabeling og tidstro calcium imaging på isolerede præparater fiber. Fortsat ændring og udvikling af denne teknik vil tilbyde et stadigt voksende repertoire af redskaber til at eksperimentere på specifikke, isolerede celletyper i zebrafisk. Ved at adskille zebrafisk embryoner til isolerede individuelle myofibre, kan vi yderligere styrke vores forståelse af muskel udvikling, funktion og sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen modstridende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke medlemmerne af Dowling lab (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, og William Telfer), der bidrog til udviklingen af teknik og produktion af manuskriptet. Dette arbejde blev finansieret af Taubman Institute, Department of Pediatrics ved University of Michigan, og dels fra tilskud fra Muskelsvindfonden Association (JJD MDA186999) og National Institutes of Health (JJD 1K08AR054835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well culture plate | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 Independent medium | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004186 | Lot 41H12764 |
| Collagenase Type IV | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Sheep serum | Sigma | S3772 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Glass coverslips | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Pronase | Sigma | P5147 | |
| 40 μm Filter | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μm Filter | BD Biosciences | 352350 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36931 | |
| Anti-α-Actinin antibody | Sigma | A5044 | |
| Anti-RYR antibody | Abcam | 34C | |
| Alexa Fluor antibody | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| 60 mm Petri dish | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Microscope slide | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| Caffeine | Sigma | C0750 |
References
- Dulhunty, A. F. Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).
- Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal muscle excitation-contraction coupling. J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 275-283 (2007).
- Ohno, K. Genetic defects and disorders at the neuromuscular junction. Brain Nerve. 63, 669-678 (2011).
- Lanner, J. T., Georgiou, D. K., Joshi, A. D., Hamilton, S. L. Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
- Sparrow, J. C., Schock, F. The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 293-298 (2009).
- Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ. Res. 94, 1023-1031 (2004).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Barresi, R., Campbell, K. P. Dystroglycan: from biosynthesis to pathogenesis of human disease. J. Cell Sci. 119, 199-207 (2006).
- Emery, A. E. Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-a world survey. Neuromuscul. Disord. 1, 19-29 (1991).
- Nance, J. R., Dowling, J. J., Gibbs, E. M., Bonnemann, C. G. Congenital myopathies: an update. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 165-174 (2012).
- Bassett, D. I., Currie, P. D. The zebrafish as a model for muscular dystrophy and congenital myopathy. Hum. Mol. Genet. 12, 265-270 (2003).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 252-256 (2000).
- Dowling, J. J., et al. Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5, (2009).
- Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5331-5336 (2011).
- Detrich, H. W., Westerfield, M. 3rd, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
- Nixon, S. J., et al. Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning. Hum. Mol. Genet. 14, 1727-1743 (2005).
- Schredelseker, J., et al. The beta 1a subunit is essential for the assembly of dihydropyridine-receptor arrays in skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17219-17224 (2005).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis. Model Mech. 5, 389-396 (2012).
- Dowling, J. J., Low, S. E., Busta, A. S., Feldman, E. L. Zebrafish MTMR14 is required for excitation-contraction coupling, developmental motor function and the regulation of autophagy. Hum. Mol. Genet. 19, 2668-2681 (2010).
- Schredelseker, J., Dayal, A., Schwerte, T., Franzini-Armstrong, C., Grabner, M. Proper restoration of excitation-contraction coupling in the dihydropyridine receptor beta1-null zebrafish relaxed is an exclusive function of the beta1a subunit. J. Biol. Chem. 284, 1242-1251 (2009).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Dev. Biol. 192, 289-299 (1997).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhou, W., et al. Non-sense mutations in the dihydropyridine receptor beta1 gene, CACNB1, paralyze zebrafish relaxed mutants. Cell Calcium. 39, 227-236 (2006).
- Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6529-6534 (1997).
- Hirata, H., et al. accordion, a zebrafish behavioral mutant, has a muscle relaxation defect due to a mutation in the ATPase Ca2+ pump SERCA1. Development. 131, 5457-5468 (2004).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum. Mol. Genet. 20, 1712-1725 (2011).
- Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle. J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).
- Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres. J. Physiol. 564, 451-464 (2005).
- Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs. Nature. 346, (1990).
- Sakowski, S. A., et al. A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture. J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).
- Nakano, Y., et al. Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation. Development. 137, 1689-1698 (2010).
- Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
- Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).
