Projetando um robô Bio-responsivo de DNA Origami

Summary

Origami de DNA é um método poderoso para a fabricação de objetos em nanoescala precisos, programando a auto-montagem de moléculas de DNA. Aqui, nós descrevemos como DNA origami pode ser utilizado para criar um robô robótica capaz de sentir sinais biológicos e responder pela forma de deslocamento, posteriormente retransmitida para o efeito desejado.

Abstract

Ácidos nucleicos são surpreendentemente versátil. Em adição ao seu papel natural como meio de armazenamento de informação biológica ^1, eles podem ser utilizados em computação paralela ^2,3, reconhecer e ligar alvos celulares ou moleculares ^{de 4,5, 6,7} catalisar reacções químicas, e gerar respostas calculados numa biológica Sistema de ^8,9. Importante, os ácidos nucleicos podem ser programados para se auto-organizar-se em estruturas de 2D e 3D ^10-12, permitindo a integração de todas estas características notáveis ​​em um único robô que ligam a detecção de sinais biológicos para uma resposta programada a fim de exercer um efeito desejado.

Criando formas de ácidos nucléicos foi primeiramente proposto por Seeman ^13, e várias variações sobre o tema já foram realizados usando várias técnicas ^11,12,14,15. No entanto, o mais importante é, talvez, o proposto por Rothemund, denominado scaffolded DNA origami16. Nesta técnica, a dobragem de um comprimento (> 7000 bases) em cadeia simples do ADN "andaime" é dirigida para uma forma desejada por centenas de cadeias complementares curtas chamadas "grampos. Dobramento é efectuado por rampa de temperatura de recozimento. Esta técnica foi demonstrado com sucesso na criação de um conjunto diversificado de formas 2D com precisão notável e robustez. DNA origami foi mais tarde estendido para 3D, bem ^17,18.

O presente trabalho terá como foco o software caDNAno 2.0 ¹⁹ desenvolvido por Douglas e colegas. caDNAno é uma ferramenta CAD robusta e fácil de usar que permite o desenho de 2D e 3D origami de DNA formas com características versáteis. O processo de projeto depende de um esquema de abstração sistemática e precisa de estruturas de DNA, tornando-se relativamente simples e eficiente.

Neste artigo, demonstramos o projeto de um origami de DNA nanorobot que foi recentemente descrito ^20. Este robot é 'robótico' no sentido em que ele se vincula detecção da actuação, a fim de executar uma tarefa. Nós explicar como vários esquemas de detecção pode ser integrado na estrutura, e como esta pode ser retransmitido para um efeito desejado. Finalmente usamos Cando ²¹ para simular as propriedades mecânicas da forma concebida. O conceito de discutirmos pode ser adaptada para várias tarefas e configurações.

Protocol

O robô que vai criar neste documento responde a uma proteína P fazendo uma carga C disponível para se ligar a receptores na superfície de uma célula-alvo escolhida. O robô é mostrado na Figura 1, C pode ser um medicamento de bloqueio do receptor,. De um factor de crescimento, etc, e de uma maneira de ligação é quimicamente a um oligonucleótido de ADN devem estar disponíveis a não destruir a sua função. O robô tem dois estados. Quando inativos portões, DNA nas duas "lábios" externos são cruzados, certificando-se que o robô permanece fechada de tal forma que qualquer carga embarcada dentro dele está bem seqüestrado. Na presença da proteína P, as portas abertas por qualquer um dos vários mecanismos (discutido abaixo) que permite o robô a abrir e expor a carga. Ao projetar a estrutura, considere que o robô tem de ser flexível o suficiente para fechar sobre si mesmo no estado fechado, e primavera para o estado aberto quando os portões habilitá-lo a fazê-lo. Modelando o comportamento de um ADN estrutura de integração termodinâmica e componentes mecânicos é difícil, eo objeto real pode exigir algum iterativo de melhoria. No entanto, aqui vamos nos concentrar no processo de projeto através de um modelo geral de trabalho, que pode ser aproveitada.

Nota

Para uma compreensão mais abrangente do processo de projeto DNA origami e dobradura, é altamente recomendável a leitura do papel caDNAno original de Douglas e colegas ^19, que explica a representação abstrata de DNA no design de interface e como ele se relaciona com a estrutura molecular real de um forma DNA 3D. Este documento é acompanhado por dois vídeos tutoriais que descrevem a representação caDNAno ea interface de uma forma muito clara. Além disso, recomendamos a leitura do artigo mais recente de Dietz e seus colegas descrevem muitos aspectos importantes e protocolos detalhados do processo de dobramento, incluindo a ferramenta de análise Cando ^21.

tle "> 1. Baixe e instale caDNAno 2.0 e Autodesk Maya 2012

Nota: O software Autodesk é gratuita para estudantes e uso acadêmico. As instruções abaixo incluem a criação de uma conta acadêmico da Autodesk.

1. Criar uma conta acadêmico http://students.autodesk.com/ . Depois de receber a configuração da conta de e-mail, clique no link de ativação e preencher suas preferências se o desejar.
2. Baixe a versão gratuita do Maya 2012 do centro de download.
3. Instale Maya 2012 em seu computador.
4. Executar Maya uma vez antes de instalar caDNAno 2.0.
5. Baixe e instale a última versão do caDNAno 2.0 de http://cadnano.org/ .
6. Executar Maya 2012. Um ícone caDNAno deve aparecer no canto superior direito da interface gráfica do usuário. Clique no ícone para entrar em caDNAno.

2. Define a forma desejada e Scaffold Strand Path

1. A interface do cartão de dentro de caDNAno Maya inclui três painéis (Figura 2):
   1. Painel superior: vista da estrutura, onde a forma é inicialmente delineado. Este painel permite acções duplas de nível de hélice e proporciona uma vista em corte da forma.
   2. Painel inferior: painel de edição, permitindo que as ações individuais de nível de base.
   3. Painel direito: um modelo 3D em tempo real Maya gerado da forma
2. Clique no ícone "Honeycomb". Aproximar-se e sair da malha no painel superior pode ser feito pelo mouse rolar para cima e para baixo, respectivamente.
   caDNAno permite duas possíveis reticulados projeto, favo de mel e quadrado; neste artigo, vamos utilizar o layout de favo de mel, embora a rede quadrada pode ser usado geralmente bem ^22.
3. Comece por desenhar a secção da forma desejada no painel esquerdo.
   Cada círculo representa uma dupla hélice do DNA. Para chOOSE as hélices que constroem a forma, basta clicar em seu centro (Figura 3). Continuar hélice por hélice até que toda a forma é descrita. Alternativamente, a forma pode ser desenhado, pressionando o botão esquerdo do mouse e continuamente desenhando o contorno da forma. Qualquer ação pode ser desfeita clicando no menu Editar e "Desfazer", ou pelo atalho de teclado CTRL + Z (PC) ou CMD + Z (Mac).
   Neste ponto, as hélices selecionadas aparecerão amarelo. Ao mesmo tempo, o painel de fundo apresenta uma vista lateral da forma, composta por estas hélices. A numeração no painel inferior hélice é consistente com a numeração no topo.
4. Observe o painel inferior. Cada hélice é representada por duas filas de quadrados: as linhas são as duas cadeias da hélice dupla, com cada quadrado representa uma base (Figura 4).
   A barra vertical laranja determina onde ações de edição ocorrerá ao longo de uma hélice. A posição de base ao longo da grade aparece comoum número acima da barra laranja. O comprimento do quadro hélice padrão é de 42 bases. O comprimento pode ser estendido, clicando em um dos ícones de seta cinza no canto superior direito do painel de edição e escolher o comprimento de extensão (em múltiplos de 21, que correspondem a duas voltas completas do hélice do DNA, em que uma vez se estende por 10,5 bases) (Figura 4). A grade irá estender-se na direcção da seta escolhido.
5. Para traçar o caminho real vertente andaime em toda a forma, pressione o botão do mouse, começar a partir do primeiro hélice e ir continuamente ao longo de todas as hélices seguindo a mesma ordem em que foram inicialmente selecionados na seção 2.3. Note-se que:
   1. As hélices seleccionado desta vez vai mudar de cor de laranja.
   2. No painel inferior, andaime fragmentos vertente será automaticamente atraídos para as hélices seleccionadas.
   3. O painel da direita mostra o modelo 3D da forma que está sendo construído em tempo real. No final destaprocesso, um projecto do caminho vertente andaime será automaticamente traçada no painel inferior (Figura 5).
6. Desenhe um retângulo em torno de todas as bordas mais à esquerda do caminho do cadafalso. Note-se que as bordas de modo selecionados serão exibidos vermelho (Figura 6).
7. Estender o caminho andaime arrastando as bordas seleccionadas como um grupo para o lado esquerdo da grelha. Repita esse processo para as margens direita até que o caminho está bem estendido. Note-se que também se estende extensão andaime a forma 3D no painel da direita (Figura 7).
8. Localize as partes do caminho andaime que estão isolados do resto, e conectá-los. Na nossa forma de, por exemplo, 0-9 hélices formam uma parte isolada. Helix 9 precisa ser conectado a hélice 12 (note que hélices 9 e 10 não são adjacentes na forma [painel superior] para que eles não podem ser ligados).
9. Zoom e os fios a serem conectados, e usando a ferramenta "Select", clique em qualquer ponto em umados fios. Ao clicar em qualquer ponto ao longo de um fragmento azul andaime, ícones de "ponte" aparecem entre hélices, indicando as posições onde crossovers são permitidos. Nestas posições, bases em hélices adjacentes enfrentar uns aos outros diretamente, permitindo que os fios para passar de hélice para hélice sem deformar ou torção do DNA. O número que aparece ao lado de cada ícone ponte indica o número de hélice que vai cruzado para (Figura 8).
10. Para criar crossovers, à esquerda, clique no ícone da ponte de escolha. A passagem de andaime serão gerados, ou seja, o andaime atravessa neste momento de hélice para hélice (Figura 9). Repetir este processo até que todas as atravessa andaime hélices e cria um circuito fechado que se estende por toda a forma, não deixando regiões que são isolados a partir do resto da forma.
    Observe que, enquanto crossovers parecem abrangem uma distância no software, na realidade, eles não incluem qualquer base de DNA. Fisicamente, o crossover"Ponte" contém apenas uma unidade de fosfato da espinha dorsal do ADN que liga as duas bases das hélices adjacentes juntos.
11. Antes de passar para o próximo passo, certifique-se de todo o andaime é contínuo, e nenhuma parte dele é isolado dos outros.

3. Definir abertura Machados Mecanismo

O robô descrito é aberta em resposta a uma entrada biológico definido para expor a sua carga. Abertura ocorre de forma shell-like, com duas metades (hélices 0-29 compõem metade, hélices 30-61 compõem a segunda metade) girando em torno de dois eixos. Os eixos são formados por cruzamentos entre as hélices 29-30 e 61-0, que são os únicos cruzamentos entre essas metades e estão posicionados apenas na ou perto da borda esquerda da grade. A borda direita irá conter as cadeias Gate (discutido abaixo).

1. Apague o cruzamento existente entre hélices 29-30. Para apagar o crossover, clique no ponto "joelho" em qualquer vertente.Isso deixa um nick em ambas as vertentes, onde o crossover costumavam ser. Para costura os nicks, pressione a tecla SHIFT e clique em cada nick.
2. Criar um novo cruzamento entre as hélices 29-30 tão perto quanto possível da borda esquerda da grade (Figura 10).
3. Criar um novo crossover entre hélices 61 e 0 o mais próximo possível da borda esquerda da grade.

4. Definir Payload Sites anexos

Depois que terminar de traçar o caminho vertente andaime, precisamos definir a fixação de carga (carregamento) sites. Carregar sites são na verdade fios de grampos que se estendem para fora de suas hélices como único "ramos" irrecuperáveis. Por isso, é importante definir com muita precisão onde ao longo da hélice esta ramificação ocorre, para ter certeza que se estende até a direção desejada. Se definirmos extensões descontínuas arbitrariamente, locais de carregamento pode ocorrer no lado externo do robot em vez do lado interno.

To Certifique-se um grampo prolonga-se para uma direcção específica apenas, marcamos uma hélice adicional, que serve como guia para a ramificação direccional do grampo a partir do corpo principal. Depois de estender o local de carregamento de grampos desejado, a guia helicoidal é removido.

1. Vamos definir quatro locais de carga voltados para o lado interno do robô. Os locais de carregamento irá ramificar-se de hélices 3, 27, 34 e 58. Para cada site, no painel superior, clique no hélice imediatamente adjacentes a estas hélices que enfrenta o lado interno (Figura 11). Isto adicionará as hélices para a grade no painel inferior. Não segundo clique destas hélices ainda.

5. Adicionar e editar Staples

1. Clique em "AutoStaple". O software adiciona automaticamente sequências descontínuas em várias cores (Figura 12). Note-se que os grampos foram adicionados a forma 3D no painel da direita. Cores de grampos são consistentes para os painéis de fundo e à direita. Em comum, alémem diante, não é um indicador no canto inferior esquerdo da interface, o que indica um grampo.
   Nota: os grampos não pode ser muito longo, muito curto ou circular. A maioria dos grampos gerada aqui não atender a esses critérios, e tem que ser editado. O primeiro passo para editá-los é automático (veja o próximo passo).
2. Clique em "Entrada automática". Uma caixa de diálogo será aberta (Figura 13), pedindo para os parâmetros definidos pelo usuário para essa ação:
   1. Comprimento alvo (pb): comprimento previsto de grampo, se possível
   2. Comprimento Min (pb): comprimento mínimo permitido para um grampo
   3. Comprimento Max (pb): comprimento máximo permitido para um grampo
   4. Min dist XOver (pb): o número mínimo de pares de bases de um grampo pode deslocar entre a sua extremidade e uma passagem ou entre dois cruzamentos.
      Use os parâmetros padrão, clique em OK. O software vai quebrar os grampos de acordo com esses parâmetros para o melhor de sua capacidade (Figura 14).
3. Apague todos os crossovers básicos entre hélices 29-30 e 61-0, para permitir que estas hélices para separar e permitir que o robô a abrir. Apagar crossovers grampos vai exigir alguma edição manual de grampos corretos que se tornam muito curtos ou irracionais, como resultado desta ação. Para fazer isso corretamente, siga as instruções nas seções a seguir.
   Certifique-se de deixar os crossovers andaime criados nas seções 3.2 e 3.3 intactas.
4. Considere-se, por exemplo, a primeira passagem de grampos (ciano e preto grampos) desde a esquerda entre as hélices 29 e 30 (Figura 15). Apague as duas pontes desse cruzamento clicando em cada ponto do joelho ou ponte para que ele aparece em vermelho, em seguida, bater APAGAR (Figura 16).
5. Costura os dois grampos em hélice 29 pressionando SHIFT e clicando no nick entre eles. Do mesmo modo, os três grampos costura sobre mecha 30 para um único grampo (Figura 17). Staples podeser prorrogado ou reduzido manualmente clicando em uma extremidade e arrastando-se o desejar. Tome cuidado para não circularizar qualquer grampo. Figura 18 mostra a diferença entre hélices 29-30 após a edição completa de crossovers básicos. Repita esse processo para hélices 0 e 61, e editar manualmente todos os grampos em cada hélice.
6. Localize grampos que são atraídos por uma linha grossa, o que significa que exigem edição posterior. Analisar cada um e corrigir, se necessário. Por exemplo, os grampos que são demasiado curto podem ser apagadas (Figura 19) ou estendido, se possível.

6. Criar Carregando Sites e portões

1. Segundo clique nas hélices do site de carregamento no painel superior, e estender os fragmentos resultantes vertente andaime no painel de fundo clicando em uma extremidade e arrastando-o tão desejado (Figura 20).
2. Adicionar manualmente grampos para esses fragmentos andaime, colocando a barra vertical laranja na posição desejada ao longo de tele andaime, passando por cima das hélices guia no painel esquerdo, segurando SHIFT e clicando. Isto irá adicionar um precursor de grampos em cada hélice (Figura 21).
3. Estender os precursores básicos de corpo inteiro também, clicando e arrastando.
4. Localize os ícones ponte vermelha, denotando posições cruzamento permitido entre o fio guia (por exemplo, hélice 62) eo chassi (por exemplo, hélice 3).
5. Escolha o local mais conveniente para apresentar um crossover e clique no ícone da ponte (Figura 22). A localização conveniente, requer um mínimo de edição de grampos existentes no chassis.
6. Na hélice guia (hélice 62), exclua a parte de grampo que não é uma parte do local de carregamento, e encurtar a parte participante para o comprimento desejado. O comprimento desejado deve proporcionar tanto a especificidade para carregar diferentes tipos de carga, e a força de ligação. Normalmente, uma cauda de 18 mer deve ser fino. Verifique se o grampo continua drawn por uma linha fina, caso contrário, editá-lo até que ele esteja.
7. No chassis, editar os grampos alterados conforme necessário.
8. Apague a guia (hélice 62), deixando apenas a extensão do grampo.
9. Repita os passos de 6,4-6,8 para todos os locais de carga (Figura 23).

7. Projetando Vertentes Portão

Os fios da porta são os únicos fios, exceto para os eixos, ligando hélices 29-30 e 61-0. Em contraste com os eixos, os fios não são de portão cruzamentos. Em vez disso, eles hibridizam para formar um segmento de cadeia dupla, que serve como o sensor para a entrada biológica de escolha. Uma vez que os sobrados portão são deslocadas, o robô inteiro pode entropicamente giram em torno dos eixos e abertos.

1. Localize as posições corretas de fios portão. Estes serão os grampos em hélices 29, 30, 61, e 0.
2. Por exemplo, examine o portão região 29-30. Existem fios descontínuas convenientes que flanqueiam as hélices 29 e 30 sobre olado direito da grade, que podem ser usados ​​como fios de porta. Note-se que elas enfrentam direcções opostas.
3. Clique na borda de uma das vertentes de porta em potencial para estendê-lo do lado de fora da forma. Se a borda encontra-se sobre um crossover andaime, a sua seleção poderia ser simplificado, tornando-se apenas "Stap" (les) são selecionáveis, clicando off "Scaf" (dobra) na barra de ferramentas "selecionável" no lado superior direito da interface .
4. Estenda ambos os grampos para formar os fios da porta. Editar os grampos se esta extensão requer que (Figura 24). Repita este procedimento para os fios portão de hélices 0 e 61.
   Note-se que, por agora, o comprimento real não importa, uma vez que o DNA sensor (eg aptamero) vai substituir as seqüências vertente portão na etapa de conclusão seqüência.

8. Escolha Scaffold Sequence

1. Clique na ferramenta "Seq". Coloque o cursor em qualquer lugar da costa do andaime e clique. Uma caixa de diálogo se abrirá perguntando-nosescolher a fonte de DNA andaime (Figura 25).
2. Escolhendo o ADN fonte depende muito do tamanho do robô. Por exemplo, M13mp18 ssDNA (p7249), e seus derivados estendidos (p7308 etc), que geralmente têm sido a escolha para as grandes formas do origami de DNA, se encaixam quando o fio andaime é de aproximadamente 7 kb de comprimento. Se o andaime da forma concebida é significativamente menor do que a fonte escolhida, o excesso de fio de andaime que não está hibridado com qualquer grampo irá criar um circuito de ssDNA saliente da forma dobrada. Embora este problema geralmente representa pouco para loops relativamente curtos, laços longos multi-kb poderia interferir drasticamente com dobragem e função do robô. Por isso, é importante para se ajustar a fonte escolhida para o comprimento do andaime forma.

Por exemplo, se a vertente andaime necessário para dobrar uma forma pequena é de aproximadamente 1.600 bases de comprimento, o que é significativamente menor do que as fontes pré-definidas na caixa de diálogo, uma sequência personalizada podeser usado como andaime. Várias fontes podem ser consideradas. Por exemplo, pode ser a M13mp18 digerido com uma enzima de restrição específica, que produz um fragmento com o comprimento desejado. Projetando tal fonte pode ser feito em NebCutter ( http://tools.neb.com/NEBcutter2/ ) colando a seqüência M13mp18 na janela de entrada NebCutter, e mapeamento de locais de restrição. Outra opção é usar ADNcs pré-digerido, como o phiX174 virião ADNcs HaeIII digest, disponível a partir de New England Biolabs.

3. Na caixa de diálogo, clique em "M13mp18". Note-se que a sequência de ADN escolhida foi adicionado ao andaime e fios de grampos no painel inferior.

9. Export Sequence Staple como uma planilha

1. Clique em "Exportar" na barra de ferramentas superior, e escolha um nome de arquivo de destino para a lista de grampo. Clique em "Salvar".
2. Localize o arquivo csv de destino. E abri-lo.
3. A folha de cálculo mostra a lista de grampos, que podem ser enviados como é uma empresa de síntese de DNA. As duas primeiras colunas exibir as coordenadas de início e fim, com o número fora dos parênteses, denotando número hélice eo número entre parênteses denotam posição de base.

10. Atribuir portão e Carregando Seqüências

1. Na lista de grampo, você vai notar que algumas seqüências de começar ou terminar com uma série de pontos de interrogação "???". Estes pontos de interrogação indicam que desde que não há qualquer fio andaime hibrida com estas regiões descontínuas específicos, eles não podem ser atribuídos sequências complementares. Estes são, de facto, as extensões de nós projetamos para os fios portão e locais de carga e, portanto, estes precisam ser atribuído manualmente agora. Gate:
   1. Os portões de determinar a natureza da entrada biológico sobre o qual o robot vai alternar entre inactivo para o estado activo e expor a sua carga. Cada uma única porta de dsDNA pode codificar resposta a uma entrada biológica (ou mais), então um perfil de entradas necessárias para a activação do robô podem ser definidos.
      Suponhamos, para este exemplo, que o taco de desencadeamento da activação biológica robô é uma enzima de restrição, o que pode indicar a presença de bactérias infecciosas.
   2. Primeiro, considere que os ssDNA fios portão não hibridizar imediatamente após ramificando para fora de suas hélices. Projetando o portão de outra forma poderiam impedir hibridização durante o dobramento. Portanto, cada ramo deve começar com uma corda espaçador. Normalmente usamos poli-T como cadeias de espaçadores, pois esta seqüência fornece flexibilidade.
   3. Também se assume que o comprimento da região de hibridação é a porta 20 bases, contendo o alvo de restrição site no seu meio.
   4. Portanto, o portão pode ter esta aparência:
      [Hélice 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTxxxxxxGCTAGAG-3 '
      [Hélice 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAxxxxxxCGATCTC-5 '
      O "....." denotam a região de grampo que hibrida com a cadeia de andaime, por isso, tem já uma sequência e não deve ser mudada.
      O duplex aleatório "GTGAGTT" e seu complemento assegura o local de restrição não é parcialmente aberta, e oferece algumas bases extra para assegurar uma digestão eficaz pela enzima.
      O "x" indica o local de restrição.
      O duplex aleatório "GCTAGAG" e seu complemento fornecer algumas bases extras para a enzima para trabalhar de forma eficiente, mas também garante a vertente gate é suficientemente longo para garantir um bom fechamento robô.
      Antes de escolher um sítio de restrição como uma meta, verifique se a estrutura do robô inteiro, locais de carga e outra parte do próprio portão não são digeridas peloenzima de escolha. Neste exame, a lista 0 cortador NEBCutter (enzimas que não cortam a sequência inteira), destacado EagI, isolado a partir da Enterobacter Pantoea agglomerans, como uma enzima potencial que poderia indicar a presença de uma doença infecciosa enterobactérias.
   5. O portão agora se parece com isso (marcas local amarelo restrição EagI):
      [Hélice 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTCGGCCGGCTAGAG-3 '
      [Hélice 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAGCCGGCCGATCTC-5 '
      Note-se que este desenho assume que após a digestão, a sequência "GTGAGTTCGG" (T ₌ 32 ° C) não é suficientemente longo ou termodinamicamente estáveis ​​para manter fechado o robô mais. Esta hipótese mais provável deverá ser verificado experimentalmente.
   6. A segunda porta pode ser o mesmo, caso em que o robot só responderá a uma enzima, ou pode ser concebida com um local diferente, aumentando a especificidade do robô. Mais sítios de restrição pode ser adicionado na mesma vertente, em vincar a complexidade e especificidade do robô.
2. Carregar locais:
   1. O local de carregamento pode ser uma sequência universal. Alternativamente, os locais de carregamento podem ser baseadas em sequências únicas, o que diminuirá a modularidade, mas melhorar o controlo sobre a orientação de carga e proporções (para diferentes tipos de carga).
   2. Finalmente, os oligonucleótidos local de carregamento deve incluir um grupo químico funcional que lhes permite conjugar com qualquer carga: proteína, nanopartículas, etc Certifique-se ao grupo químico é montado na extremidade correcta (5 'ou 3'), de acordo com a direcção de grampos .

11. Simular resultados em CANDO

1. Depois que o trabalho é salvo como um arquivo JSON., Ele pode ser carregado para CANDO para análise. CANDO é uma simulação baseada em elementos finitos da estrutura do DNA, que pode estimar a sua rigidez e estabilidade em solução ^21.
2. Ir aami.org / "target =" _blank "> http://cando-dna-origami.org/
3. Clique em "Enviar um arquivo caDNAno para análise" e preencha todas as informações necessárias.
4. Análise em CANDO normalmente leva até 15-20 min. No final, uma mensagem de e-mail permite-nos saber a conclusão da análise, fornecendo um link para baixar os resultados da simulação (Figura 26).

12. Ordem DNA e Dobre o Robot

Uma vez que o processo de concepção é completo e análise CANDO mostra predição satisfatória do medicamento, da lista gerada em cadeia de grampos secções 9-10 podem ser encomendados. Normalmente, os fios de grampos não necessitam de purificação especial, no entanto, é recomendado que fios para fins especiais, tais como portas ou locais de carregamento ser purificado por meio de HPLC.

Os seguintes passos a fim de ADN, ou seja dobrável, purificação e avaliação do produto, incluindo a visualização da estrutura dobrada por qualquer força atómicamicroscopia (AFM), microscopia electrónica de transmissão, ou (MET) estão fora do âmbito deste documento, e podem ser encontrados em relatórios anteriores ^17,18,20,21. Uma imagem TEM do robô é concebida aqui apresentado como um exemplo (Figura 27). A preparação da amostra e de coloração foi realizada exactamente como descrito noutro local ^21.

Representative Results

Figuras 1-25 são screenshots da interface caDNAno 2.0 mostra o processo de design passo-a-passo. A secção transversal da forma delineada pela primeira vez (Figura 3), seguido por adição automática de andaime fragmentos dos filamentos e na conclusão do caminho de andaime inteira (Figura 7). Fios de grampos são adicionados automaticamente (Figura 12), dividido de acordo com os parâmetros definidos pelo usuário (Figura 14), e editado manualmente para adaptar os grampos para a função desejada do dispositivo (Figuras 15-18). Figuras 23-24 descrevem como carregar local e fios de porta são adicionados e editados. Finalmente, a Figura 27 mostra uma imagem TEM de modelo concebido aqui.

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Figura 1. Um modelo 3D do robô acabado, projetado por caDNAno 2.0 e gerado pela Autodesk Maya 2012.

Figura 2. Uma visão da Maya 2.0/Autodesk 2012 design de interface caDNAno. Painel superior: Painel de treliça para delinear a forma inicial. Painel inferior: painel de edição. Painel direito:. Gerador modelo 3D (ver secção 2.1) Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 3. Desenho da seção da forma no topo panel (ver secção 2.3).

Figura 4. A parte inferior do painel (edição) de caDNAno 2.0. A barra vertical laranja determina onde irá ocorrer ao longo das ações de edição de grade. As setas cinza no canto superior direito são usados ​​para estender a rede para ambos os lados (ver secção 2.4).

Figura 5. Uma minuta do fio andaime após o esboço inicial no painel superior (ver secção 2.5). Clique aqui para ver a figura maior .

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Figura 6. Seleção de todas as arestas do caminho vertente andaime e ampliando o caminho para o comprimento desejado (ver secção 2.7).

Figura 7. Uma visão geral dos painéis de fundo e à direita demonstrando como as mudanças do modelo 3D em tempo real, juntamente com as ações de edição. Clique aqui para ver a figura maior .

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Figura 8. Os ícones ponte entre hélices azuis indicam as posições onde andaime crossovers são permitidos (ícones vermelhos referem-se a cruzamentos de grampos e ainda não são mostrados, consulte a seção 2.9).

Figura 9. Criação de novo andaime cruzamentos clicando nos ícones ponte de escolha (ver secção 2.10).

Figura 10. Criação de um eixo (de um cruzamento de uma estreita quanto possível para o lado esquerdo da grelha) entre as hélices 29 e 30 (ver secção 3.2).

Figura 11. Adicionando hélices que norteiam a ramificação dos locais de carregamento (ver secção 4.1).

Figura 12. O plano após a ação "AutoStaple". As cores de grampos no painel inferior e painel da direita são consistentes (ver secção 5.1). Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 13. A caixa de diálogo "Entrada automática", no qual o usuário pode definir os parâmetros de Entrada automática (ver secção 5.2).

Figura 14. O plano após a ação "Entrada automática" (ver secção 5.2). Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 15 edição manual de grampos I:. Localizar grampos que se cruzam a partir de hélice 29 e 30 e deve ser suprimida.

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Figura 16 edição manual de grampos II:. Eliminar as pontes entre os grampos localizados.

Figura 17 edição manual de grampos III:. Seaming os nicks ao longo grampos fragmentados (ver secção 5.5).

Figura 18. Toda a diferença entre hélices 29-30 não mostrando crossovers ligar os dois (ver secção 5.5). Clique aqui para ver a figura maior .

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Figura 19. Edição manual de grampos desenhado em linha grossa (denotando elas são ou muito curto, muito longo ou circular, ver secção 5.6).

Figura 20. Adicionando hélices guia para carregar a ramificação local (ver secção 6.1). Clique aqui para ver a figura maior .

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Figura 21. Adição manual de fios de grampos para as hélices de guia, para pontos de ramificação podem ser localizados (ver secção 6.2). Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 22. Apresentando um site de carregamento cruzado para o robô chassis andaime em um local conveniente (que exige um mínimo de edição de chassis grampos, consulte a seção 6.5).

Figura 23. Vista dos grampos no local de carga, como visto em popainel de fundo e após a remoção das hélices guia, que não são mais necessários (ver secção 6.9).

Figura 24. Estendendo dois grampos, os quais vão ser usados ​​como fios de porta, de hélices 29 e 30. Note-se que as duas vertentes enfrentar direções opostas, o que é obrigatório para a formação do duplex portão (ver secção 7.4). Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 25. A adição seqüência andaime (ferramenta "Seq") diálogocaixa, o que permite escolher qualquer um dos andaimes pré-definidos, ou para inserir uma seqüência personalizada (ver secção 8.1).

Figura 26. CANDO Os resultados da análise do desenho aqui descritas. A simulação gera um arquivo. Zip contendo vários arquivos que fornecem as informações solicitadas. Aqui os (root mean square flutuação) arquivos (RMSF. Png) são representadas, mostrando um modelo de projeto de três ângulos de visão, colorido de acordo com a chave detalhado no arquivo anexo chamado "HeatMap4RMSF.txt". Neste caso, o mínimo RMSF (mais azul) é 1,03 nm, e de 95% a RMSF (redest) é 3,19 nm. O gradiente de cor em todo o modelo deriva da polaridade do robô (portas em 'frente de, no eixo "para trás») e o facto de que não existem grampos de ligação ao longo de hélices 29-30 e 61-0, fazendo com que a' parte dianteira "lado a flutuar mais do que o 'back'lado.

Figura 27. Imagem TEM do robô concebida neste artigo. A preparação da amostra e de coloração foi realizada exactamente como descrito noutro local ^21.

Discussion

Origami de DNA nos permite fabricar objetos bem definidos com características arbitrárias em nanoescala. Um passo importante seria a integração da função para estes projetos. Ainda que muitas aplicações e desafios poderiam ser abordados com essa tecnologia, há um interesse particular na fabricação de robôs terapêuticos e científicos de DNA origami, uma vez que estes representam um meio natural de DNA. ADN já interage com a maquinaria molecular em células como um meio de armazenamento de informação genética. Curiosamente, o ADN dobrado numa nanorobot ou outra máquina pode ainda servir como informação genética para além de ser um material de construção, o qual pode ser retransmitido para a expressão de uma proteína desejada, após o nanorobot desintegra, como partes de uma sequência de saídas.

No exemplo discutido neste trabalho, usamos uma enzima de restrição para operar o robô. No entanto, os mecanismos adicionais pelos quais os robôs de DNA podem respond para as entradas incluem o seguinte.

Reconhecimento molecular: demonstramos recentemente portões baseados aptâmero para os robôs de ADN que reconhecem moléculas de proteína na superfície das células-alvo ^20. Aptâmeros podem ser seleccionados in vitro utilizando métodos tais como SELEX ^23, a partir de empresas de terceiros, ou a partir da base de dados utilizada aptâmero ( http://aptamer.icmb.utexas.edu/ ). Quando são empregues aptâmeros, é importante considerar que a cadeia complementar para o aptâmero, que em conjunto formam a porta, pode ser concebido para incluir incompatibilidades, o que irá facilitar a ligação do ligando e de deslocamento da cadeia complementar do aptâmero. Enquanto o mecanismo que permite isto é desconhecida, a sensibilidade e especificidade de um portão baseado aptâmero pode ser ajustado aumentando ou diminuindo a% de desfasamento entre as duas cadeias, para obter qualquer um portão muito rigorosa, mas ineficiente, ou um jejummas um vazamento.

A clivagem enzimática: para isso, as portas devem ser concebidos de tal modo que elas contém o substrato dessa enzima. Por exemplo, um pequeno péptido de substrato de uma protease pode ser amarrado a partir de ambos os lados da porta, que irá manter o robô fechada na ausência da enzima.

Controlo remoto: uma abordagem potencial que não tem sido aplicado a máquinas de ADN está a utilizar uma antena nanocristal de ouro num campo electromagnético de alta frequência para induzir dsDNA de fusão ^24. Isto pode proporcionar um comutador operado pelo utilizador para além dos bio-responsivas. Apesar de origami de DNA robôs são relativamente simples de projetar e fabricar, eles colocam vários desafios técnicos como uma plataforma terapêutica. O DNA não é um material ideal para a entrega da droga, uma vez que é altamente vulnerável à clivagem por nucleases. Além disso, pode precipitar uma resposta imunitária. Um estudo aprofundado do comportamento de origami de DNA objetos em um organismo é needed para definir seu destino e se certificar de que eles não agregado em tecidos ou integrar ao genoma do hospedeiro.

Em resumo, apresentamos o uso de caDNAno, um simples, robusta ferramenta de CAD para a concepção de origami de DNA formas. Esperamos começar a ver a pesquisa aplicação baseada em DNA origami, em áreas como a terapêutica, energia, metamateriais e educação. Em todos estes locais, caDNAno deverá ter um impacto significativo sobre a realização das soluções. No futuro, pode tornar-se um padrão industrial e design, que pode ser substituído (ou partes que podem) por qualquer usuário, porque todos eles são compatíveis.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autodesk Maya 2012	Autodesk		A student/academic account needs to be created first (see platform-specific instructions in http://cadnano.org)
caDNAno 2.0 (software)	(Open source)		Software for the design of DNA origami structures http://cadnano.org
Cando (webpage)	(Open source)		Webpage running a simulator of DNA origami shapes http://cando-dna-origami.org