Summary
私たちは、2.0ミリメートルの鏡と耳鏡を使用して直接喉頭鏡検査を介したマウスでは、気管内挿管のための、シンプルな信頼性が高く、比較的安価な方法を開発した。この技術は、非外傷性であり、慢性の実験において反復測定のために使用することができる。私たちは、優れた気管切開または以前に非外科的手法を報告したために見つける。
Abstract
マウスは、野生型およびトランスジェニックの両方が、現在、生物医学研究において主要な哺乳類のモデルである。挿管や人工呼吸は深い麻酔や肺機能の測定値の下に手術を必要とする全体の動物実験のために必要である。気管切開は、機械的な換気を可能にするために、これらのマウスでは気道に挿管するための標準となっている。経口気管内挿管が原因かなりの技術的な難しさや専門性の高い高価な装置の必要性が報告されているが、正常に多くの研究で使用されていなかった。ここでは、2.0ミリメートルの鏡を装備オトスコープを使用し、気管内チューブなどの20のG静脈内カテーテルを使用する直接喉頭鏡検査の手法を報告する。私たちは、挿管し、マウスでは肺機能の正確な評価を行うために広くかつ確実に、この技術を使用している。この技術は、経験豊富な手の中に本質的に動物の損失で、安全であることが証明された。さらに、この手法慢性モデルにおけるマウスの反復研究のために使用することができる。
Introduction
実験用マウスは、生物学と病理生物学の主要な哺乳類のモデルとして、事実上すべての種に取って代わっています。実験用マウスは、明確かつ広範囲にヒト疾患のモデルとして価値があることが示されている最小の哺乳類の種であり、人間の生物学と疾患の我々の理解の進歩に非常に貴重であることが判明した。短い妊娠期間と実質的により低いコストは、生物医学研究では一般的なツールとして、ヌルおよびトランスジェニックマウスの開発および研究を可能にした。しかし、平均的な実験用マウス（20〜25 g）を大きさが、結果として、一部の研究者は、より大きな哺乳動物種を研究、生理学的または外科的に基づく研究で彼らの研究を制限しています。これらの研究ではマウスを使用する障害は、深い麻酔下で生理学的測定または広範囲の外科的処置を可能に挿管法で遭遇する困難さである。気管切開1は 、標準的なTEとして用いられてきたこのため、技術と必要な控えめなスキルを実行するのが非常に容易するのではなく、挿管のchnique。しかし、気管切開は、慢性または回復手術の研究を助長されていません。従って、それは、急性実験に制限される。気管切開は、炎症や機密生理的反射神経が重要である、研究の交絡変数を指定できます。
当研究室では、他の研究者によって記載されている技術のほとんどを試してみましたが、さまざまな理由で、それらが不十分発見した。気管切開も外傷性であり、出血や気道の炎症を誘発する。ずっとより問題は、それが都合良く繰り返すことができないことである。設備の適度な投資を必要とする多くの比較的非侵襲的な技術が十分に信頼できるものではない。他の技術は、機器が特定のアプリケーションで動作するかどうかを知らなくても、正当化することは困難で高価な装置を必要とする。従って、我々はもはやtは不要非外傷技術の開発が求められてハン特殊な装置の適度な投資は、迅速かつ確実に達成することができる、慢性モデルで繰り返すことができ、多数の動物で使用することができる。ここでは、このような技術を報告する。
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Protocol
1。動物の準備
- （小さいマウスが専門家によって挿管することができます）8週間以上経過しており、以上の20グラムのマウスを入手します。
- 麻酔
- 腹腔内麻酔前のようにケタミンおよびキシラジンの20 mg / kgを、それぞれ、をマウスに注射する。 （この用量は完全にマウスを麻酔するには不十分であるが、人工呼吸器に、挿管した後、安全な転送を容易にする。）が、投与量の調整は、制度的に獣医師に相談して麻酔応答に応じて必要な場合があります。）
- 90〜120秒の誘導チャンバ内の3.5％イソフルラン/酸素を用いたマウスに麻酔を誘導する。
- 慎重に呼吸数を観察します。それは、以下45以上BPMに徐々に遅くする必要があります。
2。挿管の準備
- 誘導室からマウスを取り外し、しっかりと首筋。
- GENTするクッション細かい鉗子を使用してくださいLY口から舌を伸ばす。
- 2本の指の間に舌を保持し、穏やかな力を加えることにより、舌の拡張を維持する。
- 上下動と耳鏡の鏡の上でマウスを上に引き上げます。
- しっかりscruffingながらオトスコープの接眼レンズをのぞきながら舌と首筋により穏やかにマウスを引き上げます。
- 声帯を十分に確認してください。彼らは、この時点で簡単に表示されるはずです。喉頭のaditus（喉頭開口部の構造）は、比較的白になります。呼吸のたびにコードの動きがあるはずです。コードが動いていないか、不十分で可視化されている場合は、わずかに動物を回転させ、ゆっくりと首を過伸展。
- 利き手で、鉛筆のように、カテーテルの先端を通って延びるPE10チューブの長さ1cmで、カテーテル内に20のG、1を保持し、鏡の横に挿入します。 PEチューブはスタイやブジーとして機能します。
- PE10 tubiに指示NG（スタイレット）声帯を通って、ハブが下顎切歯のレベルになるまでのPEチューブを介して20gのカテーテル（気管内チューブ）を進める。すぐにこのスタイレットを取り外します。
- そっと鏡の外動物を取り、実験を通して全身麻酔を維持するために継続的な2％のイソフルランで人工呼吸器に動物を配置することにより、チューブの位置を確認します。挿管を確認するため、PEEPトラップを通過する呼気（気泡）可視化する。食道挿管が数泡になるかもしれないが、それは同様に顕著または気管内挿管と同様に一貫性がありません。また、負のたわみ（ 図1）のトレース気道内圧を観察します。これらは、チューブの適切な配置を確認する。あるいは、IVチューブに少量の水を置き、ETチューブに接続します。呼吸2とマウスとの間での動きの確認。食道挿管、Pの場合案内圧力スイッチのトレースが有意に高い圧力と負の偏向を明らかにします。呼気終末CO 2が参考になるが、技術的にはこれは、小さな換気量（〜200μL）指定された非常に困難であろうし、これを行うための機器は非常に高価である。説明した単純な技術は完全に十分であり、はるかに安価である。イソフルラン麻酔が使用できない場合、すべての手順は、全身麻酔のためのキシラジン10-20 mg / kgのケタミンと併用して80〜120 mg / kgのを用いて行うことができる。
3。代替技術：直接喉頭鏡検査オトスコープの技術では、主に肺に研究物質の直接点眼用に、他の目的のために容易に使用されている。
- 誘導チャンバ内で90〜120秒間、3.5％で、この手順のためだけではイソフルランで動物に麻酔を誘導する。
- 動物首筋しっかりと頭蓋底と優しく舌を伸ばす細かいピンセットで。
- 優しく舌を保持し、動物がさらにプルアップすることができなくなるまで鏡（未変更）にまっすぐな動物を引っ張る。
- 声帯だけでは、この技術によって、ほとんどの場合、可視化されますが、動物およびHyper-拡張完全なビューにそれらをもたらすために、首を回転させることができます。
- 声門への点滴を含むゲルローディングピペットを進め、流体を植え付ける。鏡を下咽頭とシールを行っているため、マウスはコードを経由しない任意の残液を吸引します。これは簡単にrhonchorousによって検証された流体が肺の中に完全に分散するまで、呼吸時にマウスが、今になり鳴ります。
- あるいは、液体の後ろの空気塊と流体の50μLを含む0.5ミリリットル注射器にPE10チューブを接続します。 0.5センチメートルのため声帯を注意深くPEチューブを前進させ、徐々に気道内に内容を放電してください。しかし、下気道への時折のトラウマは、Uを発生するサンプルのより良い配達せずに、このテクニックを歌う。
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Representative Results
上記の技術を持つ挿管は、信頼性と高速です。気管内チューブの適切な配置は、最も容易にします（ 図1）をトレースする気道内圧に（通常は、PEEPトラップ）で人工呼吸器回路の、負のたわみの水没呼気リムから期限切れのガスバブリングを観察することによって検証される。気道内圧のトレースにマイナスの偏向は最も信頼性が高い。他の呼気人工呼吸器回路2に接続静脈チューブに小液滴の移動を使用している。我々は広範囲にこの技術を使用していないが、それは、チューブの位置を確認するのに十分であるべきである。経験豊富なオペレーターは最初のパスで、この方法の時間の約90％を使用して、マウスを挿管することができます。チューブがすぐに削除され、失敗しているもののために、動物をイソフルラン麻酔で再誘導し、配置が再試行されます。動物は、ESOの場合は人工呼吸器回路に接続のままにした場合介入がない場合はphageal挿管、胃が徐々に吹き込む高いピーク気道内圧、低酸素血症、そして最終的に死を生成します。高いピーク気道内圧が負の吸気努力なしで認められた場合には、動物は、速やかに人工呼吸器から取り出して、抜管されなければならない。しかし、人工呼吸器から動物を削除し、気管内チューブを削除すると、これを簡単に逆転。挿管を必要とする最後の300の動物実験の間に経験のオペレータは、第二の試行による最初の試みと95％以上で80％挿管。すべての動物を経験した事業者の第三の試みで挿管された。マウスを挿管するのにかかる時間は、イソフルランでマウスを誘導する麻酔前、90〜120秒、5分、30秒特定し、実際に気道を挿管する次第です。我々は新しい研修生が最初に声帯を視覚化するために学ばなければならないことを発見した。彼らは成功し、声帯10回の完全なビューを示すことができる場合は、準備がトンですO挿管するためのトレーニングを始める。研修生が正常に10回挿管した後、自発呼吸動物でトレース気道内圧にマイナスのたわみによって示されるように、彼らは、実験動物での試験を実行する準備ができました。しかし、トレーニングビデオが大幅に学習曲線を加速します。唯一の経験の浅いオペレータは、この技術によって気道外傷を誘導し、技術を学びながら、動物の死は、この設定で発生する可能性があります。しかし、経験豊富なオペレーターでの動物の損失は稀である。これは最後の4年間で1,000人以上の動物での経験です。
それは、気道と密封を行うこうして気道圧力の正確な尺度を可能にし、気道抵抗の測定値のための十分な直径のものであるため、20 Gカテーテルはマウスにおける気管内チューブとして使用される。しかし、スタイレットまたはブジーとして、PEチューブを使用すると、20 Gが声帯を通って容易に、かつより確実に渡すことができます。中1カテーテルの（2.5cm）の長さは、チューブが安定性のためのより低い門歯でハブに配置することができますが、下気道に外傷を引き起こすかmainstem気管支挿管せず。
我々は、（ 図2）メタコリン用量応答曲線を実行し、気道抵抗の測定を行うためにこの技術を使用して、肺（ 図3）内の圧力-体積の関係を測定した。これらの測定のすべてのための動物が十分に利用でき、正確なデータを得るために、麻痺している必要があります。この目的のために我々はnonrecovery実験で安価な、非脱分極性麻痺などの臭化パンクロニウムを使用している。しかし、パンクロニウムは使用できなくなりましたと、その長い半減期を回復しようとしている動物では使用できません。したがって、我々は時間をかけて繰り返し測定するオプションを提供する、ため、その短い半減期のベクロニウム（30分）または麻痺のためロクロニウムに切り替えている。他の研究者が使用している脱分極麻痺などのサクシニルコリンが、その半減期は実験の大半は短すぎるとなっている。また、サクシニルコリンヒスタミン遊離3を引き起こす可能性がありますので、潜在的な交絡変数になります。
また、もともとスティング4匹のラットで報告された技術に基づいて肺への試験物質の送達のために広範に直接喉頭鏡検査技術を使用している。マウスは絶対鼻ブリーザーであり、鼻点滴が容易であるため、ほとんどの調査は、下気道への試験物質の送達のための鼻の点滴を使用している。しかし、我々は、鼻点滴法は定量的送達のために信頼できないことを見出した。直接喉頭鏡検査技術を用いて、我々は、定量的送達は、より信頼性があり、肺における分布がより均一であることを見出した。直接点滴技術の我々の主な用途は、下気道Iに抗原を提供することであったアレルギー性炎症のないnaモデル（ 図4）および気道過敏性（ 図2）。また、このメソッドを使って、サイトカインや薬剤などの他の試験物質を提供してきました。
図1。気道内圧のトレース。青い線が気道内圧を反映し、赤線はすぐに挿管した後、マウスでトレース回換気量を反映している。圧力曲線（黒矢印）の負（下向き）たわみが自発呼吸努力によるマウスの負胸腔内圧（C57BL / 6、24グラム）の生成を示し、気管内チューブの適切な配置を示しています。 Vのときはここをご覧ください。この図の拡大バージョンをIEW。
図2気道抵抗およびメタコリン用量応答曲線。この技術によって、挿管マウス（C57BL / 6）は、超音波ネブライザーを介して送達メタコリンの倍加用量を使用して、気道抵抗および気管支反応性の措置を受けることができる。この代表的な例では、コントロール動物は、25 mg / mlのとオボアルブミン免疫し曝露マウスまでメタコリンに対する最小限の応答は、メタコリンに過敏性を実証しました。これらの測定は、20gのカテーテルを挿管したマウスで作られ気管切開マウスで行われたものと区別がつかないしている。
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図3。圧力-体積曲線。これは、20 G、静脈内カテーテルを挿管パンクロニウムで麻痺させ、かつ機械的に換気されています20グラムのマウスの代表圧力-体積曲線である。これは、カテーテルが30cmのH 2 Oの圧力まで漏洩しないので、マウスにおける正確な測定圧-容積の関係を作るために使用され得ることを実証する。
図4。アレルギー性炎症のオボアルブミンモデル。これはオボアルブミンで免疫し曝露されたマウスの肺の代表ヘマトキシリンおよびエオシン染色切片である。それはovalbuの点滴の一般化効果を実証分は、直接喉頭鏡検査法（倍率4倍）を介して投与。
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Discussion
本報告書では、非外傷性であり、同じ動物で繰り返し使用することができ、マウスを挿管するための簡単で信頼性の高い技術が記載されている。この技術は、適度の和を購入することができ、簡単な実験室又は医療機器を用いて達成することができる。もともとヘイスティングス4らによって報告された直接喉頭鏡検査技術もまた、様々な目的のために使用することができるが、主に、正確に下気道に試験物質を送達する。我々は、その使いやすさ、スピード、シンプルさ、信頼性、低費用、および反復測定のための潜在的な日までの他の研究者によって報告されたものと、この技術は、優れた発見した。
マウスを挿管するための技術は新しいものではありません。最も初期の報告の一つは、気管の使用透視24のGカテーテル5の経口挿管した。しかしながら、この研究など6,7は、TECを複製するのに十分な情報を提供しなかった私たちの研究室でhnique。最近の他の研究者らは、大きな成功8,9と、この透視技術を使用している。ブラウンらによる最初の詳細な研究は、マウスは、45°のバックボードに吊り下げ、その気管が透照持っていたし、その気管を作製喉頭鏡ブレード10を使用して直接可視化の下PE90チューブで経口挿管した研究を報告した。この技術は、複製することが困難であり、したがって、広く利用されていないことが証明されている。追加のレポートは、技術の信頼性を高めるために剛性の光学スコープまたは光ファイバーの使用を記載している。 Vergariや同僚11,12は声帯を視覚化するために、外径で剛性の関節鏡1.7ミリメートルを使用して、声門を介してガイドワイヤーを置いた。著者らは、専門的で高価な装置を用いて行わこの手法で100％の成功を報告する。この手術用機器のコストは、マウスで広く使用するために法外なようだ。さらなる技術は、手術用顕微鏡と2fのガイドワイヤ13を用いて開発されている。この技術は、我々のものと同様であるが、手術用顕微鏡の使用を必要とし、従って、我々は実質的に安価でオトスコープを使用することを好む。
光ファイバー挿管技法はまた、比較的安価な電池駆動の光ファイバー光源14を使用して報告されている。我々は、この光ファイバ技術を使用しようとしましたが、該当する光ファイバ可視化チャネルがないので便利よりも光が少なく発見した。マクドナルドらは、より強力なハロゲン光源を使用し、少量のサンプルでの成功を報告した。彼らは何度も気道抵抗15を測定することができました。異なる時点での気道抵抗の反復測定は、他の16で報告されている。チャオらは 、気管を穿刺し、HYPを介してガイドワイヤーを供給することにより逆行技術を使用しo-および中咽頭17。さらに最近ではシンガーらは、カテーテル18の位置を記録するために手術用顕微鏡とX線透視を用いてマウスで左主気管支の選択的挿管を行った。そして、彼らは肺に選択的に被験物質を植え付けるために、このメソッドを使用していました。しかし、これもまた重要な費用と高度な技術訓練なしに使用することができる方法ではないでしょう。また、X線透視にも研究に放射線障害を追加します。
要約すると、小児用オトスコープを用いて、マウスの直接喉頭鏡検査は、挿管のための貴重な技術である、挿管せずに挿管し、被験物質の配信を繰り返した。私たちは、気管切開にするには、この技術は、優れた検索して、以前に非侵襲的にマウスでは、気管内挿管を行う方法を報告した。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
ベテラン総務省からメリットグラントと国立衛生研究所のNHLBIからT32-HL098062の助成金は、この作品を支持した。我々は感謝ランドルフH·ヘイスティング、医学博士の助言を認めるしたいおよびVAサンディエゴのヘルスケア·システムの獣医療部隊のアドバイスとサポート。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating Otoscope Head | Welch Allyn | 21700 | $188.98 |
| Otoscope Handle | Welch Allyn | 71000 | $112.20 |
| Reuseable Speculum | Welch Allyn | 22002 | $3.98 |
| Fine Forceps | Miltex | 18-779 | $107.18 |
| Small clamp stand to hold otoscope | |||
| Isoflurane Vaporizer (multiple circuit with vacuum waste gas handling) | Summit Medical | $3,000 | |
| Flexivent (Animal Ventilator) | SCIREQ | $35,000 | |
| Intravenous catheter (20 G, 1 in) | BD | 381233 | $9.62 |
| Polyethylene tubing (PE10) (0.011 in I.D., 0.024 in O.D.) 100 ft | Intramedic, Clay-Adams | 427401 | $115.70 |
| Ketamine 100 mg/ml (10 ml bottle) | Butler | 23061 | $10.00 |
| Xylazine (100 ml bottle) | Vedco | 24105 | $20.00 |
| Isoflurane (250 ml bottle) | $15.00 | ||
| Vecuronium bromide 10 mg/10 ml | Pfizer | NDC 0069-0094-01 | $15.00 |
References
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