Endotracheal i mus Published: April 5, 2014 doi: 10.3791/50269

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Joanna L. Thomas^1,2, Justin Dumouchel², Jinghong Li², Jenna Magat², Dana Balitzer³, Timothy D. Bigby^1,2

¹Medical and Research Services, VA San Diego Healthcare System, ²Department of Medicine, University of California, San Diego, ³School of Medicine, University of California, San Diego

Summary

Vi har udviklet en enkel, pålidelig og relativt billig fremgangsmåde til endotracheal i mus via direkte laryngoskopi hjælp af en otoskop med en 2,0 mm speculum. Denne teknik er atraumatisk og kan anvendes til gentagne målinger i kroniske forsøg. Vi finder det bedre at trakeostomi eller tidligere rapporterede ikke-kirurgiske teknikker.

Abstract

Mus, både vildtype og transgene, er den primære pattedyr model i biomedicinsk forskning i øjeblikket. Intubation og mekanisk ventilation er nødvendig for hele dyreforsøg, der kræver operation under dybe anæstesi eller målinger af lungefunktionen. Trakeostomi har været standard for intubating luftvejene i disse mus til at tillade mekanisk ventilation. Orotracheal intubation er rapporteret, men er ikke blevet brugt med succes i mange undersøgelser på grund af den betydelige tekniske vanskeligheder eller et krav om højt specialiseret og dyrt udstyr. Her rapporterer vi en teknik til direkte laryngoskopi hjælp af en otoskop udstyret med en 2,0 mm speculum og anvendelse af en 20 G intravenøst ​​kateter som et endotrachealt rør. Vi har brugt denne teknik i vid udstrækning og pålideligt at intubere og gennemføre præcise vurderinger af lungefunktionen hos mus. Denne teknik har vist sig sikker, med væsentlige ingen dyr tab i erfarne hænder. Desuden er denne teknikkan anvendes til gentagne undersøgelser af mus i kroniske modeller.

Introduction

Laboratoriet mus har fortrængt stort set alle arter som den vigtigste pattedyr model af biologi og Patobiologi. Laboratoriet mus er den mindste pattedyrarter, der er blevet klart og tydeligt bevist at være af værdi som en model for sygdomme hos mennesker og har vist sig uvurderlig i fremskridt i vor forståelse af den menneskelige biologi og sygdom. Den korte drægtighedsperiode og væsentligt lavere omkostninger har betydet og undersøgelse af null og transgene mus som en banal redskab i biomedicinsk forskning. Imidlertid er størrelsen af ​​den gennemsnitlige laboratorium mus (20-25 g) begrænset deres undersøgelse fysiologisk eller kirurgisk baserede undersøgelser, og følgelig nogle forskere studerer større pattedyrarter. En hindring for at bruge mus i disse studier er vanskelighed med intubation teknikker, der ville tillade fysiologiske målinger eller omfattende kirurgiske procedurer under dyb anæstesi. Trakeostomi ¹ er blevet anvendt som en standard technique stedet intubation på grund af den større lethed at udføre denne teknik og beskedne færdigheder, der kræves. Men trakeostomi er ikke befordrende for kroniske eller nyttiggørelse kirurgiske undersøgelser; det er således begrænset til akutte forsøg. Trakeostomi kan også være en forstyrrende variabel i forskning, hvor inflammation eller følsomme fysiologiske reflekser er vigtige.

Vores laboratorium har forsøgt de fleste af teknikkerne beskrevet af andre forskere og fundet dem utilstrækkelige til en række forskellige årsager. Tracheostomi er for traumatisk og inducerer blødning og luftvejsinflammation. Meget mere problematisk er, at det ikke kan indpasses gentages. Mange relativt noninvasive teknikker, der kræver en beskeden investering i udstyr ikke er tilstrækkeligt pålidelige. Andre teknikker kræver dyrt udstyr, der er vanskelig at retfærdiggøre uden at vide, om udstyret vil arbejde i et specifikt program. Således har vi søgt at udvikle en nontraumatic teknik, der kræves mere tHan en beskeden investering i specialiseret udstyr, kunne gennemføres hurtigt og pålideligt, kan gentages i kroniske modeller, og kan anvendes i stort antal dyr. Her rapporterer vi en sådan teknik.

Protocol

1.. Animal Forberedelse

1. Opnå mus, der er ældre end 8 uger, og mere end 20 g (mindre mus kan intuberet af en ekspert).
2. Anæstesi
   1. Injicere mus med 20 mg / kg, hver af ketamin og xylazin intraperitonealt som en preanesthetic. (Denne dosis er utilstrækkelig til fuldt ud bedøver musen, men letter sikker overførsel, efter intubation, til mekanisk ventilation.) Kan dog være nødvendig tilpasning af de doser i henhold til den bedøvende respons i samråd med den institutionelle dyrlæge.)
   2. Narkosen hos mus med 3,5% isofluran / ilt i en induktion kammer for 90-120 sek.
   3. Overhold respirationsfrekvens omhyggeligt. Det skal bremse gradvist til mindst 45 bpm.

2. Forberedelse til Intubation

1. Fjern musen fra induktion kammeret og harmoniske stramt.
2. Brug polstrede fin pincet til Gently strækker tungen fra munden.
3. Bevar udvidelse af tungen ved at holde tungen mellem to fingre og anvende blide kraft.
4. Træk musen op på speculum af otoskop med en lodret bevægelse.
5. Kig gennem okular af otoskop mens scruffing stramt og træk musen op forsigtigt ved tungen og harmoniske.
6. Kig nøje for stemmebåndene. De skal være let synlige på dette tidspunkt. Den laryngis aditus (strukturen i åbningen til larynx) bør se relativt hvid. Der bør være bevægelse af snore med hvert åndedrag. Hvis ledningerne ikke bevæger eller er dårligt visualiseres, rotere dyret lidt og forsigtigt hyperextend halsen.
7. Med den dominerende hånd, hold 20 G, 1 i kateter med en længde af PE10 rør strækker sig gennem spidsen af ​​kateteret, som en blyant 1 cm og sæt det ind i siden af ​​spekulum. PE rør tjener som en stilet eller bougie.
8. Ret PE10 tubing (stilet) gennem stemmebåndene og fremme 20 G kateter (endotrachealt rør) i PE rør, indtil navet er i plan af den nedre fortand. Fjern denne stilet hurtigt.
9. Forsigtigt tage dyret ud af spekulum og kontrollere røret placering ved at placere dyret på en mekanisk ventilator med kontinuert 2% isofluran til at opretholde generel anæstesi under hele forsøget. Visualiser udåndingsluft (bobler) går gennem et PEEP fælde at bekræfte intubation. Selv esophageal intubation kan resultere i et par bobler, vil det ikke være så udtalt eller som i overensstemmelse med endotracheal. Også observere en luftvejstrykket sporing for negative omlægninger (figur 1). Disse bekræfter korrekt placering af røret. Alternativt, placere en lille mængde vand i IV slanger og tilslutte den til ET røret. Kontrol bevægelse til og fra mus med åndedræt ^2. I tilfælde af esophageal intubation pUdsugning opsporing vil afsløre væsentligt højere tryk og ingen negative udbøjninger. Selvom ende-tidal CO ₂ ville være nyttigt, teknisk set ville det være meget vanskeligt på grund af de små tidalvolumener (~ 200 ul) og udstyr til at gøre dette ville være meget dyrt. De enkle beskrevne teknikker er fuldt tilstrækkelige og meget billigere. Hvis isofluran anæstesi ikke er tilgængelig, kan gennemføres alle procedurer ved hjælp af ketamin 80-120 mg / kg i forbindelse med xylazin 10-20 mg / kg for generel anæstesi.

3. Alternativ Teknik: Direkte laryngoskopi med Otoskop teknik anvendes let til andre formål, især til direkte instillation af Study stoffer i Lung.

1. Narkosen hos dyrene med isofluran alene til denne procedure på 3,5% for 90-120 sek i den induktion kammer.
2. Scruff dyret stramt ved kraniets og udvide tungen forsigtigtmed fine tænger.
3. Holding tungen forsigtigt trække dyret lige op på speculum (umodificeret), indtil dyret ikke kan trækkes yderligere op.
4. Stemmebåndene kan visualiseres oftest ved denne teknik alene, men rotere dyre-og hyper-udvidet halsen at bringe dem i fuld visning.
5. Advance en gel-loading pipette indeholdende inddrypningspræparat til glottis og indpode væsken. Fordi spekulum gør en tætning med hypopharynx musen vil aspirere eventuel resterende væske, der ikke går gennem ledninger. Det er nemt verificeres af rhonchorous lyder musen nu gør, når vejrtrækningen, indtil væsken fordeles fuldt ud i lungerne.
6. Alternativt tilsluttes PE10 slange til en 0,5 ml sprøjte indeholdende 50 pi væske med en luft bolus bag væsken. Advance PE rør forsigtigt gennem stemmebåndene til 0,5 cm og aflade indholdet i luftvejene langsomt. Dog lejlighedsvis trauma lavere luftvejene usynge denne teknik uden en bedre levering af prøven.

Representative Results

Intubation med ovenstående teknik er pålidelig og hurtig. Den passende placering af det endotracheale rør er lettest verificeres ved at observere udåndingsluft boblende fra den neddykkede eksspiratoriske led ventilatorkredsløbets (normalt i et PEEP fælde) og negative nedbøjninger på en luftvejstryk sporing (figur 1). De negative nedbøjninger på luftvejstryk sporing er de mest pålidelige. Andre har anvendt til flytning af en lille væske dråbe i intravenøs slange tilsluttet ekspiratoriske ventilatorkredsløb ^2. Selvom vi ikke har anvendt denne teknik omfattende, bør det være tilstrækkeligt at kontrollere rør placering. En erfaren operatør kan intubationstid mus ved hjælp af denne metode, omkring 90% af tiden på den første passage. For dem, der ikke røret fjernes straks, dyret reinduced med isofluran anæstesi, og placeringen igen forsøgt. Hvis dyret efterlades tilsluttet ventilatorkredsløbets i tilfælde af en ESOphageal intubation, vil maven gradvist insufflat skabe høje højeste luftvejstryk, hypoxæmi, og i sidste ende død, hvis der ikke er nogen intervention. Hvis høj højeste luftvejstryk observeres uden negative inspiratoriske indsats, skal dyret straks fjernes fra ventilatoren og extubated. At fjerne dyret fra ventilatoren og endotrachealrøret at de let vende denne. I løbet af de sidste 300 dyreforsøg kræver intubation en erfaren operatør intuberes 80% med det oprindelige forsøg, og mere end 95% af det andet forsøg. Alle dyr blev intuberet ved det tredje forsøg på erfarne operatører. Den tid, det tager at intubere mus er op til 5 min for preanesthetic, 90-120 sek til inducere mus med isofluran, og 30 sek til at identificere og faktisk intubere luftvejene. Vi har fundet, at nye elever skal lære at visualisere stemmebåndene først. Hvis de med succes kan demonstrere en fuld visning af stemmebånd ti gange, de er klar to begynde at træne for at intubere. Når praktikanter succes har intuberet 10 gange, som det fremgår af negative nedbøjninger på en luftvejstryk sporing i et spontant vejrtrækning dyr, de er klar til at foretage undersøgelser i forsøgsdyr. Dog vil en uddannelse video i høj grad fremskynde indlæringskurve. Kun uerfarne operatører fremkalde luftveje traumer ved denne teknik og dødsfald af dyr kan forekomme i denne indstilling, mens lære teknikken. Men tab af dyr med en erfaren operatør er sjælden. Det er vores erfaring i mere end 1.000 dyr i de sidste 4 år.

Et 20 G kateter anvendes som et endotrachealt rør i mus, fordi det gør en stram tætning med luftvejene, således at nøjagtige mål for luftvejstryk, og det er af tilstrækkelig diameter til foranstaltninger af luftvejsmodstand. Men ved hjælp af PE slange som en stilet eller bougie tillader 20 G at passere let og mere pålideligt gennem stemmebåndene. 1 i(2,5 cm) længde af kateteret tillader røret at blive placeret med navet på de nedre fortænder for stabilitet, men uden at forårsage traume til den nedre luftveje eller intubating den hovedstammebronkie bronkier.

Vi anvender denne teknik til at foretage målinger af luftvejsmodstand udføre methacholin dosis-respons-kurver (fig. 2), til at måle tryk-volumen relationer i lunge (figur 3). For alle disse målinger dyrene skal være fuldt lammet til at opnå brugbare og præcise data. Til dette formål har vi anvendt pancuroniumbromid som en billig, nondepolariserende paralytisk i nonrecovery eksperimenter. Men pancuronium er ikke længere tilgængelig og kan ikke bruges på dyr, der kommer til at inddrive på grund af sin lange halveringstid. Derfor har vi skiftet til vecuronium (30 min) eller rocuronium til lammelse på grund af deres kortere halveringstid, hvilket giver mulighed for gentagne målinger over tid. Andre forskere har brugtsuccinylcholin som en depolariserende paralytisk, men dets halveringstid har været for kort til de fleste af vores eksperimenter. Også succinylcholin kan forårsage histamin release ^3, og vil derfor være en potentiel forstyrrende variabel.

Vi har også anvendt direkte laryngoskopi teknik omfang til levering af teststoffer til lungen er baseret på en teknik, der oprindeligt rapporteret i rotter ved Hastings ^4. De fleste undersøgelser har anvendt nasal instillation til levering af teststoffer til de nedre luftveje, fordi mus er obligate nasal breathers og nasal instillation er let. Men vi har fundet den nasal instillation metode til at være upålidelige til kvantitativ levering. Ved at bruge direkte laryngoskopi teknik, vi har fundet, at kvantitativ levering er mere pålidelige og fordeling i lungerne er mere ensartet. Vores primære anvendelse af den direkte instillation teknik har været at levere antigen til de nedre luftveje ina model af allergisk inflammation (figur 4) og luftvejshyperfølsomhed (figur 2). Vi har også leveret andre teststoffer, såsom cytokiner og lægemidler via denne metode.

Figur 1.. Luftvejstryk sporing. Den blå linje afspejler luftvejstrykket og den røde linje viser den tidalvolumen sporing i mus umiddelbart efter intubering. De negative (faldende) omlægninger af trykkurven (sorte pile) angiver generation af negative intrathoracic tryk i mus (C57BL / 6, 24 g) ved spontan respiratorisk indsats og indikerer korrekt placering af endotrachealrøret. Klik her for at v iew en større version af dette tal.

Figur 2. Luftvejsmodstand og methacholin dosisresponskurver. Mus (C57BL / 6) intuberet ved denne teknik kan undergå foranstaltninger luftvejsmodstand og bronkial reaktivitet ved hjælp fordobling doser af methacholin leveres via ultralydsforstøver. I dette repræsentativt eksempel kontrol dyr har en minimal reaktion på methacholin op til 25 mg / ml, og ovalbumin immuniseret og udfordrede mus demonstrerer hyperreaktivitet til methacholin. Disse målinger er lavet med mus intuberet med en 20 G kateter og kan skelnes fra dem, der foretages i en trakeostomipatienter mus.

/ Files/ftp_upload/50269/50269fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50269/50269fig3.jpg "/>
Figur 3. Tryk-volumen-kurven. Dette er et repræsentativt tryk-volumen-kurve i en 20 g mus, der er blevet intuberet med en 20 G intravenøst ​​kateter, lammet pancuronium og mekanisk ventileret. Den viser, at kateteret ikke lækker op til 30 cm _H2O tryk og kan derfor anvendes til at foretage nøjagtige målinger tryk-volumen relationer i musen.

Figur 4.. Ovalbumin model af allergisk inflammation. Dette er et repræsentativt hematoxylin og eosin farvede afsnit af muselunge, der er blevet immuniseret og udfordres med ovalbumin. Det viser den generelle effekt af inddrypning af ovalbumin indgives via direkte laryngoskopi metode (forstørrelse 4X).

Discussion

I denne rapport beskriver vi en enkel, pålidelig teknik intubationstid mus, der er nontraumatic og kan anvendes gentagne gange i det samme dyr. Denne teknik kan opnås med enkle laboratorium eller medicinsk udstyr, der kan købes for et beskedent beløb. Teknikken direkte laryngoskopi oprindeligt rapporteret af Hastings og kolleger ⁴ kan også anvendes til en række forskellige formål, men især til præcist at levere teststoffer til de nedre luftveje. Vi har fundet denne teknik overlegen i forhold til dem, der rapporteres af andre efterforskere til dato på grund af sin lethed, hastighed, enkelhed, pålidelighed, lav udgift, og potentialet for gentagne målinger.

Teknikker til at intubere mus er ikke nye. En af de tidligste rapporter brugt gennemlysning af luftrøret, efterfulgt af oral intubation med en 24 G kateter ^5.. Men dette studie, og andre ^6,7 ikke tilstrækkelige oplysninger til at replikere technique i vores laboratorium. For nylig andre efterforskere har brugt denne gennemlysning teknik med større succes ^8,9. Den første detaljerede undersøgelse af Brown og kolleger rapporterede en undersøgelse, hvor mus, ophængt på en 45 ° bagplade, havde deres luftrør gennemlyste og deres luftrør intuberes oralt med PE90 rør under direkte visualisering ved hjælp af en fabrikeret laryngoskopbladet ^10. Denne teknik har vist sig vanskeligt at kopiere, og har derfor ikke været anvendt i udstrakt grad. Yderligere rapporter beskriver brugen af ​​stive optiske scopes eller fiberoptik til at forbedre pålideligheden af ​​teknikkerne. Vergari og kolleger ^11,12 brugt en stiv artroskop 1,7 mm i ydre diameter at visualisere stemmebåndene og derefter placeret en ledetråd gennem glottis. Forfatterne rapporterer 100% succes med denne teknik, at de udføres med specialiseret og dyrt udstyr. Udgifterne til denne kirurgisk udstyr virker uoverkommelige for udbredt anvendelse i mus. Yderligere teknikker er blevet udviklet ved hjælp af et operativsystem mikroskop og en 2F guidewire ^13. Denne teknik svarer til vores, men kræver brug af et operationsmikroskop, og dermed foretrækker vi anvendelsen af ​​en otoscope som er væsentligt billigere.

Fiberoptiske intubation teknikker er også blevet rapporteret ved hjælp af en relativt billig batteridrevet fiberoptic kilde ^14. Vi har forsøgt at udnytte denne fiberoptiske teknik, men har fundet lyset mindre end nyttigt, fordi der ikke er nogen tilsvarende fiberoptisk visualisering kanal. MacDonald og kolleger brugte en mere kraftfuld halogen lyskilde og rapporteres succes i en lille prøve. De var i stand til gentagne gange at måle modstanden i luftvejene ¹⁵ også. Gentagne foranstaltninger luftvejsmodstanden på forskellige tidspunkter er blevet rapporteret af andre ^16. Zhao, et al. Anvendes en retrograd teknik ved at punktere luftrøret og fodring en ledetråd gennem HYPo-og oropharynx ^17. Mere for nylig Singer et al. Har udført selektiv intubation af den venstre hovedstammebronkie bronkier i mus ved hjælp af et operationsmikroskop og fluoroskopi at dokumentere placeringen af kateteret ^18. Derefter brugte denne metode til at indgyde teststoffer selektivt ind i lungen. Men denne gang ville ikke være en metode, der kunne anvendes uden væsentlig omkostning og meget teknisk træning. Desuden vil fluoroskopi også tilføje en strålingsfaren til undersøgelsen.

Sammenfattende direkte laryngoskopi af mus ved hjælp af en pædiatrisk otoskop er en værdifuld teknik til intubation, gentagen intubation og test levering substans uden intubation. Vi finder denne teknik overlegen trakeostomi og tidligere rapporteret metoder noninvasively udfører endotracheal i mus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Operating Otoscope Head	Welch Allyn	21700	$188.98
Otoscope Handle	Welch Allyn	71000	$112.20
Reuseable Speculum	Welch Allyn	22002	$3.98
Fine Forceps	Miltex	18-779	$107.18
Small clamp stand to hold otoscope
Isoflurane Vaporizer (multiple circuit with vacuum waste gas handling)	Summit Medical		$3,000
Flexivent (Animal Ventilator)	SCIREQ		$35,000
Intravenous catheter (20 G, 1 in)	BD	381233	$9.62
Polyethylene tubing (PE10) (0.011 in I.D., 0.024 in O.D.) 100 ft	Intramedic, Clay-Adams	427401	$115.70
Ketamine 100 mg/ml (10 ml bottle)	Butler	23061	$10.00
Xylazine (100 ml bottle)	Vedco	24105	$20.00
Isoflurane (250 ml bottle)			$15.00
Vecuronium bromide 10 mg/10 ml	Pfizer	NDC 0069-0094-01	$15.00