Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Интубации трахеи у мышей Published: April 5, 2014 doi: 10.3791/50269
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 3, 1,2
1Medical and Research Services, VA San Diego Healthcare System, 2Department of Medicine, University of California, San Diego, 3School of Medicine, University of California, San Diego

Summary

Мы разработали простой, надежный и относительно недорогой метод для интубации трахеи у мышей через прямой ларингоскопии с использованием отоскоп с 2,0 мм зеркалах. Этот метод атравматичность и могут быть использованы для повторных измерений в хронических экспериментах. Мы находим его превосходит трахеостомии или ранее сообщалось нехирургических методов.

Abstract

Мыши, как дикого типа и трансгенные, являются основной модели млекопитающих в биомедицинских исследованиях себе. Интубации и механической вентиляции необходимы для целых экспериментах на животных, которые требуют хирургического вмешательства под глубокими анестезии или измерений функции легких. Трахеостомия был стандартный для интубации дыхательных путей у этих мышей, чтобы искусственной вентиляции легких. Оротрахеальная интубация сообщалось, но не был успешно используется во многих исследованиях из-за существенного технической сложности или требования для узкоспециализированной и дорогостоящего оборудования. Здесь мы сообщаем методику прямой ларингоскопии с использованием отоскоп оснащенный 2,0 мм зеркалах и с помощью 20 G внутривенный катетер как эндотрахеальной трубки. Мы использовали эту технику широко и надежно интубировать и провести точные оценки функции легких у мышей. Этот метод доказал сейф, практически без потери животных в опытных руках. Более того, этот методмогут быть использованы для повторных исследований мышам в хронических моделей.

Introduction

Лаборатория мыши вытеснил практически все виды, как основной модели млекопитающих биологии и патобиологии. Лаборатория мыши самый маленький вид млекопитающих, который был четко и подробно показаны свою ценность в качестве модели заболеваний человека и оказывается очень полезной в достижений нашего понимания человеческой биологии и болезней. Короткое время беременности и существенно более низкая стоимость позволило разработать и изучение нулевых и трансгенных мышей в качестве банального инструмента в биомедицинских исследованиях. Тем не менее, размер средней лабораторных мышей (20-25 г) ограничивает их исследование в исследованиях физиологически или хирургическим основе и, следовательно, некоторые исследователи изучают крупных видов млекопитающих. Препятствием для использования мышей в этих исследованиях является трудность с методами интубации, которые позволили бы физиологические измерения или обширные хирургические процедуры под глубоким наркозом. Трахеостомия 1 был использован в качестве стандартной тэchnique вместо интубации из-за большей простоты выполнения этой техники и скромный мастерство требуется. Тем не менее, трахеостомия не способствует хронических или восстановления исследований хирургии; Таким образом, оно ограничено острых опытах. Трахеостомия также может быть смешанным переменной в исследовании, в котором воспаление или чувствительные физиологические рефлексы важны.

Наша лаборатория попробовали большинство из методов, описанных другими исследователями и нашли их недостаточными для целого ряда причин. Трахеостомия слишком травматично и индуцирует кровотечение и воспаление дыхательных путей. Гораздо более проблематичным в том, что она не может быть реально повторяется. Многие относительно неинвазивные методы, которые требуют скромный инвестиций в оборудование, не являются достаточно надежными. Другие методы требуют дорогого оборудования, которое трудно оправдать, не зная, если оборудование будет работать в конкретном приложении. Таким образом, мы стремились разработать нетравматического технику, которая не требуется не больше тHan скромные инвестиции в специализированном оборудовании, может быть достигнуто быстро и надежно, может быть повторен при хронических моделей, и может быть использован в большом количестве животных. Здесь мы сообщаем такую ​​технику.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка животных

  1. Получить мышей, возраст которых превышает 8 недель и более 20 г (мелкие мыши могут быть интубировали экспертом).
  2. Анестезия
    1. Введите мышей с 20 мг / кг, каждый, кетамина и ксилазина внутрибрюшинно в качестве наркоза. (Эта доза недостаточна, чтобы полностью обезболить мышь, но облегчает обеспечения безопасности при передаче, после интубации, к искусственной вентиляции легких.) Тем не менее, корректировка доз может потребоваться в соответствии с анестезиологической ответ в консультации с институциональной ветеринара.)
    2. Анестезии у мышей с 3,5% изофлуран / кислорода в индукции камеры для 90-120 сек.
    3. Тщательно соблюдать частоту дыхания. Следует замедлить постепенно не менее чем на 45 ударов в минуту.

2. Подготовка к интубации

  1. Отключив мышь от индукции камеры и загривок плотно.
  2. Используйте мягкими тонкий пинцет в Гентлы расширить язык изо рта.
  3. Поддерживать расширение языка, удерживая язык между двумя пальцами и применения нежный силу.
  4. Потяните мышь вверх на зеркалах в отоскопа с вертикальным движением.
  5. Посмотрите в окуляр на отоскопа а scruffing плотно и потяните мышь вверх нежно языка и за шкирку.
  6. Внимательно следите за голосовыми связками. Они должны быть хорошо видны в это время. Laryngis Aditus (структура отверстие гортани) следует искать относительно белого цвета. Там должно быть движение шнуров с каждым дыханием. Если кабели не движется или плохо визуализируется, повернуть животное слегка и осторожно гиперэкстензии шеи.
  7. С доминирующей рукой, удерживая 20 г, 1 в катетер с 1 см длины трубки ПЭ10, проходящей через кончике катетера, как карандаш и вставить его в сторону рефлектора. Трубка ПЭ служит стилет или Бужи.
  8. Направьте ПЭ10 TUBIнг (стилет) через голосовые связки и продвинуть катетер 20 G (эндотрахеальной трубки) в течение трубки PE до ступицы находится на уровне нижнего резца. Удалить этот стилет быстро.
  9. Аккуратно животное прочь зеркалах и проверить положение трубки, поместив животное на механической вентиляции легких при непрерывном 2% изофлуран для поддержания общей анестезии в течение всего эксперимента. Визуализация выдыхаемом воздухе (пузыри), проходящие через PEEP ловушку для подтверждения интубации. Хотя интубация пищевода может привести к несколько пузырьков, это не будет столь выраженным или как согласуется с интубации трахеи. Кроме того, наблюдается трассировку давление в дыхательных путях для отрицательных отклонений (рис. 1). Это подтверждает, правильное размещение трубки. Кроме того, место небольшое количество воды в IV труб и подключение его к ET трубки. Проверка движение и от мыши с дыханием 2. В случае пищевода интубации, рдав ления трассировка покажет значительно более высокие давления и никаких негативных отклонений. Хотя в конце выдоха СО2 было бы полезно, технически это было бы очень сложно, учитывая небольшие дыхательные объемы (~ 200 мкл) и оборудование, чтобы сделать это будет очень дорого. Простые методы, описанные в полной мере достаточно и гораздо дешевле. Если изофлуран анестезии не доступна, все процедуры могут быть проведены с использованием кетамина 80-120 мг / кг в сочетании с ксилазина 10-20 мг / кг в течение общей анестезии.

3. Альтернативная Техника: Прямая Ларингоскопия с техникой отоскопом будет использовано Легко для других целей, в основном для прямого закапывания исследовательских веществ в легкие.

  1. Анестезии у животных с только изофлураном для этой процедуры на уровне 3,5% для 90-120 сек в индукции камеры.
  2. Scruff животного плотно у основания черепа и расширить язык нежнос тонким пинцетом.
  3. Держа язык мягко потяните животное прямо на зеркалах (немодифицированные), пока животное не может быть подтянут дальше.
  4. Голосовые связки могут быть визуализированы чаще всего этим методом в одиночку, но повернуть животных и гипер-продлил шею, чтобы привести их в полный рост.
  5. Авансовые гель-загрузкой пипетки, содержащий instillate к голосовой щели и привить жидкость. Поскольку зеркало делает печать с глотки мышь будет аспирации любой остаточной жидкости, которая не проходит через шнуры. Это легко проверяется rhonchorous звучит мышь в настоящее время составляет при дыхании, пока жидкость полностью не распространяется в легких.
  6. Кроме того, подключать PE10 трубок в 0,5 мл шприц, содержащий 50 мкл жидкости с воздушным болюса за жидкости. Авансовые трубки PE тщательно через голосовые связки для 0,5 см и вытеснять содержимое в дыхательные пути медленно. Тем не менее, иногда травма нижних дыхательных путей происходит Uпеть эту технику без лучшего поставки образца.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Интубации с помощью данной методики является надежным и быстрым. Соответствующий размещение эндотрахеальной трубки наиболее легко проверить, наблюдая выдыхаемого газа пузырьков из затопленной выдоха контура вентилятора (как правило, в PEEP ловушку) и отрицательных отклонений на давление в дыхательных путях трассировки (рис. 1). Негативные отклонения по отслеживанию давление в дыхательных путях являются самыми надежными. Другие использовали движение небольшой капли жидкости в внутривенной трубки, подключенной к выдоха вентилятора контура 2. Хотя мы не использовали эту технику широко, она должна быть достаточно проверить расположение трубки. Опытный оператор может интубировать мышей с помощью этого метода около 90% времени при первом проходе. Для тех, которые терпят неудачу, трубка немедленно удалены, животное reinduced с изофлуран анестезии, а также размещение снова пытались. Если животное оставили соединен со схемой вентилятора в случае ESOфагеальный интубация, желудок постепенно вдувать генерации высоких давлений пик дыхательных путей, гипоксемии, и в конечном счете к смерти, если нет вмешательства. Если давление высокое пиковое дыхательных путей наблюдаются без негативных усилий вдоха, животное должно быть немедленно удалены из вентилятора и экстубировали. Однако удаление животное от вентилятора и удаления эндотрахеальной трубки легко изменить это. За последние 300 исследований на животных, требующих интубации опытный оператор интубацию 80% с первой попытки и более чем 95% по второй попытки. Все животные были интубированы третьей попытки опытных операторов. Время, необходимое для интубации мышей до 5 мин для наркоза, 90-120 сек индуцировать мышь изофлураном и 30 сек для выявления и фактически интубировать дыхательные пути. Мы обнаружили, что новые слушатели должны научиться визуализировать голосовые связки в первую очередь. Если они могут успешно продемонстрировать полное представление о голосовых связок десять раз, они готовы то начать обучение интубировать. После того, как слушатели успешно интубировали 10 раз, о чем свидетельствует отрицательных отклонений на давление в дыхательных путях трассировки в самостоятельным дыханием животного, они готовы выполнить исследования на экспериментальных животных. Тем не менее, обучающее видео значительно ускорит процесс обучения. Только неопытные операторы вызвать травму дыхательных путей с помощью этой техники и гибель животных может происходить в этой обстановке, обучения технике. Тем не менее, потеря животных с опытным оператором редко. Это наш опыт в более чем 1000 животных в течение последних 4 лет.

20 G катетер используется в качестве эндотрахеальной трубки у мышей, поскольку она делает герметичное уплотнение с дыхательных путей, тем самым позволяя точные данные о давлении в дыхательных путях, и это достаточный диаметр для мер сопротивление дыхательных путей. Тем не менее, с помощью трубки PE как стилет или Бужи позволяет 20 G легко и надежнее пройти через голосовые связки. 1 в(2,5 см) длина катетера позволяет трубка быть размещены со ступицей на нижних резцов для стабильности, но не вызывая травму нижних дыхательных путей или интубирование mainstem бронхи.

Мы используем эту технику, чтобы сделать измерения сопротивления дыхательных путей, выполнить кривые доза-реакция метахолина (рис. 2), и измерить давление-объем отношения в легких (рис. 3). Для всех этих измерений животные должны быть полностью парализована, чтобы получить годные к употреблению, точные данные. Для этой цели мы использовали панкурония бромид как недорогой, недеполяризующих расслабленному в nonrecovery экспериментов. Однако, панкурония больше не доступны и не могут быть использованы на животных, которые собираются восстановить из-за его длительным периодом полураспада. Таким образом, мы перешли на векуроний (30 мин) или рокуронием для паралича из-за их коротким периодом полувыведения, обеспечивая возможность повторных измерений с течением времени. Другие исследователи использовалисукцинилхолин как деполяризующего расслабленному, но его период полураспада был слишком коротким для большинства наших экспериментах. Также сукцинилхолин может вызвать высвобождение гистамина 3 и, следовательно, было бы потенциальные вмешивающиеся переменной.

Мы также использовали прямой метод Ларингоскопия широко на поставку исследуемых веществ в легкие, основанной на технике первоначально сообщалось в крыс Hastings 4. Большинство исследований использовали носовой инстилляцию на поставку исследуемых веществ к нижних дыхательных путей, потому что мыши являются облигатными носовые дыхательные упражнения и заложенность закапывания легко. Тем не менее, мы нашли метод носа закапывания ненадежными для количественного доставки. При использовании методики прямой ларингоскопии мы обнаружили, что количественный доставка является более надежным и распределение в легких более равномерным. Наша главная использование прямого метода закапывания в том, чтобы доставить антиген к I нижних дыхательных путейNA модель аллергического воспаления (рис. 4) и гиперчувствительность дыхательных путей (рис. 2). Мы также доставлены другие испытуемые вещества, такие как цитокины и лекарственных средств с помощью этого метода.

Рисунок 1
Трассировка давления Рисунок 1. Дыхательных. Синяя линия отражает давление в дыхательных путях и красная линия отражает дыхательный объем трассировки в мыши сразу после интубации. Негативные (сверху вниз) отклонения кривой давления (черные стрелки) указывают на поколение отрицательного внутригрудного давления у мышей (C57BL / 6, 24 г) по спонтанной дыхательного усилия и указывает правильное размещение эндотрахеальной трубки. Нажмите здесь, чтобы V МЭН большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Сопротивление дыхательных путей и кривые доза-ответ метахолина. Мыши (C57BL / 6) интубацию по этой методике могут претерпевать меры сопротивление дыхательных путей и бронхиальной реактивности с помощью удвоение дозы метахолина доставляется через ультразвуковой распылитель. В этом представительном Например, элемент управления животное имеет минимальный ответ на метахолин до 25 мг / мл и овальбуминовой иммунизированы и инфицированы мышь демонстрирует гиперчувствительность к метахолина. Эти измерения производятся с мышами интубированных с 20 G катетера и неотличимы от тех, что сделаны в tracheostomized мыши.

/ Files/ftp_upload/50269/50269fig3highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/50269/50269fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Давление-объем кривая. Это представитель кривая давления объем в 20 г мыши, которая была интубированных с 20 G внутривенный катетер, парализована с панкурония, и искусственной вентиляции легких. Это показывает, что катетер не течет до 30 см H 2 O давления и, следовательно, может быть использован, чтобы сделать точные измерения давления громкости отношения в мыши.

Рисунок 4
Рисунок 4. Овальбумин модель аллергического воспаления. Это представитель гематоксилином и эозином окрашенные секцию мыши легких, который был иммунизированных и зараженных овальбумином. Он демонстрирует обобщенный эффект закапывания ovalbuмин вводят с использованием прямой ларингоскопии (увеличение 4X).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом докладе мы опишем простой, надежный способ, чтобы интубировать мышей, что является нетравматическое и могут быть использованы повторно в том же животного. Эта техника может быть достигнуто с простой лаборатории или медицинского оборудования, которые можно приобрести за скромную сумму. Методика прямой ларингоскопии, первоначально сообщает Гастингс и его коллеги 4, также могут быть использованы для различных целей, но в основном точно поставить тест-веществ в нижних дыхательных путей. Мы нашли эту технику, превосходящую те сообщили другими исследователями на сегодняшний день из-за своей простоты, скорости, простоты, надежности, низкий расход, и потенциал для повторных измерений.

Методы интубировать мышей не новы. Одно из самых ранних отчетов, используется просвечивание трахеи с последующим пероральным интубации с 24 G катетера 5. Однако это исследование и другие 6,7 не дает достаточной информации для репликации ТИКhnique в нашей лаборатории. Недавно другие исследователи использовали эту технику просвечивание с большим успехом 8,9. Первое подробное исследование Браун и его коллеги сообщили об исследовании, в котором мышей, подвешенный на 45 ° щита, имел их трахеи transilluminated и их трахеи интубированную устно с PE90 трубки под прямой визуализации с использованием изготовленный клинка ларингоскопа 10. Этот метод доказал трудно повторить и, следовательно, не были использованы широко. Дополнительные отчеты описывают использование жестких оптических прицелов или волоконной для повышения надежности методов. Vergari и коллеги 11,12 использовал жесткую артроскоп 1,7 мм с внешним диаметром в визуализировать голосовые связки, а затем помещается направляющий провод через голосовую щель. Авторы сообщают 100% успех с этой техникой, что они выступали специализированную и дорогостоящего оборудования. Стоимость этого хирургического оборудования кажется непомерно высокой для широкого использования в мышей. Дополнительные методы были разработаны с использованием операционного микроскопа и 2f направляющую проволоку 13. Этот метод похож на наш, но требует использования операционного микроскопа, и, таким образом мы выступаем за использование отоскоп, который значительно дешевле.

Fiberoptic методы интубации также сообщалось помощью относительно недорогого батарейках волоконно-оптический источник 14. Мы попытались использовать эту волоконно-оптический метод, но нашли свет менее полезно, потому что нет соответствующих волоконно-оптический канал визуализации. Макдональд и его коллеги использовали более мощный источник света галогенной лампы и сообщили об успешном небольшой выборке. Они смогли неоднократно измерить сопротивление дыхательных путей 15 также. Повторные измерения сопротивления дыхательных путей в различные моменты времени сообщалось другими 16. Zhao и др.. Использован метод ретроградного путем прокалывания трахею и подачи направляющей проволоки через Hypо-и ротоглотки 17. Совсем недавно Singer и др.. Провели селективное интубации левого mainstem бронхов у мышей с использованием операционного микроскопа и рентгеноскопии для документирования местоположение катетера 18. Затем они использовали этот метод, чтобы привить тестовые вещества избирательно в легкие. Однако, это снова не будет метод, который может быть использован без существенных затрат и высокой технической подготовки. Кроме того, рентгеноскопия бы также добавить радиационную опасность в исследовании.

Таким образом, прямая ларингоскопия мышей с использованием педиатрической отоскоп является ценным методом для интубации, повторил интубация и доставка исследуемое вещество без интубации. Мы находим этот метод превосходит трахеостомии и сообщалось ранее методы неинвазивного выполнения эндотрахеальной интубации у мышей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Заслуги Грант из Департамента по делам ветеранов и T32-HL098062 грант от NHLBI из Национальных Институтов Здоровья поддержала эту работу. Мы хотим благодарят за консультацией Рэндольф H. Hasting, MD, Ph.D. и советы и поддержку ветеринарной медицинской части В.А. Сан-Диего системы здравоохранения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operating Otoscope Head Welch Allyn 21700 $188.98
Otoscope Handle Welch Allyn 71000 $112.20
Reuseable Speculum Welch Allyn 22002 $3.98
Fine Forceps Miltex 18-779 $107.18
Small clamp stand to hold otoscope
Isoflurane Vaporizer (multiple circuit with vacuum waste gas handling) Summit Medical $3,000
Flexivent (Animal Ventilator) SCIREQ $35,000
Intravenous catheter (20 G, 1 in) BD 381233 $9.62
Polyethylene tubing (PE10) (0.011 in I.D., 0.024 in O.D.) 100 ft Intramedic, Clay-Adams 427401 $115.70
Ketamine 100 mg/ml (10 ml bottle) Butler 23061 $10.00
Xylazine (100 ml bottle) Vedco 24105 $20.00
Isoflurane (250 ml bottle) $15.00
Vecuronium bromide 10 mg/10 ml Pfizer NDC 0069-0094-01 $15.00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 8277-8281 (1991).
  2. Watanabe, A., Hashimoto, Y., Ochiai, E., Sato, A., Kamei, K. A simple method for confirming correct endotracheal intubation in mice. Lab. Anim. 43, 399-401 (2009).
  3. Orebaugh, S. L. Succinylcholine: adverse effects and alternatives in emergency medicine. Am. J. Emerg. Med. 17, 715-721 (1999).
  4. Hastings, R. H., Summers-Torres, D. Direct Laryngoscopy in Mice. Contemp. Lab. Anim. Sci. 38, 33-35 (1999).
  5. Berul, C. I., Aronovitz, M. J., Wang, P. J., Mendelsohn, M. E. In vivo cardiac electrophysiology studies in the mouse. Circulation. 94, 2641-2648 (1996).
  6. Ewart, S. L., Gavett, S. H., Margolick, J., Wills-Karp, M. Cyclosporin A attenuates genetic airway hyperresponsiveness in mice but not through inhibition of CD4+ or CD8+ T cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 627-634 (1996).
  7. Ewart, S. L., Mitzner, W., DiSilvestre, D. A., Meyers, D. A., Levitt, R. C. Airway hyperresponsiveness to acetylcholine: segregation analysis and evidence for linkage to murine chromosome 6. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 487-495 (1996).
  8. Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Lab. 41, 128-135 (2007).
  9. Boll, H., et al. High-speed single-breath-hold micro-computed tomography of thoracic and abdominal structures in mice using a simplified method for intubation. J. Comput. Assist. Tomogr. 34, 783-790 (2010).
  10. Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
  11. Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G. Video-assisted orotracheal intubation in mice. Lab. Anim. 37, 204-206 (2003).
  12. Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 8, 103-106 (2004).
  13. Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Lab. Anim. 42, 222-230 (2008).
  14. Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Cont. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 52-55 (2005).
  15. MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J. Appl. Physiol. 106, 984-987 (2009).
  16. De Vleeschauwer, S. pI., et al. Repeated invasive lung function measurements in intubated mice: an approach for longitudinal lung research. Lab. Anim. 45, 81-89 (2011).
  17. Zhao, X., et al. A technique for retrograde intubation in mice. Lab. Anim. 35, 39-42 (2006).
  18. Singer, T., et al. Left-sided mouse intubation: description and evaluation. Exp. Lung Res. 36, 25-30 (2010).

Tags

Медицина выпуск 86 легких физиология интубация трахеи ларингоскопия сопротивление дыхательных путей техника интубации
Интубации трахеи у мышей<em&gt; Через</em&gt; Прямая Ларингоскопия Использование Otoscope
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomas, J. L., Dumouchel, J., Li,… More

Thomas, J. L., Dumouchel, J., Li, J., Magat, J., Balitzer, D., Bigby, T. D. Endotracheal Intubation in Mice via Direct Laryngoscopy Using an Otoscope. J. Vis. Exp. (86), e50269, doi:10.3791/50269 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter