Summary
DNA 종이 접기 DNA 분자의 자기 조립을 프로그래밍하여 정확한 나노 물체를 제조하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 DNA 종이 접기는 생물학적 신호를 감지하고 모양이 연속적으로 원하는 효과를 전달, 이동하여 응답 할 수있는 로봇 로봇을 설계에 활용 될 수있는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
핵산일까요 다재다능하다. 생물 정보 1 저장 매체로 그들의 자연적인 역할뿐만 아니라, 그들은 병렬 컴퓨팅 2,3에 활용 될 수 생물의 인식 및 분자 또는 세포 표적 4,5 결합, 화학 반응에게 6,7을 촉진하고, 계산 된 응답을 생성 시스템 8,9. 중요한 것은, 핵산 원하는 효과를 발휘하기 위해서는 사전 반응 생물학적 신호의 감지를 연결하는 하나의 로봇이 모든 놀라운 기능의 통합을 가능하게 2D 및 3D 구조를 10-12로 자기 조립 (self-assembly)을 프로그래밍 할 수 있습니다.
핵산에서 도형을 만들어 처음으로 시먼 (13)에 의해 제안되었으며,이 주제에 대한 몇 가지 변화는 이후 다양한 기술에게 11,12,14,15를 사용하여 실현되었다. 그러나 가장 중요한이 되나 비계 DNA 종이 접기, 아마도 Rothemund에 의해 제안 된 하나16. 이 기법에서는, 긴 (> 7,000 기지) 단일 가닥 DNA '발판'의 폴딩은 '스테이플'라고 짧은 보완 가닥의 수백에 의해 원하는 형태로 전달된다. 접는는 온도 열처리 램프에 의해 수행됩니다. 이 기술은 성공적으로 놀라운 정밀도와 안정성을 가진 2 차원 도형의 다양한 배열의 생성에 증명되었다. DNA 종이 접기는 나중에도 17,18으로 3D로 확장되었다.
현재 문서는 더글라스와 동료에 의해 개발 caDNAno 2.0 소프트웨어 19에 초점을 맞출 것이다. caDNAno는 다양한 기능을 갖춘 2D 및 3D DNA 종이 접기 모양의 디자인을 가능하게하는 강력하고 사용자 친화적 인 CAD 도구입니다. 설계 과정은 비교적 간단하고 효율적으로 만드는 DNA 구조에 대한 체계적이고 정확한 추상화 방식에 의존합니다.
본 논문에서 우리는 DNA 종이 접기 NA의 디자인을 보여최근 20 설명했습니다 norobot. 이 로봇은 작업을 수행하기 위해, 작동을 감지 링크되었음을 의미에서 '로봇'입니다. 우리는 다양한 감지 방식은 구조에 통합 할 수있는 방법을 설명하고, 어떻게이 원하는 효과를 전달 할 수 있습니다. 마지막으로 우리는 설계 형상의 기계적 특성을 시뮬레이션 Cando 21을 사용합니다. 우리가 논의 개념은 여러 작업 및 설정에 적용 할 수 있습니다.
Protocol
우리는이 논문에서 설계 할 로봇은 선택 대상 세포의 표면에있는 수용체에 결합하는화물 C가 사용할 수 있도록하여 단백질 P에 응답합니다. 로봇은 그림 1에 나와있다 C는 수용체 차단 약이 될 수있다;. 그 기능을 파괴하지 않는 사용할 수 있어야 성장 인자 등의 화학적 DNA 올리고 뉴클레오타이드에 연결하는 방법입니다. 로봇은 두 가지 상태가 있습니다. 두 개의 외부 '입술'에 비활성, DNA 게이트가 교배하면 로봇이 안전하게 압수됩니다 내의 모든화물이 적재되도록 닫혀 확인하고. 단백질 P의 존재, 로봇이화물을 열고 노출 할 수 있도록 여러 가지 메커니즘 중 하나 (아래에 설명) 중 하나에 열리는 문. 구조를 설계 할 때, 문이 이렇게 할 수있는 경우 로봇이 닫힌 상태에서는 자신에 가까이 할 수있을만큼 유연하게 보유하고 열린 상태로 봄 것으로 간주합니다. DNA의 동작을 모델링 구조 통합 열역학 및 기계적 구성 요소는 어렵고, 실제 객체는 몇 가지 개선을 반복해야 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 우리가 기반으로 구축 할 수있는 일반적인 작업 모델을 사용하여 설계 프로세스에 초점을 맞 춥니 다.
주의
DNA 종이 접기 디자인과 접는 과정의보다 포괄적 인 이해를 위해, 우리는 매우 추상적 인 디자인 인터페이스에서 DNA의 표현이며 어떻게의 실제 분자 구조에 관한 설명 더글라스와 동료 19에 의해 원래의 caDNAno의 신문을 읽고 추천 3 차원 DNA 모양입니다. 이 문서는 매우 분명 방법 caDNAno 표현과 인터페이스를 설명하는 두 개의 비디오 자습서가 함께합니다. 또한, 우리는 에츠 많은 중요한 측면과 Cando 분석 도구 21 등 접는 과정의 상세한 프로토콜을 설명 동료에 의해 최근 신문을 읽고 좋습니다.
TLE "> 1. caDNAno 2.0 오토 데스크 마야 2012 다운로드 및 설치참고 : 오토 데스크 소프트웨어는 학생들이 학업 사용을위한 무료입니다. 아래의 지침은 오토 데스크에서 학업 계정 설정이 포함됩니다.
- 에서 학술 계정 만들기 http://students.autodesk.com/을 . 계정 설정 전자 메일을 수신 한 후, 활성화 링크를 클릭하고 원하는대로 설정을 입력하십시오.
- 다운로드 센터에서 마야 2012 무료 버전을 다운로드 할 수 있습니다.
- 컴퓨터에 마야 2012를 설치합니다.
- caDNAno 2.0을 설치하기 전에 한 번 마야 실행합니다.
- 에서 caDNAno 2.0의 최신 버전을 다운로드하고 설치 http://cadnano.org/ .
- 마야 2012를 실행합니다. caDNAno 아이콘 그래픽 사용자 인터페이스의 오른쪽 상단에 나타납니다. caDNAno로 이동하려면 아이콘을 클릭합니다.
2. 나와!원하는 모양과 비계 물가 경로를 조사한다
- : 마야에서 caDNAno의 디자인 인터페이스는 3 패널 (그림 2)를 포함
- 상단 패널 : 모양은 처음에 설명되어 격자보기. 이 패널은 이중 나선 수준의 작업을 가능하게하고 형상의 단면 뷰를 제공합니다.
- 하단 패널 : 편집위원회, 단일 기본 수준의 작업을 가능하게.
- 오른쪽 패널 : 모양 마야 생성 실시간 3D 모델
- "벌집"아이콘을 클릭합니다. 상단 패널에서 격자의를 확대 및 축소하는 것은 마우스로 할 수 있습니다 각각 위아래로 스크롤합니다.
caDNAno은 두 가지 디자인 격자, 벌집 광장 가능, 사각형 격자는 일반적으로뿐만 아니라 22 사용할 수 있지만이 문서에서 우리는 벌집 레이아웃을 사용합니다. - 왼쪽 패널에서 원하는 형상의 단면을 그려 시작합니다.
각 원은 이중 DNA 나선을 나타냅니다. 채널에모양을 만들 나선을 OOSE, 단순히 센터 (그림 3)을 누릅니다. 전체 모양이 개설 될 때까지 나선형으로 나선을 계속합니다. 또한, 형상은 마우스 왼쪽 버튼을 누르고 지속적으로 도형의 윤곽선을 그려 그려 질 수 있습니다. 모든 작업은 편집 메뉴를 클릭하여 실행 취소와 "취소"또는 키보드 단축키 Ctrl + Z (PC) 또는 CMD + Z (Mac 용)에 의해 만들어 질 수있다.
이 시점에서, 선택한 나선이 노란색으로 표시됩니다. 동시에, 하단 패널이 나선으로 구성된 형상의 측면보기를 표시합니다. 하단 패널에 번호 나선은 최고 한 번호와 일치합니다. - 하단 패널을 관찰합니다. 행이 이중 나선의 두 가닥,베이스 (그림 4)을 나타내는 각 사각형 : 각 나선은 사각형의 두 행으로 표시됩니다.
편집 작업은 나선을 따라 장소를 어디로 데려 오렌지 수직 막대를 결정합니다. 그리드에 따라 기본 위치로 나타납니다오렌지색 막대 위의 번호입니다. 나선 프레임 워크의 기본 길이는 42 기지입니다. 길이는 편집 패널의 오른쪽 상단 모서리에있는 회색 화살표 아이콘 중 하나를 클릭하고 확장 길이 (DNA 나선의 두 개의 전체 회전에 해당하는 21의 배수에서 선택하여 확장 할 수있는 하나의 회전 10.5에 걸쳐 기지) (그림 4). 그리드 선택한 화살표의 방향으로 확장됩니다. - 모양을 통해 실제 비계 가닥 경로를 플롯하려면 마우스 버튼을 눌러 먼저 나선부터 시작하고 처음에 2.3 절에서 선택한 것과 동일한 순서에 따라 모든 나선을 통해 지속적으로 이동합니다. 그 참고 :
- 나선 이번 오렌지 색상을 변경합니다 선택했습니다.
- 하단 패널에서 비계 가닥 조각이 자동으로 선택 나선으로 그려집니다.
- 오른쪽 패널은 실시간으로 구축되는 형태의 3D 모델을 표시합니다. 이것의 끝과정, 비계 가닥 경로의 초안은 자동으로 하단 패널 (그림 5)에 그려집니다.
- 비계 경로의 왼쪽 가장자리 주위에 사각형을 그립니다. 그래서 선택한 가장자리가 빨간색 (그림 6)가 나타납니다 유의하십시오.
- 그리드의 왼쪽에 그룹으로 선택한 모서리를 드래그하여 비계 경로를 확장합니다. 경로가 제대로 확장 될 때까지 오른쪽 가장자리에 대해이 과정을 반복합니다. 비계 확장자는 오른쪽 패널 (그림 7)에서 3D 모양을 확장합니다.
- 나머지에서 분리되는 발판 경로 부분을 찾아 연결합니다. 우리의 모양에서, 예를 들어, 나선 0-9 절연 부분을 형성한다. 나선 9 필요에 나선 12에 연결하는 (나선 9와 10은 모양 [상단 패널] 그래서 그들은 연결할 수 없습니다에 인접하지 않은 것을 주).
- 연결되는 가닥을 확대하고, 사용 "선택"도구 하나를 임의의 점을 클릭가닥. 파란색 발판 조각을 따라 임의의 지점을 클릭 후, '다리'아이콘 크로스 오버가 허용되는 위치를 나타내는, 나선 사이에 나타납니다. 이 위치에 인접한 나선의 기지 가닥 DNA를 변형하거나 왜곡하지 않고 나선의 나선으로 국경을 넘을 수 있도록 서로 직접 얼굴. 각 다리 아이콘 옆에 나타나는 숫자는에 크로스 오버 것이다 나선의 수 (그림 8)을 나타냅니다.
- 크로스 오버를 만들려면, 선택의 교량 아이콘을 마우스 왼쪽 단추로 클릭합니다. 비계 크로스 오버 (그림 9) 발판 나선의 나선이 시점에서 교차 의미 생성됩니다. 이 과정을 반복 발판 통과 모든 나선 및 전체 모양에 걸쳐 닫힌 루프를 만들고이 모양의 나머지 부분에서 분리되어 더 영역을 떠나지 않을 때까지.
크로스 오버는 소프트웨어의 거리에 걸쳐 나타나는 동안, 현실에서 그들이 어떤 DNA베이스가 포함되어 있지 않습니다. 실제로, 크로스 오버"다리"함께 인접한 나선에서 두 개의 기지를 연결하는 DNA 백본 단 하나의 인산염 단위를 포함하고 있습니다. - 다음 단계로 이동하기 전에, 전체 발판 연속, 그리고 그것의 어떤 부분이 다른 사람들로부터 고립되지 않습니다 있는지 확인하십시오.
3. 열기 메커니즘 축을 정의
설명 로봇의 페이로드를 노출하는 정의 생물학적 입력에 대한 응답으로 열립니다. 오프닝 (나선 0-29 반을 구성 30-61 두 번째 절반을 만들어 나선) 두 개의 반쪽으로, 쉘과 같은 방법으로 이루어지는 두 축 주위를 맴도는. 축이 그 반쪽 사이의 유일한 크로스 오버이며 격자의 왼쪽 가장자리에만 또는 가까운 위치하는 나선 29-30과 61-0 사이의 교차에 의해 형성된다. 오른쪽 가장자리는 게이트 가닥 (아래에 설명)이 포함됩니다.
- 나선 29-30 사이에 기존의 크로스 오버를 지 웁니다. 크로스 오버를 지우려면 두 가닥의 "무릎"지점을 클릭합니다.이 크로스 오버로 사용되는 두 가닥의 별명을 떠난다. 심 흠에, Shift 키를 누르고 각 닉을 클릭합니다.
- 최대한 가까이 그리드 (그림 10)의 왼쪽 가장자리에 나선 29 ~ 30 사이에 새 크로스 오버를 만들 수 있습니다.
- 최대한 가까이 그리드의 왼쪽 가장자리에 나선 61 0 ~ 새로운 크로스 오버를 만들 수 있습니다.
4. 페이로드 첨부 파일 사이트 정의
우리는 비계 가닥 경로를하려 마친 후, 우리는 페이로드 첨부 (로드) 사이트를 정의해야합니다. 로드 사이트는 단일 좌초 '지점'으로 자신의 나선의를 확장 사실 주식 가닥에 있습니다. 그것은 나선 함께이 분기 그것이 원하는 방향으로 확장 확인하기 위해, 발생하는 매우 정확하게 정의하는 것이 중요합니다. 우리가 임의로 주식 확장을 정의하면로드 사이트 대신 내부 측의 로봇의 외부 측면에 발생할 수 있습니다.
티주식은, 우리가 본체로부터 주식의 분기 방향에 대한 가이드 역할을 추가 나선형을 그리는 특정 방향으로 확장해야합니다 O를. 원하는로드 사이트 스테이플을 확장 한 후, 가이드 나선이 제거됩니다.
- 우리가 로봇의 내부쪽으로 향하게 4로드 사이트를 정의 할 수 있습니다. 로드 사이트 나선 3, 27, 34, 58에서 분기됩니다. 각 사이트의 상단 패널의 내부면 (그림 11) 얼굴이 나선 바로 옆에 나선을 클릭합니다. 이 하단 패널에있는 그리드에 나선을 추가합니다. 아직이 나선을 두 번째 클릭하지 마십시오.
5. 스테이플 추가 및 편집
- "AutoStaple"을 클릭합니다. 소프트웨어는 다양한 색상 스테이플 시퀀스 (그림 12)을 추가합니다. 스테이플이 오른쪽 패널에서 3D 형상에 추가되었습니다 있습니다. 주식 색상은 하단과 오른쪽 패널 일치한다. 책상 외에도에서에, 주식을 나타내는 인터페이스의 왼쪽 하단 모서리에 표시가있다.
참고 : 스테이플이 너무 짧거나 원형 너무 오래 할 수 없습니다. 스테이플의 대부분은 여기에서 생성 된 이러한 기준을 충족하지 않으며, 편집 할 수 있습니다. 를 편집하는 첫 번째 단계는 (다음 단계 참조) 자동입니다. - "AutoBreak"을 클릭합니다. 대화 상자는이 작업에 대한 사용자 정의 매개 변수를 요구합니다 (그림 13)이 열립니다 :
- 대상의 길이 (BP) : 주식의 예상 길이를 가능한 한
- 최소 길이 (BP) : 최소 길이는 주식에 허용
- 최대 길이 (BP) : 최대 길이는 주식에 허용
- 스테이플의 가장자리와 크로스 오버 사이 또는 두 개의 교차 사이에 통과 할 수 염기쌍의 최소 수 : XOVER (BP)에 DIST 분.
기본 매개 변수를 사용하여 확인을 클릭합니다. 소프트웨어는 (그림 1의 능력의 최선을 이러한 매개 변수에 따라 스테이플을 중단합니다4).
- 이러한 나선 열고 로봇을 분리 가능하게 할 수 있도록, 나선 29-30과 61-0 사이의 모든 스테이플 크로스 오버를 지 웁니다. 스테이플 크로스 오버 지우기가 너무 짧거나이 작업의 결과로 불합리한가 올바른 스테이플 몇 가지 수동으로 편집해야합니다. 제대로이 작업을 수행하려면 다음 섹션의 지침을 따르십시오.
그대로 섹션 3.2 및 3.3에서 만든 발판 크로스 오버를두고 있는지 확인하십시오. - 예를 들어, 나선 29 30 (그림 15) 사이의 왼쪽에서 첫 번째 스테이플 크로스 오버 (시안과 검은 스테이플)을 고려한다. 그것은 빨간색 표시되도록 DELETE (그림 16) 타격 한 후, 각각의 니 포인트 또는 브리지를 클릭하여이 크로스 오버의 다리를 모두 지 웁니다.
- 그들 사이 SHIFT 키를 누른 닉을 클릭하여 나선 29 Seam은 두 개의 스테이플. 마찬가지로, 솔기 하나의 스테이플 (그림 17)로 가닥 30 세 스테이플. 스테이플 할 수 있습니다수동 가장자리를 클릭하고 원하는대로 드래그하여 연장 또는 단축 할 수. 어떤 주식을 회람하지 않도록주의하십시오. 그림 18 스테이플 크로스 오버의 완전한 편집 한 후 나선 29-30 사이의 간격을 보여줍니다. 나선 0과 61에 대해이 과정을 반복, 수동으로 각 나선의 모든 스테이플을 편집합니다.
- 그들은 추가 편집을 필요로 의미 굵은 선으로 그려진 스테이플을 찾습니다. 각각을 검사하고 필요에 따라 수정합니다. 예를 들어, 너무 짧은 스테이플 삭제 (그림 19) 또는 가능하면 확장 할 수 있습니다.
6. 로딩 사이트 게이츠를 만들
- 상단 패널에로드 사이트 나선을 두 번째로 클릭하고 모서리를 클릭하고 등 (그림 20) 원하는 드래그하여 하단 패널에있는 결과 비계 가닥 조각을 확장합니다.
- 수동 t에 따라 원하는 위치에 오렌지색 세로 막대를 배치하여 이러한 비계 조각에 스테이플을 추가그는 발판, Shift 키를 누른 채 클릭하면 왼쪽 패널의 가이드 나선 통해 갈. 이것은 각 나선의 주식 전구체 (그림 21)을 추가합니다.
- 클릭하고 드래그하여 전체 길이뿐만 아니라에 스테이플 전구체를 확장합니다.
- 가이드 가닥 (예를 들어, 나선 62)와 섀시 (예를 들어, 나선 3) 사이에 허용되는 크로스 오버의 위치를 나타내는, 붉은 다리 아이콘을 찾습니다.
- 크로스 오버를 소개하고 다리 아이콘 (그림 22)을 클릭하여 가장 편리한 위치를 선택합니다. 편리한 위치는 섀시의 기존 스테이플 최소한의 편집이 필요합니다.
- 가이드 나선 (나선 62),로드 사이트의 일부가 아닌 스테이플 부분을 삭제하고, 원하는 길이로 참여 부분을 단축. 원하는 길이화물의 다른 유형을로드 특이성 및 결합력을 모두 제공해야합니다. 일반적으로 18 메르 꼬리는 잘해야한다. 스테이플 DRA 남아 있는지 확인그 때까지 얇은 라인으로 WN는, 그렇지 않으면 그것을 편집합니다.
- 섀시에 필요에 따라 변경 스테이플을 편집 할 수 있습니다.
- 가이드 (나선 62)은 주식 확장자를 떠나 삭제합니다.
- 반복 모든로드 사이트 (그림 23)에 대한 6.4-6.8 단계를 반복합니다.
7. 게이트 가닥을 설계
게이트 가닥 나선에게 29-30과 61-0를 연결, 축 제외하고, 만 가닥이다. 축 대조적으로, 게이트 가닥 크로스 오버되지 않습니다. 오히려, 그들은 선택의 생물학적 입력 센서 역할을하는 이중 좌초 세그먼트를 형성하는 잡종. 게이트 듀플렉스가 변위되면, 전체 로봇 entropically 축과 개방을 중심으로 돌고 있습니다.
- 게이트 가닥의 적절한 위치를 찾습니다. 이러한 나선 29, 30, 61, 그리고 0에 스테이플이됩니다.
- 예를 들어, 29-30 게이트 영역을 검사합니다. 나선하기에 29, 30를 측면에서는 편리 주식 가닥이 있습니다게이트 가닥으로 사용할 수있는 격자의 오른쪽. 그들은 반대 방향을 향하도록합니다.
- 도형의 외부로 확장하는 가능성 게이트 가닥 중 하나의 모서리를 클릭합니다. 가장자리 발판 크로스 오버에 놓여 경우, 그 선택은 'STAP "(레)는 인터페이스의 오른쪽 상단에있는"선택 "도구"SCAF "(배)를 해제 클릭하여 선택할 수 있는지 확인하여 단순화 할 수 .
- 게이트 가닥을 형성하는 두 스테이플을 확장합니다. 이 연장이 (그림 24) 필요한 경우 스테이플을 편집합니다. 나선 0과 61의 게이트 물가에 대해이 단계를 반복합니다.
센서 DNA (예 : 압 타머) 시퀀스 완료 단계에서 게이트 가닥 시퀀스를 대체 할 것이기 때문에 지금은, 실제 길이는 중요하지 않습니다.
8. 비계 순서를 선택
- "시퀀서"도구를 클릭합니다. 비계 가닥의 어느 곳에서나 커서를 놓고 클릭합니다. 대화 상자가 우리에게 묻는 열 것입니다발판 DNA 소스 (그림 25)을 선택합니다.
- 소스 DNA를 선택하면 크게 로봇의 크기에 따라 달라집니다. 예를 들어, M13mp18 ssDNA (p7249), 그리고 확장 된 파생 상품 (p7308 등) 일반적으로 비계 가닥 ~ 7킬로바이트 긴 경우에 맞게 큰 DNA 종이 접기 모양을 위해 선택되었습니다 어느. 설계 형상의 비계가 선택한 소스보다 훨씬 짧은 경우, 어떤 주식에 하이브리드되지 않은 여분의 발판 가닥 접힌 모양에서 튀어 ssDNA의 루프를 생성합니다. 이 일반적으로 비교적 짧은 루프 작은 문제를 제기하면서, 멀티 KB 긴 루프는 크게 로봇의 폴딩 기능을 방해 할 수 있습니다. 따라서 모양 발판의 길이에 선택한 소스에 맞게하는 것이 중요합니다.
예를 들어, 만약 발판 가닥이 대화 상자에서 설정 한 소스보다 훨씬 짧다 ~ 1,600 염기 길이의 작은 모양을 접어하는 데 필요한 사용자 지정 순서는 할 수있다비계로 사용. 여러 소스가 고려 될 수있다. 예를 들어, M13mp18은 원하는 길이의 단편을 생성하는 특정 제한 효소로 소화 할 수 있습니다. 같은 소스를 설계하는 것은 NebCutter (에서 할 수 http://tools.neb.com/NEBcutter2/ M13mp18 순서를 붙여) NebCutter 입력 창 및 매핑 제한 사이트합니다. 또 다른 옵션은 뉴 잉글랜드 Biolabs가에서 사용할 수있는 등 phiX174 virion의 ssDNA HaeIII 다이제스트로 미리 소화 ssDNA를 사용하는 것입니다.
- 대화 상자에서 "M13mp18"을 클릭합니다. 선택한 DNA 시퀀스가 비계와 하단 패널에 스테이플 가닥에 추가되었는지 확인합니다.
9. 박람회스프레드 시트 RT 수술 순서
- 상단 도구 모음에서 "내보내기"를 클릭하고 주식 목록의 대상 파일 이름을 선택합니다. "저장"을 클릭합니다.
- 대상. csv 파일을 찾아 엽니 다.
- 스프레드 시트는 DNA 합성 회사에 그대로 보낼 수있는 주식 목록을 보여줍니다. 처음 두 열은 기본 위치를 나타내는 대괄호 안에 나선 번호와 번호를 나타내는 괄호 밖 숫자로, 시작과 끝 좌표를 표시합니다.
10. 게이트 및로드 시퀀스를 할당
- 주식 목록에서, 당신은 어떤 시퀀스가 시작하거나 물음표의 문자열로 끝나는 것을 알 수 있습니다 "???". 이 물음표은 비계 가닥이 특정 주식 지역과 교배하지 않기 때문에, 그들은 보완 시퀀스를 할당 할 수 없습니다 나타냅니다. 이러한 사실 게이트 가닥로드 사이트 우리가 설계 한 확장이다, 따라서이 이제 수동으로 할당해야합니다. 문 :
- 문은 로봇이 활성 상태로 비활성으로 전환하고 페이로드를 노출되는시 생물학적 입력의 특성을 결정합니다. 각 단일 dsDNA 게이트 하나의 생물 입력 (또는 그 이상)에 대한 응답을 인코딩 할 수 있습니다, 로봇 활성화에 필요한 입력의 프로파일을 정의 할 수 있도록.
우리가 로봇 활성화를 트리거 생물 큐 전염성 박테리아의 존재를 나타낼 수 제한 효소이며,이 예에 대한 가정하자. - 첫 번째 게이트 ssDNA 물가가 나선에서 분기 후 즉시 교배하지 않는 것이 좋습니다. 게이트를 설계하는 것은 그렇지 않으면 접는 동안 하이브리드을 방해 할 수 있습니다. 따라서 각 분기 공백 문자열로 시작해야합니다. 이 시퀀스는 유연성을 제공하기 때문에 우리는 일반적으로 공백 문자열로 폴리-T를 사용합니다.
- 우리는 또한 게이트 하이브리드 영역의 길이가 대상 제한 앉아를 포함, 20 개 기지로 가정그 중간에있는 전자.
- 따라서 문은 다음과 같습니다 :
[나선 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTxxxxxxGCTAGAG-3 '
[나선 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAxxxxxxCGATCTC-5 '
"....." 발판 가닥 교배 스테이플 영역을 나타냅니다, 따라서 이미 시퀀스를 가지고 있으며 변경할 수 없습니다.
무작위 이중 "GTGAGTT"과 그 보완 제한 사이트가 부분적으로 열려 있지 보장하며, 효소에 의해 효과적으로 소화를 보장하기 위해 몇 가지 여분의 기초를 제공합니다.
"x"는 제한 사이트를 나타냅니다.
무작위 이중 "GCTAGAG"과 보완 효율적으로 작동하는 효소에 대한 몇 가지 여분의 기초를 제공 할뿐만 아니라, 확인 게이트 가닥 좋은 로봇 폐쇄를 보장하기 위해 충분히 긴합니다.
대상으로 제한 사이트를 선택하기 전에, 전체 로봇 구조,로드 사이트 및 게이트 자체의 다른 부분에 의해 소화되지 있는지 확인선택의 효소. 이 시험에서, NEBCutter 0 커터 목록 (전체 시퀀스를 잘라하지 않는 효소) 장내 세균 감염의 존재를 나타낼 수있는 잠재적 인 효소로 엔테로 Pantoea agglomerans에서 고립 강조 EagI,,. - 게이트는 지금 (노란색 표시 EagI 제한 사이트)처럼 보이는 :
[나선 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTCGGCCGGCTAGAG-3 '
[나선 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAGCCGGCCGATCTC-5 '
이 디자인 가정합니다 참고로 소화 한 후, 순서 "GTGAGTTCGG"(T m = 32 ° C) 로봇이 더 이상 폐쇄 보유 할 수있을만큼 충분히 길어야 또는 열역학적으로 안정되지 않습니다. 이 가정은 대부분 실험적으로 확인해야합니다. - 두 번째 문은 로봇이 하나의 효소 반응 할 것, 또는 다른 사이트를 디자인 할 수 있습니다, 로봇의 증가 특이성이 경우 동일 할 수 있습니다. 더 많은 제한 사이트는, 같은 가닥에 추가 할 수 있습니다 로봇의 복잡성과 특이성을 주름 잡는.
- 문은 로봇이 활성 상태로 비활성으로 전환하고 페이로드를 노출되는시 생물학적 입력의 특성을 결정합니다. 각 단일 dsDNA 게이트 하나의 생물 입력 (또는 그 이상)에 대한 응답을 인코딩 할 수 있습니다, 로봇 활성화에 필요한 입력의 프로파일을 정의 할 수 있도록.
- 로드 사이트 :
- 로드 사이트는 보편적 인 순서가 될 수 있습니다. 또한,로드 사이트는 모듈을 감소하지만,화물 방향과 비율 (화물의 다양한 유형)에 대한 제어를 향상시킬 것입니다 고유 한 시퀀스를 기반으로 할 수 있습니다.
- 스테이플 방향에 따라, 화학 그룹이 올바른 말 (5 '또는 3')에 장착되어 있는지 확인 단백질, 나노 입자 등 : 마지막으로,로드 사이트 올리고 뉴클레오티드는 그들이 어떤 페이로드로 활용 할 수 있도록 화학 작용기를 포함해야합니다 .
11. CANDO의 결과를 시뮬레이션
- 작업. JSON 파일로 저장 한 후,이를 분석 CANDO에 업로드 할 수 있습니다. CANDO는 솔루션 21의 강성과 안정성을 예측할 수 DNA 구조의 유한 요소 기반의 시뮬레이션입니다.
- 이동ami.org / "대상 ="_blank "> http://cando-dna-origami.org/
- "분석을 위해 caDNAno 파일 제출"필요한 모든 정보를 채우기를 클릭합니다.
- CANDO의 분석은 보통 15-20 분 소요됩니다. 끝에서 전자 메일 메시지는 우리가 분석 시뮬레이션 결과 (그림 26)를 다운로드 할 수있는 링크를 제공 완료된 알 수 있습니다.
12. 주문 DNA와 겹 로봇
일단 디자인 프로세스가 완료되고 CANDO 분석은 제품의 만족 예측 9-10을 주문할 수 섹션에서 생성 된 스테이플 가닥의 목록을 보여줍니다. 일반적으로, 주식 가닥 특히 정화를 필요로하지 않는다 그러나 그러한 문 또는로드 사이트와 같은 특수 목적의 가닥 HPLC로 정제하는 것이 좋습니다.
두 원자 힘으로 접힌 구조의 시각화를 포함한 제품의 단계에 따라 DNA 순서, 즉 폴딩, 정화 및 평가,현미경 (AFM) 또는 전송 전자 현미경 (TEM)이 문서의 범위 밖이며, 이전 보고서 17,18,20,21에서 찾을 수 있습니다. 여기에 디자인 된 로봇의 TEM 이미지는 예를 들어 (그림 27)과 같이 주어진다. 시료 전처리 및 염색 정확하게 다른 21 기술 실시 하였다.
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Representative Results
수치는 1-25 설계 프로세스 단계별로 보여주는 caDNAno 2.0 인터페이스의 스크린 샷입니다. 형상의 단면을 먼저 비계 가닥 조각과 전체 발판 경로 (그림 7)의 완료의 자동 첨가하여 (그림 3) 설명했습니다. 스테이플 가닥이 자동으로 (그림 12) 추가 된 사용자 정의 매개 변수 (그림 14)에 따라 고장, 장치의 원하는 기능 (그림 15-18)에 스테이플을 적응 수동으로 편집. 수치는 23-24 로딩 방법을 설명하는 사이트 게이트 가닥을 추가하고 편집합니다. 마지막으로, 그림 27은 여기에 설계 모델의 TEM 이미지를 보여줍니다.
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그림 1. caDNAno 2.0 설계 및 오토 데스크 마야 2012에 의해 생성 된 완성 된 로봇의 3D 모델입니다.
그림 2. caDNAno 2.0/Autodesk 마야 2012 디자인 인터페이스의 전망. 상단 패널 : 초기 모양을 정리를위한 격자 패널. 하단 패널 : 편집위원회. 오른쪽 패널 :. 3D 모델 생성기 (2.1 절 참조) 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 상단 PA의 모양의 부분을 그리기NEL (2.3 절 참조).
그림 4. caDNAno 2.0 바닥 (편집) 패널. 따라서 그리드 편집 작업이 발생하는 곳 오렌지 수직 막대를 결정합니다. 오른쪽 상단 모서리에있는 회색 화살표는 (2.4 절 참조) 양쪽에 눈금을 확장하는 데 사용됩니다.
그림 5. 상단 패널의 초기 개요 (섹션 2.5 참조) 한 후 비계 물가의 초안. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 6. 모든 비계 가닥 경로 모서리를 선택하고 (2.7 절 참조) 원하는 길이로 경로를 확장.
그림 7. 편집 작업과 함께 실시간으로 어떻게 3D 모델 변경을 설명 아래쪽과 오른쪽 패널의 일반보기. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 8. 나선 사이에 파란색 다리 아이콘 (빨간색 아이콘 스테이플 교차 참조와 아직 표시되지 않은 섹션 2.9 참조) 비계 크로스 오버가 허용되는 위치를 나타냅니다.
그림 9. 새로운 발판을 만들기는 (섹션 2.10을 참조) 선택의 교량 아이콘을 클릭하여 크로스 오버.
그림 10. 나선 29, 30 (3.2 절 참조)과 축 (크로스 오버 그리드의 왼쪽에 최대한 가까운) 만들기.
그림 11. (4.1 절 참조)로드 사이트의 분기를 안내 나선을 추가.
그림 12. "AutoStaple"작업 후 청사진을. 하단 패널과 오른쪽 패널에있는 스테이플 색상 일치 (5.1 절 참조). 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 13. "AutoBreak"대화 상자가있는 사용자는 (5.2 절 참조) AutoBreak 매개 변수를 정의 할 수 있습니다.
그림 14. "AutoBreak"작업 후 청사진 (5.2 절 참조). 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 15 스테이플 I의 수동 편집 :. 나선 29, 30에서 건너와 삭제해야 스테이플 위치.
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그림 16 스테이플 II의 수동 편집 :. 위치 스테이플 사이의 교량을 삭제.
그림 17 스테이플 III의 수동 편집 :. 조각난 스테이플을 따라 이어 맞추는 흠 (5.5 절 참조).
그림 18. 나선 29 ~ 30 더 크로스 오버를 표시하지 사이에 전체 간격은 (5.5 절 참조) 두 가지를 연결합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 19. 굵은 선 (그들은 너무 오래 또는 원형, 하나 너무 짧은 나타내는, 5.6 절 참조)에 그려진 스테이플을 수동으로 편집.
그림 20. 사이트 분기를 (6.1 절 참조)로드에 대한 가이드 나선을 추가. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 21. 가이드 나선에 스테이플 가닥을 수동으로 추가되므로 분기 포인트 (6.2 절 참조) 위치 될 수. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 22. (섀시 스테이플 최소한의 편집을 필요로 하나, 섹션 6.5 참조) 편리한 위치에 로봇 섀시 발판을로드 사이트 크로스 오버를 소개합니다.
일에서 본 그림 23.로드 사이트 스테이플보기(6.9 절 참조) 더 이상 필요하지 가이드 나선을 제거한 후 E 바닥 패널입니다.
그림 24. 나선 29, 30에서 게이트 물가로 사용하려고하는 두 개의 스테이플을 확장. 두 가닥 게이트 양면 (7.4 절 참조)의 형성에 필수입니다 반대 방향을 향하도록합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 25. 비계 시퀀스 추가 ( "시퀀서"도구) 대화미리 정의 된 발판 중 하나 중 하나를 선택하거나 (8.1 절 참조) 사용자 정의 시퀀스를 삽입 할 수 있도록 상자.
디자인의 CANDO 분석 그림 26. 결과는 여기에 설명. 시뮬레이션은 요청 된 정보를 제공하는 다양한 파일을 포함. 우편 아카이브를 생성합니다. 여기 RMSF (루트 광장 변동을 의미) 파일 (. PNG)은 색의 "HeatMap4RMSF.txt"라는 이름의 첨부 파일에 설명 된 키에 따라 3보기 각도에서 디자인의 모델을 보여 그려져있다. 이 경우 최소 RMSF (가장 푸른)는 1.03 nm의, 그리고 95 % RMSF (redest)는 3.19 nm의 것입니다. 모델에 걸쳐 컬러의 그라데이션 '앞을 일으키는 원인이 로봇의 극성 ('앞 '에있는 게이트'다시 '의 축)과 나선 29-30 및 61-0에 따라 더 연결 스테이플가 없다는 사실에서 유래 다시 '측면보다 더 변동'면.
그림 27.이 문서에서 설계된 로봇의 TEM 이미지. 시료 전처리 및 염색 정확하게 다른 21 기술 실시 하였다.
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Discussion
DNA 종이 접기는 우리가 나노 스케일에서 임의의 기능을 정확하게 정의 된 개체를 조작 할 수 있습니다. 중요한 다음 단계는이 디자인에 기능 통합 될 것입니다. 많은 응용 프로그램과 도전이 기술로 해결 될 수 있지만 이러한 DNA의 자연 환경을 대표로, DNA 종이 접기의 치료 및 과학 로봇 제작에 특별한 관심이있다. DNA는 이미 유전 정보 저장 매체로 세포에서 분자 기계와 인터페이스를 제공합니다. 흥미롭게도, 나노 로봇 또는 다른 기계에있는 접힌 DNA는 여전히 출력 시퀀스의 일부로, 나노 로봇 붕괴 후 원하는 단백질의 발현에 전달 될 수있는 건축 재료 일뿐만 아니라 유전 정보로 제공 할 수 있습니다.
이 문서에 설명 된 예제에서, 우리는 로봇을 운영하는 제한 효소를 사용합니다. DNA 로봇이 respon 수있는 그러나, 추가 메커니즘입력에 D는 다음과 같습니다.
분자 인식 : 우리가 최근 대상 셀 (20)의 표면에 단백질 분자를 인식 DNA의 로봇 앱 타머 기반의 게이트를 보여 주었다. 의 aptamers는 기업에서 아웃소싱, 또는 앱 타머 데이터베이스 (에서 사용하는 같은 SELEX 23 같은 방법을 사용하여 체외에서 선택할 수 있습니다 http://aptamer.icmb.utexas.edu/을 ). 의 aptamers를 고용하는 경우, 그것은 함께 게이트를 형성하는 압 타머, 보완 가닥이, 압 타머의 리간드와 상호 보완적인 가닥의 변위 바인딩 용이하게 불일치를 포함하도록 설계 할 수있는 고려하는 것이 중요합니다. 수있는 메커니즘이 알 수 있지만, 앱 타머 기반 게이트의 민감도와 특이도는 하나 매우 엄격하지만, 비효율적 문, 또는 빨리 얻으려면 두 가닥 사이의 불일치 %를 증가 또는 감소에 의해 조정할 수 있습니다하지만 새는 하나.
효소 절단이 들어, 게이트는 그들이 그 효소의 기판을 포함하는 등 설계되어야한다. 예를 들어, 단백질 분해 효소의 작은 펩티드 기판은 양쪽에서 로봇이 효소의 결핍에 폐쇄 유지할 게이트에 닿는 할 수 있습니다.
원격 제어 : DNA 시스템에 적용되지 않은 잠재적 인 접근 방법은 dsDNA 녹는 24을 유도하는 고주파 전자기장에 금 나노 안테나를 사용하고 있습니다. 이 생체 반응에 더하여 사용자 조작 스위치를 제공 할 수 있습니다. DNA 종이 접기 로봇을 디자인하고 만들 비교적 간단하지만, 그들은 치료 플랫폼으로 여러 가지 기술적 인 문제를 포즈. 그것은 핵산에 의한 절단에 매우 취약으로 DNA 약물 전달을위한 이상적인 물자 없습니다. 또한, 그것은 면역 반응을 침전 수 있습니다. 유기체의 DNA 종이 접기 객체의 동작에 대한 철저한 연구는 N입니다자신의 운명을 정의하고 그들이 조직에서 집계하지 또는 호스트 게놈에 통합 있는지 확인 eeded.
요약하면, 우리는 caDNAno, 디자인 DNA 종이 접기 모양을 간단하고 강력한 CAD 도구의 사용을 제시 하였다. 우리는 치료제, 에너지, 메타 물질, 교육 등의 분야에서, DNA 종이 접기의 응용 프로그램 중심의 연구를보고 시작하도록하겠습니다. 모든 장소에서 caDNAno이 솔루션을 실현에 상당한 영향을 미칠 것으로 예상된다. 미래에, 그것은 그들이 모두 호환되기 때문에 모든 사용자 (또는 수의 부품) 대체 할 수있는 산업 디자인 표준이 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
저자는 매우 가치있는 토론과 조언과 도움이 토론과 작품에 대한 좌파 연구실의 모든 구성원에 대한 S. 더글러스 감사드립니다. 이 작품은 바 일란 대학의 나노 기술 및 고급 재료의 생명 과학 연구소 학부에서 교부금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autodesk Maya 2012 | Autodesk | A student/academic account needs to be created first (see platform-specific instructions in http://cadnano.org) | |
| caDNAno 2.0 (software) | (Open source) | Software for the design of DNA origami structures http://cadnano.org | |
| Cando (webpage) | (Open source) | Webpage running a simulator of DNA origami shapes http://cando-dna-origami.org |
References
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