Summary
Abbiamo sviluppato un metodo semplice, affidabile e relativamente poco costoso per l'intubazione endotracheale nei topi mediante laringoscopia diretta con un otoscopio con un speculum 2,0 millimetri. Questa tecnica è atraumatica e può essere utilizzato per misurazioni ripetute in esperimenti cronici. Troviamo superiore a tracheostomia o riportato in precedenza tecniche non chirurgiche.
Abstract
Mice, sia di tipo selvatico e transgenici, sono il modello mammiferi principale nella ricerca biomedica attualmente. Intubazione e ventilazione meccanica sono necessari per gli esperimenti sugli animali integrali che richiedono un intervento chirurgico in anestesia profonde o misure della funzione polmonare. Tracheostomia è stato lo standard per intubazione delle vie aeree in questi topi per consentire la ventilazione meccanica. Intubazione orotracheale è stata riportata, ma non è stato usato con successo in molti studi per la difficoltà tecnica sostanziale o un requisito di apparecchiature altamente specializzate e costose. Qui riportiamo una tecnica di laringoscopia diretta utilizzando un otoscopio dotato di uno speculum 2,0 mm utilizzando un catetere venoso 20 G come un tubo endotracheale. Abbiamo utilizzato questa tecnica ampiamente e affidabile per intubare e condurre accurate valutazioni della funzione polmonare nei topi. Questa tecnica si è dimostrato sicuro, con essenzialmente senza perdita degli animali in mani esperte. Inoltre, questa tecnicapuò essere utilizzato per studi ripetuti di topi in modelli cronici.
Introduction
Il topo di laboratorio ha soppiantato quasi tutte le specie di mammiferi come il modello principale della biologia e patobiologia. Il topo di laboratorio è la più piccola specie di mammiferi che è stato chiaramente e ampiamente dimostrato di essere di valore come modello di malattia umana e si è dimostrato prezioso anticipi della nostra comprensione della biologia umana e della malattia. Il tempo di gestazione breve e un costo sostanzialmente inferiore ha permesso lo sviluppo e lo studio di topi nulli e transgenici come strumento comune nella ricerca biomedica. Tuttavia, la dimensione del topo di laboratorio media (20-25 g) ha limitato il loro studio in studi basati fisiologicamente o chirurgicamente e, di conseguenza, alcuni ricercatori studiano grandi mammiferi. Un ostacolo all'utilizzo di topi in questi studi è la difficoltà incontrata con tecniche di intubazione che consentano misurazioni fisiologiche o estesi interventi chirurgici in anestesia profonda. Tracheostomia 1 è stato utilizzato come standard di TEchnique invece di intubazione per la maggiore facilità di esecuzione di questa tecnica e modesta abilità richiesto. Tuttavia, tracheostomia non è favorevole agli studi cronici o di recupero di chirurgia; quindi, è limitato agli esperimenti acuti. Tracheostomia può anche essere una variabile di confusione nella ricerca in cui l'infiammazione o riflessi fisiologici sensibili sono importanti.
Il nostro laboratorio ha provato più delle tecniche descritte da altri ricercatori e trovato inadeguate per una serie di motivi. Tracheostomia è troppo traumatico e induce sanguinamento e infiammazione delle vie aeree. Molto più problematico è che non possono in pratica essere ripetuto. Molte tecniche relativamente invasive che richiedono un modesto investimento in attrezzature non sono sufficientemente affidabili. Altre tecniche richiedono costose attrezzature che è difficile giustificare senza sapere se l'apparecchiatura funziona in una specifica applicazione. Così, abbiamo cercato di sviluppare una tecnica non traumatica che ha richiesto non più than un modesto investimento in attrezzature specializzate, potrebbe essere realizzato in modo rapido e affidabile, potrebbe essere ripetuta in modelli cronici, e potrebbe essere utilizzata in un gran numero di animali. Qui riportiamo tale tecnica.
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Protocol
1. Preparazione degli animali
- Ottenere i topi che sono più vecchi di 8 settimane e più di 20 g (i topi più piccoli possono essere intubati da un esperto).
- Anestesia
- Iniettare topi con 20 mg / kg, ciascuno, di chetamina e xilazina intraperitoneale come preanesthetic. (Questa dose è sufficiente per anestetizzare completamente il mouse, ma facilita il trasferimento, dopo l'intubazione, alla ventilazione meccanica.) Tuttavia, la regolazione dei dosaggi può essere necessario in base alla risposta anestetico in consultazione con il veterinario istituzionale.)
- Indurre l'anestesia nei topi con il 3,5% isoflurano / ossigeno in una camera di induzione per 90-120 sec.
- Osservare attentamente la frequenza respiratoria. Si dovrebbe rallentare progressivamente a non meno di 45 bpm.
2. Preparazione per l'intubazione
- Rimuovere il mouse dalla camera di induzione e Scruff ermeticamente.
- Utilizzare imbottiti pinza sottile a gently estendere la lingua dalla bocca.
- Mantenere l'estensione della lingua tenendo la lingua tra due dita e applicando la forza gentile.
- Estrarre il mouse sulla speculum del otoscopio con un movimento verticale.
- Guardare attraverso l'oculare del otoscopio mentre scruffing strettamente e tirare il mouse verso l'alto delicatamente la lingua e la collottola.
- Guardate attentamente per le corde vocali. Essi dovrebbero essere facilmente visibile in questo momento. Il aditus laryngis (la struttura dell'apertura laringeo) dovrebbe essere relativamente bianco. Dovrebbe esserci movimento delle cordicelle con ogni respiro. Se i cavi non si muovono o sono scarsamente visualizzate, ruotare leggermente l'animale e iperestendersi delicatamente il collo.
- Con la mano dominante, tenere il 20 G, 1 a catetere, con una lunghezza di 1 cm dalla tubazione PE10 estendentesi attraverso la punta del catetere, come una matita e inserirlo nel lato della speculum. Il tubo PE serve come uno stiletto o bougie.
- Dirigere il tubi PE10ng (mandrino) attraverso le corde vocali e far avanzare il catetere G 20 (tubo endotracheale) sopra il tubo PE finché il mozzo è a livello dell'incisivo inferiore. Rimuovi questo stiletto in fretta.
- Estrarre delicatamente l'animale fuori della speculum e verificare la posizione del tubo ponendo l'animale in un ventilatore meccanico con continua 2% isoflurano per mantenere l'anestesia generale tutto l'esperimento. Visualizza aria espirata (bolle) passando attraverso una trappola PEEP per confermare l'intubazione. Anche se l'intubazione esofagea può causare alcune bolle, non sarà così pronunciati o coerente con intubazione endotracheale. Inoltre, osservare un tracciato pressione delle vie aeree per le deviazioni negative (Figura 1). Questi confermano il corretto posizionamento del tubo. In alternativa, mettere una piccola quantità di acqua nel tubo IV e collegarlo al tubo ET. Verifica circolazione con il mouse con respirazione 2. Nel caso di intubazione esofagea, il pressione tracciamento rivelerà pressioni significativamente più elevati e senza deviazioni negative. Sebbene end-tidal CO 2 sarebbe utile, tecnicamente questo sarebbe molto difficile visti i piccoli volumi correnti (~ 200 microlitri) e l'attrezzatura per fare questo sarebbe molto costoso. Le semplici tecniche descritte sono pienamente sufficienti e molto meno costoso. Se l'anestesia isoflurano non è disponibile, tutte le procedure possono essere effettuate utilizzando la ketamina 80-120 mg / kg in combinazione con xylazina 10-20 mg / kg per l'anestesia generale.
3. Tecnica alternativa: laringoscopia diretta con la Tecnica otoscopio è facilmente utilizzate per altri scopi, principalmente per la diretta instillazione di sostanze di studio nei polmoni.
- Indurre anestesia negli animali con isoflurano solo per questa procedura al 3,5% per 90-120 secondi nella camera di induzione.
- Scruff l'animale saldamente alla base del cranio e prolungare la lingua delicatamentecon una pinza sottile.
- Tenendo la lingua con delicatezza, tirare l'animale verso l'alto della speculum (non modificato) fino a quando l'animale non può essere tirato ulteriormente.
- Le corde vocali possono essere visualizzate più frequentemente questa tecnica da sola, ma ruotare l'animale e iper-esteso il collo per portarli in piena vista.
- Anticipo di una pipetta di caricamento del gel contenente il instillate alla glottide e infondere il liquido. Poiché la speculum fa un sigillo con nell'ipofaringe il mouse aspirare qualsiasi liquido residuo che non passa attraverso le corde. Questo è facilmente verificabile dalla rhonchorous suoni il mouse ora fa quando il respiro fino a quando il liquido è distribuito pienamente nei polmoni.
- In alternativa, collegare il tubo PE10 a una siringa da 0,5 ml contenente 50 ml di fluido con un bolo aria dietro il liquido. Far avanzare il tubo PE attentamente le corde vocali di 0,5 centimetri e scaricare il contenuto nelle vie aeree lentamente. Tuttavia, trauma occasionale alle vie aeree inferiori si verifica ucantare questa tecnica senza migliore consegna del campione.
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Representative Results
Intubazione con la tecnica di cui sopra è affidabile e veloce. Il posizionamento appropriato del tubo endotracheale è più facilmente verificato osservando gorgogliare gas espirato dal espiratorio sommersa del del circuito di ventilazione (di solito in una trappola PEEP) e deviazioni negative su una pressione delle vie aeree tracciamento (Figura 1). Le deviazioni negative sulla pressione delle vie aeree tracciato sono i più affidabili. Altri hanno usato circolazione di una piccola goccia di fluido nel tubo endovenosa collegato al circuito di ventilazione espiratoria 2. Anche se non abbiamo usato questa tecnica ampiamente, dovrebbe essere sufficiente per verificare la posizione del tubo. L'operatore esperto può intubare topi con questo metodo circa il 90% del tempo al primo passaggio. Per coloro che sicuro, il tubo viene rimosso immediatamente, l'animale è reinduced con isoflurano, e il posizionamento di nuovo tentato. Se l'animale viene lasciato collegato al circuito del ventilatore nel caso di un esointubazione phageal, lo stomaco sarà gradualmente insufflare generando alte pressioni di picco delle vie aeree, ipossiemia, e infine la morte se non vi è alcun intervento. Se alte pressioni di picco delle vie aeree sono osservati senza sforzi inspiratori negativi, l'animale deve essere immediatamente rimosso dal ventilatore e estubato. Tuttavia, rimuovendo l'animale dal ventilatore e la rimozione del tubo endotracheale facilmente invertire questa. Durante gli ultimi 300 studi su animali richiedono intubazione un operatore esperto intubato 80% con il tentativo iniziale e più del 95% dal secondo tentativo. Tutti gli animali sono stati intubati per il terzo tentativo di operatori esperti. Il tempo impiegato per intubazione topi è di 5 min per il preanesthetic, 90-120 sec per indurre il mouse con isoflurano, e 30 sec per identificare ed effettivamente intubare le vie respiratorie. Abbiamo scoperto che i nuovi allievi dovrebbero imparare a visualizzare le corde vocali prima. Se riescono a dimostrare con successo una vista completa delle corde vocali dieci volte, sono pronti to iniziare l'addestramento per intubare. Una volta che i tirocinanti hanno intubato con successo 10 volte, come dimostrato dalle deviazioni negative su una pressione delle vie aeree tracciando in un animale che respira spontaneamente, sono pronti a svolgere gli studi in animali da esperimento. Tuttavia, un video di formazione notevolmente accelerare la curva di apprendimento. Solo gli operatori inesperti inducono trauma delle vie aeree da questa tecnica e morti di animali possono verificarsi in questa impostazione, mentre l'apprendimento della tecnica. Tuttavia, la perdita di animali con un operatore esperto è rara. Questa è la nostra esperienza in più di 1.000 animali nel corso degli ultimi 4 anni.
Un catetere G 20 è usato come un tubo endotracheale nei topi perché rende una perfetta tenuta con le vie aeree, permettendo così misure accurate di pressione delle vie aeree ed è di diametro sufficiente per le misure di resistenza delle vie aeree. Tuttavia, utilizzando il tubo PE come uno stiletto o bougie permette il 20 G di passare facilmente e più affidabile attraverso le corde vocali. Il 1 in(2,5 cm) lunghezza del catetere permette al tubo di essere posizionato con il mozzo a incisivi inferiori per la stabilità, ma senza causare traumi alle vie aeree inferiori o intubating bronchi acqua principale.
Usiamo questa tecnica per effettuare misurazioni di resistenza delle vie aeree, effettuare metacolina curve dose-risposta (Figura 2), e per misurare i rapporti pressione-volume del polmone (Figura 3). Per tutte queste misurazioni gli animali devono essere completamente paralizzati per ottenere utilizzabili, dati precisi. A questo scopo abbiamo utilizzato pancuronio bromuro come un poco costoso, non depolarizzanti paralitico in esperimenti nonrecovery. Tuttavia, pancuronio non è più disponibile e non può essere usata su animali che stanno per recuperare a causa della sua lunga emivita. Pertanto, si è passati a vecuronio (30 min) o rocuronio per paralisi a causa della loro breve emivita, offrendo la possibilità di misurazioni ripetute nel tempo. Altri ricercatori hanno utilizzatosuccinilcolina come paralitica depolarizzante, ma la sua emivita è troppo breve per la maggior parte dei nostri esperimenti. Anche succinilcolina può causare il rilascio di istamina 3 e sarebbe quindi un potenziale variabile confondente.
Abbiamo usato anche la tecnica diretta laringoscopia ampiamente per la consegna delle sostanze in esame al polmone basato su una tecnica originalmente riportata nei ratti mediante Hastings 4. La maggior parte delle indagini hanno utilizzato l'instillazione nasale per la consegna delle sostanze in esame per il tratto respiratorio inferiore, perché i topi sono respiratori nasali obbligati e l'instillazione nasale è facile. Tuttavia, abbiamo trovato il metodo instillazione nasale di essere inaffidabile per la consegna quantitativa. Utilizzando la tecnica laringoscopia diretta abbiamo trovato che la consegna quantitativa è più affidabile e distribuzione nel polmone è più uniforme. Il nostro uso principale della tecnica diretta instillazione è stato quello di consegnare antigene per l'i delle basse vie respiratoriena modello di infiammazione allergica (Figura 4) e iperreattività bronchiale (Figura 2). Abbiamo anche consegnato altre sostanze di prova come le citochine e farmaci tramite questo metodo.
Figura 1. Pressione delle vie aeree tracciamento. La linea blu riflette la pressione delle vie aeree e la linea rossa riflette il volume corrente tracciando nel topo subito dopo l'intubazione. I negativi (verso il basso) deformazioni della curva di pressione (frecce nere) indicano la generazione di pressione negativa intratoracica nel topo (C57BL / 6, 24 g) da sforzo respiratorio spontaneo e indica il corretto posizionamento del tubo endotracheale. Cliccate qui per v iew una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Resistenza delle vie aeree e metacolina curve dose-risposta. Topi (C57BL / 6) intubato da questa tecnica può subire misure di resistenza delle vie aeree e reattività bronchiale utilizzando raddoppio dosi di metacolina distribuito mediante nebulizzatore ultrasonico. In questo esempio rappresentativo, un animale di controllo ha una risposta minima alla metacolina fino a 25 mg / ml e ovoalbumina immunizzato e sfidò il mouse dimostra iperreattività alla metacolina. Queste misure sono effettuate con topi intubati con un catetere G 20 e sono indistinguibili da quelle fatte in un mouse tracheostomizzati.
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Figura 3. Pressione-volume curva. Questa è una curva rappresentativa pressione-volume in un mouse 20 g che sono stati intubati con un catetere endovenoso G 20, paralizzati con pancuronio, ed è meccanicamente ventilato. Ciò dimostra che il catetere non perde fino a 30 cm H 2 O di pressione e può quindi essere utilizzato per effettuare misure accurate relazioni pressione-volume nel topo.
Figura 4. Modello Ovalbumina di infiammazione allergica. Questa è una ematossilina rappresentativo e eosina sezione macchiato del mouse del polmone che è stato immunizzato e sfidato con ovalbumina. Esso dimostra l'effetto generalizzato di instillazione di ovalbumin somministrato per via del metodo laringoscopia diretta (ingrandimento 4X).
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Discussion
In questo rapporto descriviamo una tecnica semplice e affidabile per intubare i topi che è traumatica e può essere utilizzato più volte nello stesso animale. Questa tecnica può essere realizzato con semplice laboratorio o dispositivo medico che può essere acquistato per una somma modesta. La tecnica di laringoscopia diretta, originalmente riportata da Hastings e colleghi 4, può anche essere utilizzato per una varietà di scopi, ma principalmente per fornire precisione sostanze in esame per il tratto respiratorio inferiore. Abbiamo trovato questa tecnica superiore a quelli riportati da altri ricercatori a data la sua facilità, velocità, semplicità, affidabilità, basso costo, e il potenziale per misure ripetute.
Tecniche per intubare i topi non sono nuovi. Uno dei primi rapporti, transilluminazione usati di trachea, seguita da intubazione orale con un catetere G 5 24. Tuttavia, questo studio e altri 6,7 non hanno fornito informazioni sufficienti per replicare la technique nel nostro laboratorio. Recentemente altri ricercatori hanno utilizzato questa tecnica transilluminazione con maggiore successo 8,9. Il primo studio dettagliato da Brown e colleghi hanno riportato uno studio in cui topi, sospesa su un tabellone di 45 °, avevano i loro tracheas transilluminated e la loro trachea intubati per via orale con tubo PE90 sotto visualizzazione diretta utilizzando una lama laringoscopio fabbricato 10. Questa tecnica si è dimostrata difficile da replicare e, quindi, non è stata utilizzata ampiamente. Rapporti supplementari descrivono l'uso di ambiti o fiberoptics ottici rigidi per migliorare l'affidabilità delle tecniche. Vergari e colleghi hanno usato un rigido 11,12 artroscopio 1,7 millimetri di diametro esterno per visualizzare le corde vocali e poi messo un filo guida attraverso la glottide. Gli autori riportano il 100% di successo con questa tecnica, che si sono esibiti con attrezzature specializzate e costose. Il costo di questa attrezzatura chirurgica sembra proibitivo per uso molto diffuso nei topi. Altre tecniche sono state sviluppate utilizzando un microscopio operatorio e una guida 2f filo 13. Questa tecnica è simile alla nostra, ma richiede l'uso di un microscopio operatorio, e così si favorisce l'uso di un otoscopio che è sostanzialmente meno costoso.
Tecniche di intubazione a fibre ottiche sono stati segnalati anche usando una batteria relativamente economico alimentato a fonte fibre ottiche 14. Abbiamo cercato di utilizzare questa tecnica a fibre ottiche, ma abbiamo trovato la luce meno utile perché non c'è nessun canale corrispondente visualizzazione a fibre ottiche. MacDonald e colleghi hanno usato un più potente sorgente di luce alogena e riportati successo in un piccolo campione. Sono stati in grado di misurare ripetutamente resistenza delle vie aeree 15 anche. Misure ripetute della resistenza delle vie aeree in diversi momenti è stata riportata da altri 16. Zhao, et al. Utilizzata una tecnica retrograda perforando la trachea e alimentare un cavo guida nel hypo-e dell'orofaringe 17. Più recentemente Singer, et al. Hanno eseguito intubazione selettiva del bronco principale sinistro del mouse utilizzando un microscopio operatorio e fluoroscopia per documentare la posizione del catetere 18. Hanno quindi utilizzato questo metodo per infondere sostanze in esame selettivo nei polmoni. Come prima, questo non sarebbe un metodo che potrebbe essere utilizzato senza spesa significativa e formazione altamente tecnica. Inoltre, fluoroscopia inoltre aggiungere un pericolo di radiazioni allo studio.
In sintesi, la laringoscopia diretta di topo, utilizzando un otoscopio pediatrica è una tecnica utile per intubazione, intubazione ripetute e test di rilascio del principio attivo senza intubazione. Troviamo questa tecnica superiore alla tracheostomia e in precedenza riportato metodi di noninvasively eseguire l'intubazione endotracheale nei topi.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Un merito Sovvenzione del Department of Veteran Affairs e una borsa T32-HL098062 dal NHLBI dei National Institutes of Health sostenuto questo lavoro. Vogliamo riconoscere con gratitudine i consigli di Randolph H. Hasting, MD, Ph.D. e la consulenza e il sostegno del Veterinary Medical Unità del Sistema Sanitario di VA San Diego.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating Otoscope Head | Welch Allyn | 21700 | $188.98 |
| Otoscope Handle | Welch Allyn | 71000 | $112.20 |
| Reuseable Speculum | Welch Allyn | 22002 | $3.98 |
| Fine Forceps | Miltex | 18-779 | $107.18 |
| Small clamp stand to hold otoscope | |||
| Isoflurane Vaporizer (multiple circuit with vacuum waste gas handling) | Summit Medical | $3,000 | |
| Flexivent (Animal Ventilator) | SCIREQ | $35,000 | |
| Intravenous catheter (20 G, 1 in) | BD | 381233 | $9.62 |
| Polyethylene tubing (PE10) (0.011 in I.D., 0.024 in O.D.) 100 ft | Intramedic, Clay-Adams | 427401 | $115.70 |
| Ketamine 100 mg/ml (10 ml bottle) | Butler | 23061 | $10.00 |
| Xylazine (100 ml bottle) | Vedco | 24105 | $20.00 |
| Isoflurane (250 ml bottle) | $15.00 | ||
| Vecuronium bromide 10 mg/10 ml | Pfizer | NDC 0069-0094-01 | $15.00 |
References
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