Conception d'un robot Bio-sensible de l'ADN origami

Summary

ADN origami est une puissante méthode pour fabriquer des objets nanométriques précis en programmant l'auto-assemblage de molécules d'ADN. Ici, nous décrivons comment l'ADN origami peut être utilisé pour concevoir un robot robotique capable de détecter des signaux biologiques et répondre par changement de forme, puis relayés à un effet désiré.

Abstract

Les acides nucléiques sont étonnamment polyvalent. En plus de leur rôle naturel comme support de stockage pour l'information biologique ^1, ils peuvent être utilisés dans le calcul parallèle ^2,3, reconnaissent et se lient cibles moléculaires ou cellulaires ^4,5, catalyser des réactions chimiques ^6,7 et génèrent des réponses calculées dans un biologique système ^8,9. Surtout, les acides nucléiques peuvent être programmés pour s'auto-assembler en structures 2D et 3D ^10-12, permettant l'intégration de toutes ces caractéristiques remarquables dans un seul robot reliant la détection d'indices biologiques pour une réponse prédéfinie afin d'exercer un effet désiré.

Création de formes à partir d'acides nucléiques a été proposée par Seeman ^13, et plusieurs variations sur ce thème ont depuis été réalisé en utilisant diverses techniques ^11,12,14,15. Cependant, le plus important est peut-être celui proposé par Rothemund, appelée échafaudage ADN origami16. Dans cette technique, le pliage d'une longue (> 7000 bases) de l'ADN simple brin «échafaudage» est dirigé vers une forme désirée par des centaines de brins complémentaires courtes appelées «agrafes». Le pliage est effectué par une rampe de température de recuit. Cette technique a été démontrée avec succès dans la création d'un large éventail de formes 2D avec une remarquable précision et de robustesse. ADN origami a ensuite été étendu à la 3D ainsi ^17,18.

Le présent document mettra l'accent sur ​​le logiciel caDNAno 2.0 ¹⁹ développé par Douglas et ses collègues. caDNAno est un outil de CAO robuste, convivial permettant la conception de 3D ADN origami formes 2D et avec des fonctions polyvalentes. Le processus de conception repose sur un schéma d'abstraction systématique et précise des structures d'ADN, ce qui en fait relativement simple et efficace.

Dans cet article, nous démontrons la conception d'un origami na ADNnorobot qui a été récemment décrit ^20. Ce robot est «robotique» dans le sens qu'il relie à l'actionnement de détection, afin d'effectuer une tâche. Nous expliquons comment différents systèmes de détection peuvent être intégrés dans la structure, et comment cela peut être relayé à un effet désiré. Enfin, nous utilisons Cando ²¹ pour simuler les propriétés mécaniques de la forme conçue. Le concept que nous discutons peut être adapté à de multiples tâches et réglages.

Protocol

Le robot nous allons concevoir dans ce document fait suite à une protéine P en faisant un cargo C disponible pour se lier à des récepteurs sur la surface d'une cellule cible choisie. Le robot est illustré à la figure 1 C peut être un médicament bloquant les récepteurs;. Un facteur de croissance, etc, et un moyen de lier chimiquement à un oligonucléotide d'ADN doivent être disponibles qui ne détruit pas sa fonction. Le robot dispose de deux Etats. Lorsque, portes d'ADN inactifs sur les deux «lèvres» externes sont hybridées, en s'assurant que le robot reste fermée de sorte que toute la cargaison chargée en son sein est bien séquestré. En présence de la protéine P, les portes ouvertes soit par l'un des mécanismes (voir ci-dessous) qui permet au robot d'ouvrir et d'exposer la marchandise. Lors de la conception de la structure, considérer que le robot doit être assez souple pour fermer sur lui-même à l'état fermé, et ressort à l'état ouvert lorsque les portes lui permettre de le faire. La modélisation du comportement d'un ADN la structure thermodynamique intégration et composants mécaniques est difficile, et l'objet réel pourrait exiger une certaine amélioration itérative. Néanmoins, ici nous nous concentrons sur le processus de conception en utilisant un modèle de travail général, qui peut être mis à profit.

Remarque

Pour une compréhension plus complète du processus de conception origami ADN et de pliage, nous vous recommandons fortement de lire le journal caDNAno originale de Douglas et ses collègues ¹⁹ qui explique la représentation abstraite de l'ADN dans l'interface de conception et comment il se rapporte à la structure moléculaire réel d'un forme d'ADN 3D. Ce document est accompagné de deux didacticiels vidéo décrivant la représentation caDNAno et l'interface d'une manière très claire. En outre, nous vous recommandons la lecture du document plus récent de Dietz et ses collègues décrivent de nombreux aspects importants et protocoles détaillés du processus de pliage, y compris l'outil d'analyse Cando ^21.

TLE "> 1. Télécharger et installer caDNAno 2.0 et Autodesk Maya 2012

Remarque: le logiciel Autodesk est gratuit pour les étudiants et l'utilisation académique. Les instructions ci-dessous incluent la création d'un compte académique chez Autodesk.

1. Créer un compte académique à http://students.autodesk.com/ . Après réception de la configuration d'un compte e-mail, cliquez sur le lien d'activation et de remplir vos préférences comme souhaité.
2. Télécharger la version gratuite de Maya 2012 à partir du centre de téléchargement.
3. Installez Maya 2012 sur votre ordinateur.
4. Exécuter Maya fois avant d'installer caDNAno 2.0.
5. Téléchargez et installez la dernière version de caDNAno 2.0 de http://cadnano.org/ .
6. Exécuter Maya 2012. Une icône caDNAno devrait apparaître dans le coin supérieur droit de l'interface utilisateur graphique. Cliquez sur l'icône pour entrer dans caDNAno.

2. Outline la forme désirée et échafaudage chemin de Strand

1. L'interface de conception de caDNAno sein Maya comprend 3 panneaux (Figure 2):
   1. Panneau supérieur: vue du réseau, où la forme est d'abord décrit. Ce panneau permet actions Double Helix niveau et offre une vue en coupe de la forme.
   2. Panneau inférieur: panneau d'édition, permettant à de simples actions de niveau de base.
   3. Panneau de droite: un modèle 3D temps réel Maya généré de la forme
2. Cliquez sur l'icône "Honeycomb". Zoom sur et hors du réseau dans le panneau supérieur peut être fait par la souris défiler vers le haut et vers le bas, respectivement.
   caDNAno permet à deux réseaux de conception possibles, en nid d'abeille et carré, dans cet article, nous allons utiliser la disposition en nid d'abeilles, bien que le réseau carré pourrait être généralement utilisé comme puits ^22.
3. Commencez par dessiner la section de la forme désirée sur le panneau de gauche.
   Chaque cercle représente une double hélice d'ADN. Pour chOose les hélices qui construisent la forme, il suffit d'un clic gauche sur leur centre (Figure 3). Continuer hélice en hélice jusqu'à ce que la forme entière est décrite. Alternativement, la forme ne peut être tirée en appuyant sur le bouton gauche de la souris et en tirant continuellement le contour de la forme. Toute action peut être annulée en cliquant sur le menu Edition et "Annuler", ou par le raccourci clavier Ctrl + Z (PC) ou CMD + Z (Mac).
   À ce stade, les hélices sélectionnés apparaîtront jaune. Dans le même temps, le panneau du bas affiche une vue de côté de la forme, composé de ces hélices. L'hélice de numérotation dans le panneau inférieur est compatible avec la numérotation dans le haut.
4. Observez le panneau inférieur. Chaque hélice est représenté par deux rangées de places: les lignes sont les deux brins de la double hélice, chaque carré représentant une base (Figure 4).
   La barre verticale orange, détermine l'endroit où les actions d'édition ont lieu le long d'une hélice. La position de base le long de la grille apparaît queun certain nombre au dessus de la barre orange. La longueur par défaut de l'hélice cadre est de 42 bases. La durée peut être prolongée en cliquant sur l'une des icônes de flèche grise dans le coin supérieur droit du panneau d'édition et de choisir la longueur d'extension (en multiples de 21, qui correspondent à deux tours de l'hélice de l'ADN, dans lequel un tour s'étend sur 10,5 bases) (figure 4). L'grille s'étendra à la direction de la flèche choisie.
5. Pour tracer la trajectoire réelle du brin échafaudage tout au long de la forme, appuyez sur le bouton de la souris, commencez par la première hélice et aller en continu sur toutes les hélices en suivant le même ordre dans lequel ils ont été initialement sélectionnés dans la section 2.3. Notez que:
   1. Les hélices sélectionnés cette fois-ci change de couleur orange.
   2. Dans le panneau inférieur, fragments de brins d'échafaudage seront tirés automatiquement les hélices sélectionnées.
   3. Le panneau de droite affiche le modèle 3D de la forme en cours de construction en temps réel. A la fin de cetteprocessus, un projet de chemin de rame échafaudage sera établi automatiquement dans le panneau du bas (figure 5).
6. Tracez un rectangle autour de tous les bords les plus à gauche de la trajectoire échafaud. Notez que les bords afin sélectionnés apparaîtront rouge (Figure 6).
7. Étendre le chemin échafaudage en faisant glisser les arêtes sélectionnées comme un groupe sur le côté gauche de la grille. Répétez ce processus pour les bons bords jusqu'à ce que le chemin est correctement étendue. Notez que l'extension échafaud étend également la forme 3D dans le panneau de droite (figure 7).
8. Repérez les parties de chemin échafaudage qui sont isolés du reste, et de les relier. Dans notre forme, par exemple, hélices 0-9 former une partie isolée. Helix 9 doit être connecté à l'hélice 12 (à noter que les hélices 9 et 10 ne sont pas adjacentes à la forme [panneau supérieur] de sorte qu'ils ne peuvent pas être connectés).
9. Zoom sur les fils à connecter, et en utilisant l'outil "Sélection", cliquez sur n'importe quel point sur undes brins. En cliquant sur n'importe quel point le long d'un fragment d'échafaudage bleu, icônes «pont» apparaissent entre les hélices, indiquant les positions où croisements sont autorisés. Dans ces positions, bases hélices adjacentes s'affrontent directement, permettant aux brins de croiser plus de hélice à hélice sans déformation ou une torsion de l'ADN. Le numéro figurant à côté de chaque icône pont indique le nombre d'hélice il en croisé à (figure 8).
10. Pour créer crossovers, faites un clic gauche sur l'icône de pont de choix. Un croisement échafaudage sera généré, ce qui signifie l'échafaud traverse à ce moment de hélice à hélice (figure 9). Répétez ce processus jusqu'à ce que les traverses d'échafaudage toutes les hélices et crée une boucle fermée qui enjambe la forme entière, ne laissant aucun régions qui sont isolées du reste de la forme.
    Notez que si croisements semblent s'étendre sur une distance dans le logiciel, en réalité, ils ne comprennent pas toutes les bases de l'ADN. Physiquement, le crossover«Pont» comprend seulement une unité de phosphate du squelette de l'ADN qui relie les deux bases des hélices adjacentes ensemble.
11. Avant de passer à l'étape suivante, assurez-vous que l'ensemble échafaudage est continue, et aucune partie de celle-ci est isolée des autres.

3. Définir les axes d'ouverture du Mécanisme

Le robot décrit s'ouvre en réponse à une entrée biologique définie pour exposer sa charge utile. Ouverture s'effectue d'une manière en forme de coquille, avec deux moitiés (hélices 0-29 compenser la moitié, hélices 30-61 constituent le second semestre) s'articulant autour de deux axes. Les axes sont formés par des croisements entre les hélices 29-30 et 61-0, qui sont les seuls croisements entre ces moitiés et sont positionnés uniquement dans ou près du bord gauche de la grille. Le bord droit contiendra les brins de grille (voir ci-dessous).

1. Effacez le croisement existant entre les hélices 29-30. Pour effacer la liaison, cliquez sur le point de "genou" dans les deux brins.Cela laisse une entaille dans les deux volets où le crossover habitude d'être. Pour les pseudos couture, appuyez sur Maj et cliquez sur chaque pseudo.
2. Créer un nouveau crossover entre les hélices 29-30 aussi près que possible du bord gauche de la grille (Figure 10).
3. Créer un nouveau crossover entre les hélices 61 et 0 le plus près possible du bord gauche de la grille.

4. Définir les sites de fixation de charge utile

Après que nous ayons fini de tracer le chemin de rame échafaud, nous devons définir les sites de fixation de charge utile (chargement). Sites de chargement sont en fait des brins de base qui s'étendent hors de leurs hélices comme simples «branches» échoués. Il est donc important de définir très précisément là où le long de l'hélice cette ramification se produit, pour s'assurer qu'il s'étend dans la direction souhaitée. Si nous définissons les extensions de base arbitraire, lieux de chargement peuvent se produire sur le côté externe du robot à la place de la face interne.

To Assurez-vous un aliment de base s'étend à une direction spécifique seulement, nous traçons une hélice supplémentaire, qui sert de guide pour le branchement directionnel de la base du corps principal. Après l'extension du site chargement de base désiré, l'hélice de guidage est retiré.

1. Nous définissons 4 sites de chargement tournées vers le côté interne du robot. Les lieux de chargement seront ramifier d'hélices 3, 27, 34 et 58. Pour chaque site, dans la partie supérieure cliquez sur l'hélice à proximité immédiate de ces hélices qui fait face au côté interne (Figure 11). Cela va ajouter les hélices de la grille dans le panneau inférieur. Ne second-cliquez encore ces hélices.

5. Ajouter et modifier Staples

1. Cliquez sur "AutoStaple". Le logiciel va automatiquement ajouter des séquences de base de différentes couleurs (figure 12). Notez que les agrafes ont été ajoutés à la forme 3D dans le panneau droit. Couleurs de base sont conformes aux panneaux de fond et à droite. En additisur, il ya un indicateur dans le coin inférieur gauche de l'interface, ce qui indique une agrafe.
   Note: les agrafes ne peut pas être trop long, trop court ou circulaire. La plupart des agrafes généré ici ne répondent pas à ces critères, et doivent être modifiées. La première étape dans leur édition est automatique (voir étape suivante).
2. Cliquez sur "Interruption USB automatique". Une boîte de dialogue s'ouvre (Figure 13), demandant des paramètres définis par l'utilisateur pour cette action:
   1. longueur cible (pb): durée prévue de base si possible
   2. Distance min (pb): longueur minimale autorisée pour un aliment de base
   3. Longueur maximale (pb): longueur maximale autorisée pour un aliment de base
   4. Min dist à xover (pb): le nombre minimal de paires de bases d'un aliment de base peut parcourir entre son bord et un crossover ou entre deux crossovers.
      Utilisez les paramètres par défaut, cliquez sur OK. Le logiciel va casser les agrafes en fonction de ces paramètres au mieux de ses possibilités (Figure 14).
3. Effacez tous les croisements de base entre les hélices 29-30 et 61-0, pour permettre à ces hélices se séparent et permettent au robot d'ouvrir. Effacement des croisements de base, il faudra un peu de montage manuel pour agrafes corrects qui deviennent trop court ou irrationnelle à la suite de cette action. Pour ce faire correctement, suivez les instructions dans les sections suivantes.
   Assurez-vous de laisser les crossovers échafaudage créées dans les sections 3.2 et 3.3 intactes.
4. Considérons, par exemple, le premier crossover de base (cyan et noir agrafes) à partir de la gauche entre les hélices 29 et 30 (figure 15). Effacez les deux ponts de ce crossover en cliquant sur ​​chaque point du genou ou du pont de sorte qu'il apparaît en rouge, puis en appuyant DELETE (Figure 16).
5. Seam les deux agrafes sur hélice 29 en appuyant sur Maj et en cliquant sur le nick entre eux. De même, joint les trois agrafes sur fil 30 à une seule base (figure 17). Staples peutêtre étendue manuellement ou raccourci en cliquant sur un bord et glisser comme vous le souhaitez. Prenez soin de ne pas circularize toute base. Figure 18 montre l'écart entre les hélices 29-30 après l'édition complète de multisegments de base. Répétez ce processus pour hélices 0 et 61, et de modifier manuellement toutes les agrafes dans chaque hélice.
6. Localisez agrafes qui sont attirés par un trait épais, ce qui signifie qu'ils nécessitent une édition ultérieure. Examinez chacun et corriger si nécessaire. Par exemple, des agrafes qui sont trop courts peuvent être effacées (Figure 19) ou prolongées si possible.

6. Créer des lieux de chargement et portails

1. Second-cliquez sur le chargement hélices du site dans le panneau supérieur, et d'étendre les fragments de brins d'échafaudage qui en résultent dans le panneau de fond en cliquant sur ​​un bord et glisser comme vous le souhaitez (Figure 20).
2. Ajouter manuellement des agrafes de ces fragments d'échafaudage en plaçant la barre verticale orange sur la position désirée le long til échafaud, va sur les hélices de guidage sur le panneau de gauche, tenant SHIFT et en cliquant. Cela va ajouter un précurseur de base à chaque hélice (figure 21).
3. Étendre les précurseurs de base à pleine longueur ainsi en cliquant et glissant.
4. Repérez les icônes pont rouge, indiquant des positions de croisement autorisé entre le brin guide (par exemple, helix 62) et le châssis (par exemple, hélice 3).
5. Choisissez l'endroit le plus commode d'introduire un crossover et cliquez sur l'icône pont (Figure 22). Un emplacement idéal nécessite un minimum d'édition d'agrafes existants dans le châssis.
6. Dans l'hélice de guidage (hélice 62), supprimer l'élément de base qui n'est pas une partie de l'emplacement de chargement, et de raccourcir la partie participant à la longueur désirée. La longueur souhaitée doit fournir à la fois la spécificité de chargement des différents types de cargaison, et la force exécutoire. Typiquement, une queue 18-mer doit être fine. Assurez-vous que la base reste DRAWN par une ligne mince, sinon modifiez-le jusqu'à ce qu'il soit.
7. Dans le châssis, d'éditer les agrafes modifiés si nécessaire.
8. Effacer le guide (hélice 62) ne laissant que l'extension de base.
9. Répétez les étapes 6,4-6,8 pour tous les sites de chargement (Figure 23).

7. Conception brins Gate

Les fils de grille sont les seuls brins, à l'exception des axes, liant hélices 29-30 et 61-0. En contraste avec les axes, les brins de grille sont pas crossovers. Au contraire, ils s'hybrident pour former un segment double brin qui sert de capteur pour la saisie biologique de choix. Une fois que les duplexes de grille sont déplacés, tout le robot peut entropique s'articuleront autour des axes et ouverts.

1. Repérez les emplacements appropriés pour les volets de porte. Ceux-ci seront agrafes hélices 29, 30, 61, et 0.
2. Par exemple, examiner la région de grille 29-30. Il ya des brins de base pratiques d'accompagnement des hélices 29 et 30 sur lepartie droite de la grille, qui peut être utilisé en tant que brins de grille. Notez qu'ils font face à des directions opposées.
3. Cliquez sur le bord de l'un des brins de porte possibilité d'étendre à l'extérieur de la forme. Si le bord se trouve sur un crossover échafaud, sa sélection pourrait être simplifiée en faisant en sorte que "Stap" (les) sont sélectionnables, en cliquant off "CSFA" (fold) dans la barre d'outils "sélectionnable" sur le côté supérieur droit de l'interface .
4. Tendre les deux agrafes pour former les brins de porte. Modifier les agrafes si cette extension nécessite le (Figure 24). Répétez cette opération pour les brins d'hélices 0 et 61 portes.
   Notez que pour l'instant, la longueur réelle n'a pas d'importance, puisque l'ADN du capteur (par exemple aptamer) remplacera les séquences de brin de porte à l'étape de l'achèvement de la séquence.

8. Choisissez échafaudage Sequence

1. Cliquez sur l'outil "Seq". Placez le curseur n'importe où sur le brin d'échafaudage et cliquez. Une boîte de dialogue s'ouvre nous demandant dechoisir la source d'ADN échafaud (Figure 25).
2. Choisir l'ADN de la source dépend fortement de la taille du robot. Par exemple, M13mp18 ssDNA (p7249), et ses dérivés étendus (p7308, etc) qui ont généralement le choix pour les grandes formes d'origami d'ADN, s'adapter lorsque le brin échafaudage est ~ 7 kb de long. Si l'échafaud de la forme conçue est nettement plus courte que la source choisie, le brin échafaud excès qui n'est pas hybridé à un aliment de base va créer une boucle d'ADN simple brin dépassant de la forme repliée. Bien que cela ne pose généralement peu de problèmes pour les boucles relativement courtes, boucles multi-ko longues pourraient gravement atteinte aux pliage et la fonction du robot. Par conséquent, il est important de s'adapter à la source choisie à la forme longueur échafaud.

Par exemple, si le brin échafaudage nécessaire pour plier une petite forme est de ~ 1600 bases de long, ce qui est nettement plus courte que les sources prédéfinis dans la boîte de dialogue, une séquence personnalisée peutêtre utilisé comme échafaudage. Plusieurs sources peuvent être envisagées. Par exemple, l'M13mp18 peut être digéré par une enzyme de restriction spécifique qui produit un fragment de la longueur désirée. Concevoir une telle source peut être fait à NebCutter ( http://tools.neb.com/NEBcutter2/ ) en collant la séquence M13mp18 dans la fenêtre de saisie de NebCutter, et des sites de restriction de cartographie. Une autre option consiste à utiliser prédigéré ssDNA, comme le phiX174 virion ssDNA HaeIII Digest, disponible à partir de New England Biolabs.

3. Dans la boîte de dialogue, cliquez sur "M13mp18". A noter que la séquence d'ADN choisie a été ajoutée à l'échafaudage et des brins de base dans le panneau inférieur.

9. Export Séquence Staple comme une feuille de calcul

1. Cliquez sur "Exporter" sur la barre d'outils et choisissez un nom de fichier de destination pour la liste de base. Cliquez sur "Enregistrer".
2. Localisez le fichier csv destination. Et ouvrez-le.
3. La feuille de calcul affiche la liste de base, qui peut être envoyé tel quel à une société de synthèse d'ADN. Les deux premières colonnes affichent les coordonnées de début et de fin, avec le nombre en dehors des parenthèses indiquant le numéro hélice et le nombre entre crochets indiquant la position de base.

10. Attribuer séquences Gate et le chargement

1. Dans la liste de base, vous remarquerez que certaines séquences commencent ou se terminent par une série de points d'interrogation "????". Ces points d'interrogation indiquent que, puisque aucun brin d'échafaudage s'hybride avec ces régions de base spécifiques, ils ne peuvent pas être affectés séquences complémentaires. Ce sont en fait les extensions que nous avons conçu pour les fils de grille et lieux de chargement et, par conséquent ceux-ci doivent être affectées manuellement maintenant. Porte:
   1. Les portes de déterminer la nature de l'apport biologique sur laquelle le robot passera de l'état inactif à l'état actif et exposer sa charge utile. Chaque porte ADN double brin unique peut encoder réponse à une entrée biologique (ou plus), de sorte que le profil des intrants nécessaires pour l'activation du robot peut être défini.
      Supposons pour cet exemple que le repère biologique déclencher l'activation du robot est une enzyme de restriction, ce qui pourrait indiquer la présence de bactéries infectieuses.
   2. Considérons d'abord que les ADN simple brin brins porte ne s'hybrident pas immédiatement après ramification de leurs hélices. Conception de la porte pourrait gêner autrement hybridation lors du pliage. Par conséquent, chaque branche doit commencer par une chaîne d'espacement. Nous utilisons généralement poly-T sous forme de chaînes d'espacement, comme cette séquence offre une grande souplesse.
   3. Nous supposons également que la longueur de la zone d'hybridation de la porte est de 20 bases, contenant le sit de restriction ciblee en son milieu.
   4. Par conséquent, la porte pourrait ressembler à ceci:
      [Helix 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTxxxxxxGCTAGAG-3 '
      [Helix 30]-3 '..... TTTTTTTCACTCAAxxxxxxCGATCTC-5'
      Le "....." désignent la région de base qui s'hybride avec le brin échafaud, donc il a une séquence déjà et ne doit pas être modifié.
      Le duplex aléatoire "GTGAGTT" et son complément assure le site de restriction n'est pas en partie ouverte, et fournit quelques bases supplémentaires pour assurer la digestion par l'enzyme efficace.
      Le "x" indique le site de restriction.
      Le duplex aléatoire "GCTAGAG" et son complément fournir quelques bases supplémentaires pour l'enzyme pour fonctionner efficacement, mais également permet de s'assurer du brin de grille est suffisamment longue pour assurer une bonne fermeture de robot.
      Avant de choisir un site de restriction comme une cible, assurez-vous que toute la structure du robot, lieux de chargement et d'autre part de la porte elle-même ne sont pas digérées par l'enzyme de choix. Dans cet examen, la liste 0-cutter NEBCutter (enzymes qui ne coupent pas la séquence entière) a souligné EagI, isolé du P. agglomerans Enterobacter, comme une enzyme potentiel qui pourrait indiquer la présence d'une maladie infectieuse entérobactéries.
   5. La porte ressemble maintenant à ceci (jaune site de restriction EagI marques):
      [Helix 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTCGGCCGGCTAGAG-3 '
      [Helix 30]-3 '..... TTTTTTTCACTCAAGCCGGCCGATCTC-5'
      Notez que cette conception suppose que, après digestion, la séquence "GTGAGTTCGG" (T _m = 32 ° C) n'est pas suffisamment longue ou thermodynamique stable pour tenir le robot fermé plus. Cette hypothèse sera très probablement besoin d'être vérifié expérimentalement.
   6. Le deuxième porte peut être la même dans ce cas, le robot ne ferait que répondre à une enzyme, ou peut être conçu avec un autre site, ce qui augmente la spécificité des robots. Plus de sites de restriction peuvent être ajoutés sur la même rive, dans les rainage de la complexité et de la spécificité du robot.
2. Chargement des sites:
   1. Le site de chargement peut être une séquence universelle. Alternativement, les sites de chargement peuvent être basées sur des séquences uniques, ce qui diminuera la modularité mais aussi d'améliorer le contrôle de l'orientation de la cargaison et des ratios (pour différents types de cargaison).
   2. Enfin, le chargement des oligonucléotides site devraient inclure un groupe chimique fonctionnel qui leur permet de conjuguer avec une charge utile: protéines, nanoparticules, etc Assurez-vous que le groupe chimique est monté sur l'extrémité correcte (5 'ou 3'), selon la direction de base .

11. Simuler Résultats en CANDO

1. Après le travail est enregistré dans un fichier JSON., Il peut être téléchargé à CANDO pour analyse. CAADA est basée sur une simulation par éléments finis de la structure de l'ADN qui permet d'estimer sa rigidité et sa stabilité en solution ^21.
2. Allez àami.org / "target =" _blank "> http://cando-dna-origami.org/
3. Cliquez sur «Soumettre un fichier caDNAno pour analyse" et de remplir toutes les informations nécessaires.
4. Analyse en CANDO prend habituellement jusqu'à 15-20 min. A la fin, un message e-mail nous permet de savoir l'analyse est terminée, fournissant un lien pour télécharger les résultats de la simulation (Figure 26).

12. ADN de commande et de plier le Robot

Une fois le processus de conception est terminée et l'analyse CANDO montre prédiction satisfaisante du produit, la liste des brins de base généré dans les sections 9-10 peuvent être commandés. En règle générale, les brins de base ne nécessitent pas de purification particulière, mais il est recommandé que les fils à usages spéciaux tels que portails ou sites de chargement sont purifiés par HPLC.

Les étapes afin d'ADN suivante, à savoir pliage, la purification et l'évaluation du produit, y compris la visualisation de la structure repliée soit par force atomiquemicroscopie (AFM) ou la microscopie électronique en transmission (TEM) sont en dehors du champ d'application de cet article, et peuvent être trouvés dans les rapports précédents ^17,18,20,21. Une image de TEM du robot conçu ici est porté comme un exemple (figure 27). La préparation des échantillons et de la coloration a été réalisée exactement comme décrit par ailleurs ^21.

Representative Results

Les chiffres sont 1-25 captures d'écran de l'interface caDNAno 2.0 montrant le processus de conception étape par étape. La section transversale de la forme a été décrite (Figure 3), suivie de l'addition automatique des fragments de brins d'échafaudage et l'achèvement de l'ensemble du chemin échafaud (figure 7). Brins de base sont automatiquement ajoutées (Figure 12), répartis en fonction des paramètres définis par l'utilisateur (Figure 14), et vérifiés manuellement afin d'adapter les agrafes à la fonction souhaitée du dispositif (Figures 15-18). Chiffres décrivent comment charger 23-24 site et de brins de grille sont ajoutés et modifiés. Enfin, la figure 27 montre une image TEM du modèle conçu ici.

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Figure 1. Un modèle 3D du robot fini, conçu par caDNAno 2.0 et généré par Autodesk Maya 2012.

Figure 2. Une vue de l'interface de conception caDNAno 2.0/Autodesk Maya 2012. Panneau supérieur: Panneau de treillis pour esquisser la forme initiale. Panneau inférieur: panneau d'édition. Panneau de droite:. Générateur de modèles 3D (voir section 2.1) Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3. Dessin de la section de la forme sur le dessus panel (voir section 2.3).

Figure 4. Le panneau de fond (édition) de caDNAno 2.0. La barre verticale orange, détermine l'endroit où le long des actions d'édition de la grille se produiront. Les flèches grises sur le coin supérieur droit sont utilisés pour étendre le réseau de chaque côté (voir section 2.4).

Figure 5. Un projet du brin échafaud après le contour initial dans le panneau supérieur (voir section 2.5). Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 6. Sélection de tous les bords de chemin de brins d'échafaudage et d'étendre le chemin à la longueur désirée (voir section 2.7).

Figure 7. Une vue générale des panneaux de fond et à droite démontrant comment les changements de modèles 3D en temps réel avec des actions d'édition. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 8. Les icônes de Blue Bridge entre les hélices indiquent les positions où crossovers échafaudage sont autorisés (icônes rouges se réfèrent aux croisements de base et ne sont pas encore affichés, voir section 2.9).

Figure 9. Création d'un nouveau échafaudage croisements en cliquant sur ​​les icônes de pont de choix (voir section 2.10).

Figure 10. Création d'un axe (un crossover aussi proche que possible sur le côté gauche de la grille) entre les hélices 29 et 30 (voir section 3.2).

Figure 11. Ajout d'hélices qui guident la ramification des sites de chargement (voir section 4.1).

Figure 12. Le plan après l'action "AutoStaple". Les couleurs de base dans le panneau inférieur et le panneau de droite sont compatibles (voir rubrique 5.1). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 13. La boîte de dialogue "Interruption USB automatique» dans lequel le l'utilisateur peut définir des paramètres d'Interruption USB automatique (voir section 5.2).

Figure 14. Le plan après l'action "Interruption USB automatique" (voir section 5.2). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 15 édition manuelle d'agrafes I:. Localisation agrafes qui traversent des hélices 29 et 30 et devrait être supprimé.

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Figure 16 édition manuelle d'agrafes II:. Supprimant les ponts entre les agrafes situées.

Figure 17 édition manuelle d'agrafes III:. Cousant les entailles le long des agrafes fragmentés (voir section 5.5).

Figure 18. L'écart entre les hélices entier 29-30 montrant aucun lien entre les deux crossovers (voir section 5.5). Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 19. Édition manuelle des agrafes en trait épais (retard, ils sont soit trop court, trop long ou circulaire, voir section 5.6).

Figure 20. Ajout d'hélices de guidage pour charger le site de branchement (voir rubrique 6.1). Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 21. D'ailleurs Manuel de brins de base aux hélices de guidage, de sorte que les points de branchement peuvent être localisés (voir section 6.2). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 22. Présentant un site chargement croisé sur le châssis échafaud robot dans un emplacement idéal (celui qui nécessite un minimum d'édition de châssis de base, voir la section 6.5).

Figure 23. Vue sur le chargement des agrafes de site comme on le voit dans le ee panneau de fond après avoir enlevé les hélices de guidage, qui ne sont plus nécessaires (voir section 6.9).

Figure 24. Extension de deux agrafes qui vont être utilisés comme fils de grille, de hélices 29 et 30. Notez que les deux brins sont confrontés à des directions opposées, ce qui est obligatoire pour la formation du duplex porte (voir section 7.4). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 25. L'ajout de séquence échafaud (outil "Seq") du dialogueboîte, permettant de choisir l'une des échafaudages prédéfinis, ou d'insérer une séquence personnalisée (voir section 8.1).

Figure 26. Résultats de l'analyse CANDO de la conception décrits ici. La simulation génère une archive. Zip contenant les différents fichiers qui fournissent les informations demandées. Voici les (Root Mean fluctuation carré) rmsf fichiers (. Png) sont représentées, montrant un modèle de la conception de 3 angles de vue, de couleur selon la clé détaillées dans le dossier d'accompagnement intitulé «HeatMap4RMSF.txt". Dans ce cas, minimum RMSF (plus bleue) est de 1,03 nm, et 95% RMSF (redest) est 3,19 nm. Le gradient de couleur sur le modèle de dérive de la polarité du robot (portes en «front», axe «retour») et le fait qu'il n'y a pas agrafes reliant le long hélices 29-30 et 61-0, provoquant le «front «côté à fluctuer davantage que le« retour »côté.

Figure 27. L'image de TEM du robot conçu dans cet article. La préparation des échantillons et de la coloration a été réalisée exactement comme décrit par ailleurs ^21.

Discussion

ADN origami nous permet de fabriquer des objets définis avec précision avec des caractéristiques arbitraires à l'échelle nanométrique. Une prochaine étape importante serait l'intégration de la fonction dans ces dessins. Alors que de nombreuses applications et les défis pourraient être traités avec cette technologie, il ya un intérêt particulier dans la fabrication de robots thérapeutiques et scientifiques de l'ADN origami, car ils représentent un milieu naturel de l'ADN. ADN s'interface déjà des machines moléculaires dans les cellules en tant que support de stockage de l'information génétique. Fait intéressant, l'ADN replié dans un nanorobots ou une autre machine peut encore servir de l'information génétique en plus d'être un matériau de construction, qui peut être transmise à l'expression d'une protéine désirée après la nanorobots se désintègre, comme faisant partie d'une séquence de sorties.

Dans l'exemple présenté dans cet article, nous utilisons une enzyme de restriction pour faire fonctionner le robot. Cependant, les mécanismes par lesquels les robots supplémentaires d'ADN peuvent responsabilitéd pour les entrées sont les suivants.

Reconnaissance moléculaire: Nous avons récemment démontré portes aptamer à base de robots d'ADN qui reconnaissent les molécules de protéines à la surface des cellules cibles ^20. Les aptamères peuvent être sélectionnés in vitro en utilisant des méthodes telles que SELEX ^23, sous-traitée auprès de sociétés ou d'occasion à partir de la base de données aptamer ( http://aptamer.icmb.utexas.edu/ ). Quand aptamères sont employés, il est important de considérer que le brin complémentaire de l'aptamère, qui constitue en même temps la porte, peut être conçu pour inclure des décalages, ce qui facilitera la liaison de ligand et le déplacement du brin complémentaire de l'aptamère. Bien que le mécanisme permettant cela est inconnu, la sensibilité et la spécificité d'une porte aptamer basée peuvent être réglés en augmentant ou en diminuant le% de discordance entre les deux brins, pour obtenir soit une porte très rigoureux, mais inefficace, ou un jeûnemais qui fuit une.

Le clivage enzymatique: pour cela, les portes doivent être conçus de telle sorte qu'ils contiennent le substrat de cette enzyme. Par exemple, un petit substrat peptidique d'une protéase peut être attaché à partir des deux côtés de la porte, ce qui maintiendra le robot fermée en l'absence de l'enzyme.

Commande à distance: une approche potentielle qui n'a pas été appliquée à des machines de l'ADN utilise un nanocristal antenne d'or dans un champ électromagnétique à haute fréquence pour induire ADNdb fusion ^24. Cela peut fournir un interrupteur actionné par l'utilisateur, en plus de bio-réactifs autres. Bien origami ADN robots sont relativement simples à concevoir et à fabriquer, ils posent plusieurs défis techniques comme une plateforme thérapeutique. ADN n'est pas un matériau idéal pour la livraison de la drogue car il est très vulnérable au clivage par les nucléases. En outre, il pourrait précipiter une réponse immunitaire. Une étude approfondie du comportement des objets origami ADN dans un organisme est needed de définir leur destin et assurez-vous qu'ils ne s'agrègent pas dans les tissus ou s'intégrer dans le génome de l'hôte.

En résumé, nous avons présenté l'utilisation de caDNAno, un outil de CAO solide simple de concevoir ADN origami formes. Nous espérons pouvoir commencer à voir la recherche axé sur les applications dans l'ADN origami, dans des domaines tels que la thérapeutique, de l'énergie, métamatériaux, et l'éducation. Dans tous ces endroits, caDNAno devrait avoir un impact significatif sur la réalisation des solutions. Dans l'avenir, il pourrait devenir un standard industriel et de design, qui peut être remplacé (ou des parties qui peuvent) par n'importe quel utilisateur, car ils sont tous compatibles.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autodesk Maya 2012	Autodesk		A student/academic account needs to be created first (see platform-specific instructions in http://cadnano.org)
caDNAno 2.0 (software)	(Open source)		Software for the design of DNA origami structures http://cadnano.org
Cando (webpage)	(Open source)		Webpage running a simulator of DNA origami shapes http://cando-dna-origami.org