Luftstrupsintubation i möss Published: April 5, 2014 doi: 10.3791/50269

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Joanna L. Thomas^1,2, Justin Dumouchel², Jinghong Li², Jenna Magat², Dana Balitzer³, Timothy D. Bigby^1,2

¹Medical and Research Services, VA San Diego Healthcare System, ²Department of Medicine, University of California, San Diego, ³School of Medicine, University of California, San Diego

Summary

Vi har utvecklat en enkel, pålitlig och relativt billig metod för endotrakeal intubation hos möss via direkt laryngoskopi använder ett otoskop med en 2,0 mm spekulum. Denna teknik är atraumatisk och kan användas för upprepade mätningar i kroniska experimenten. Vi tycker att det är bättre att trakeostomi eller tidigare rapporterade icke-kirurgiska tekniker.

Abstract

Möss, både vildtyp och transgena, är den huvudsakliga däggdjursmodellen i den biomedicinska forskningen idag. Intubation och mekanisk ventilation är nödvändig för hela djurförsök som kräver kirurgi under djup anestesi eller mätningar av lungfunktionen. Trakeostomi har varit standard för intuberande luftvägarna i dessa möss för att möjliggöra mekanisk ventilation. Orotracheal intubation har rapporterats men har inte använts framgångsrikt i många studier på grund av den betydande tekniska svårigheter eller krav på högspecialiserad och dyr utrustning. Här rapporterar vi en teknik för direkt laryngoscopy använder en otoskop försedd med en 2,0 mm spekulum och med användning av en 20 G intravenös kateter såsom en endotrakealtub. Vi har använt denna teknik i stor omfattning och tillförlitligt intubera och genomföra korrekta bedömningar av lungfunktionen hos möss. Denna teknik har visat sig vara säker, med i stort sett inget djur förlust i erfarna händer. Dessutom är denna teknikkan användas för upprepade studier av möss i kroniska modellerna.

Introduction

Laboratoriet mus har ersatt nästan alla arter som huvudmodell av biologi och pathobiologyen däggdjur. Laboratoriet mus är den minsta däggdjursarter som har varit tydligt och utförligt visat sig vara av värde som en modell för mänskliga sjukdomar och har visat sig ovärderlig i förskott för vår förståelse för människans biologi och sjukdomar. Den korta dräktighetstiden och betydligt lägre kostnad har möjliggjort utvecklingen och studier av null och transgena möss som ett vanligt verktyg inom biomedicinsk forskning. Däremot har storleken på den genomsnittliga laboratorium mus (20-25 g) begränsat sin studie i fysiologiskt eller kirurgiskt baserade studier och därmed vissa forskare studerar större däggdjursarter. Ett hinder för att använda möss i dessa studier är svårigheten med intubation tekniker som skulle tillåta fysiologiska mätningar eller omfattande kirurgiska ingrepp under djup anestesi. Trakeostomi ¹ har använts som ett standard technique istället för intubering på grund av den större lätthet att utföra denna teknik och blyg färdighet som fordras. Dock är trakeostomi inte bidrar till kroniska eller återhämtnings kirurgi studier; alltså, är det begränsat till akuta experiment. Trakeostomi kan också vara en confounding variabel i forskning där inflammation eller känsliga fysiologiska reflexer är viktiga.

Vårt laboratorium har provat de flesta av de tekniker som beskrivits av andra forskare och fann dem otillräckliga för en mängd olika skäl. Trakeostomi är för traumatisk och inducerar blödning och luftvägsinflammation. Mycket mer problematisk är att den inte kan rimligen upprepas. Många relativt icke-invasiv teknik som kräver en blygsam investering i utrustning inte är tillräckligt tillförlitliga. Andra tekniker kräver dyr utrustning som är svår att motivera utan att veta om utrustningen kommer att fungera i en viss applikation. Således försökte vi utveckla en icke traumatisk teknik som krävs ingen mer tHan en blygsam investering i specialiserad utrustning, kan utföras snabbt och tillförlitligt sätt, skulle kunna upprepas i kroniska modeller, och kan användas i ett stort antal djur. Här rapporterar vi en sådan teknik.

Protocol

1. Djurpreparering

1. Skaffa möss som är äldre än 8 veckor och mer än 20 g (mindre möss kan intuberade av en expert).
2. Anestesi
   1. Injicera möss med 20 mg / kg, var och en, av ketamin och xylazin intraperitonealt som en preanesthetic. (Denna dos är tillräcklig för att helt söva musen, men underlättar säker överföring, efter intubation, till mekanisk ventilation.) Kan dock justering av doser vara nödvändiga enligt anestesisvar i samråd med den institutionella veterinär.)
   2. Inducera anestesi hos möss med 3,5% isofluran / syre i en induktionskammare för 90-120 sek.
   3. Beakta andningsfrekvensen noggrant. Det bör sakta successivt till lägst 45 slag per minut.

2. Förberedelse för Intubation

1. Ta bort musen från induktionskammare och nackskinnet tätt.
2. Använd vadde fin pincett för att gently förlänga tungan ur munnen.
3. Behåll förlängning av tungan genom att hålla tungan mellan två fingrar och ett lätt kraft.
4. Dra musen upp på spekulum av otoskop med en vertikal rörelse.
5. Titta igenom okulär av otoskop samtidigt scruffing tätt och dra musen upp försiktigt med tungan och nackskinnet.
6. Titta noga för stämbanden. De skall vara väl synliga vid den här tiden. Den laryngis Aditus (strukturen hos struphuvudsöppning) bör titta relativt vitt. Det bör finnas förflyttning av linorna med varje andetag. Om kablarna inte rör sig eller är dåligt visualiseras, rotera djuret lätt och försiktigt översträcka halsen.
7. Med den dominerande handen, håll 20 G, 1 i kateter, med en 1 cm längd PE10 slangen sträcker sig genom spetsen av katetern, som en penna och för in den i sidan av spekulum. PE-slang fungerar som en styrtråd eller bougie.
8. Rikta PE10 tubing (stylet) genom stämbanden och avancera till 20 G kateter (endotrakeal tub) över PE slangen tills navet är i nivå med den undre framtand. Ta bort den här sonden snabbt.
9. Ta försiktigt djuret bort av spekulum och kontrollera röret platsen genom att placera djuret på en mekanisk ventilator med kontinuerlig 2% isofluran för att upprätthålla allmän anestesi under hela experimentet. Visualisera utandad luft (bubblor) går igenom en PEEP fälla för att bekräfta intubation. Även esofagus intubation kan resultera i några bubblor, kommer det inte vara så uttalade eller som överensstämmer med endotrakeal intubation. Också observera en luftvägstryck spårning för negativa nedböjningar (Figur 1). Dessa bekräftar korrekt placering av röret. Alternativt, placera en liten mängd vatten i IV-slangen och anslut den till ET röret. Verifiera rörelse till och från mus med andning ^2. I fallet med esofageal intubation pryck spårning kommer att avslöja betydligt högre tryck och inga negativa omläggningar. Även om sluttidvatten _CO2 skulle vara till hjälp, tekniskt skulle vara mycket svårt med tanke på de små tidalvolymer (~ 200 mikroliter) och utrustning för att göra detta skulle vara mycket dyrt. De enkla tekniker som beskrivits är fullt tillräcklig och mycket billigare. Om isoflurananestesi inte är tillgänglig, kan alla förfaranden utföras med ketamin 80-120 mg / kg i kombination med xylazin 10-20 mg / kg för narkos.

3. Alternativ Teknik: Direkt laryngoskopi med Otoskop tekniken används Lätt för andra ändamål, främst för direkt instillation av Studie Ämnen i Lung.

1. Inducera anestesi på djur med enbart isofluran för detta förfarande på 3,5% under 90-120 sekunder i induktionskammare.
2. Nackskinnet djuret tätt vid basen av skallen och förlänga tungan försiktigtmed fin pincett.
3. Håll tungan försiktigt, dra djuret rakt upp på spekulum (omodifierade) till dess att djuret inte kan dras upp ytterligare.
4. Stämbanden kan visualiseras oftast av denna teknik ensam, men rotera djuret och hyper förlängde halsen för att bringa dem i full storlek.
5. Advance en gel-laddning pipett innehåller instillate till stämband och ingjuta vätskan. Eftersom spekulum gör en tätning med hypofarynx musen kommer aspirera någon resterande vätska som inte går igenom sladdarna. Detta kan lätt verifieras genom rhonchorous låter musen gör nu vid andning tills vätskan fördelas helt i lungorna.
6. Alternativt, anslut PE10 slangen till en 0,5 ml spruta med 50 l av vätska med en luft bolus bakom vätskan. Advance PE slangen försiktigt genom stämbanden för 0,5 cm och ladda ur innehållet i luftvägarna långsamt. Men enstaka trauma i nedre luftvägarna uppstår usjunger denna teknik utan bättre leverans av provet.

Representative Results

Intubation med ovanstående teknik är pålitlig och snabb. Lämplig placering av endotrakealtub är lättast att konstatera genom att observera expired gas bubblande från den nedsänkta utandnings delen av den av ventilatorkretsen (vanligtvis i ett PIP fälla) och negativa omläggningar på en luftvägstryck spårning (Figur 1). De negativa nedböjningar på luftvägstryck spårning är de mest tillförlitliga. Andra har använt förflyttning av en liten vätskedroppe i intravenösa slangen ansluten till utandningsventilationskretsen ^2. Även om vi inte har använt denna teknik i stor utsträckning, bör det räcka för att kontrollera röret plats. En erfaren operatör kan intuberas möss med denna metod ungefär 90% av tiden på den första passagen. För dem som misslyckas, röret omedelbart bort, är djuret reinduced med isoflurananestesi, och placeringen på nytt försök. Om djuret lämnas ansluten till ventilationskretsen i fallet med en esophageal intubation, kommer magen successivt insufflate generera höga toppluftvägstryck, hypoxemi, och slutligen döden, om det inte finns någon inblandning. Om hög peak luftvägstryck observeras utan negativa inandningsinsatser, skall djuret omedelbart avlägsnas från ventilatorn och extuberade. Men att ta bort djuret från ventilatorn och ta bort endotrakealtub lätt vända. Under de senaste 300 djurstudier som kräver intubation en erfaren operatör intuberas 80% med det första försöket och mer än 95% av det andra försöket. Alla djur intuberade av det tredje försöket av erfarna operatörer. Den tid det tar att utföra intubation möss är upp till 5 min för preanesthetic, från 90 till 120 sek för att inducera mus med isofluran, och 30 sek för att identifiera och faktiskt intuberas luftväg. Vi har funnit att nya praktikanter ska lära sig att visualisera stämbanden först. Om de lyckas kan visa en fullständig bild av stämbanden tio gånger, de är redo to börja träna för att intuberas. När praktikanter har framgångsrikt intuberas 10 gånger, vilket framgår av negativa nedböjningar på en luftvägstryck spårning i ett spontant andas djur, de är redo att utföra djurförsök. Dock kommer en utbildning video kraftigt påskynda inlärningskurvan. Endast oerfarna operatörer framkalla luftvägs trauma med denna teknik och dödsfall av djur kan förekomma i den här inställningen när man lär sig tekniken. Dock är förlust av djur med en erfaren operatör sällsynt. Det är vår erfarenhet i mer än 1000 djur under de senaste 4 åren.

A 20 G kateter används såsom en endotrakealtub i möss eftersom det gör en tät tätning med luftvägen, vilket möjliggör exakta mått på luftvägstryck och det är av tillräcklig diameter för mått på luftvägsmotståndet. Men med hjälp av PE-slang som en styrtråd eller bougie låter 20 G att passera lätt och mer tillförlitligt genom stämbanden. I en i(2,5 cm) längd av katetern tillåter röret att placeras med navet vid de nedre framtänderna för stabilitet, men utan att orsaka trauma mot nedre luftvägarna eller intuberande den mainstem bronkerna.

Vi använder denna teknik för att göra mätningar av luftvägsmotståndet, utföra metakolin dos-responskurvor (figur 2), och för att mäta tryck-volym-relationer i lungan (Figur 3). För alla dessa mätningar djuren måste vara helt förlamad för att få användbara och korrekta data. För detta ändamål har vi använt pankuroniumbromid som ett billigt, icke depolariserande paralytisk i nonrecovery experiment. Dock är pankuronium inte längre tillgänglig och kan inte användas på djur som kommer att återhämta sig på grund av dess långa halveringstid. Därför har vi bytt till vekuronium (30 min) eller rokuronium för förlamning på grund av sin kortare halveringstid, som ger möjlighet till upprepade mätningar över tid. Andra forskare har använtsuccinylkolin som en depolariserande lame, men dess halveringstid har varit för kort för de flesta av våra experiment. Också succinylkolin kan orsaka histaminfrisättning ³ och skulle därför vara en potentiell confounding variabel.

Vi har även använt den direkta laryngoscopy teknik i stor utsträckning för att leverera testsubstanser till lungan baserat på en teknik som ursprungligen rapporterats i råttor genom Hastings ^4. De flesta undersökningar har använt nasal instillation för tillförsel av testämnen till de nedre luftvägarna, eftersom möss är obligata nasal ventilering och nasal instillation är lätt. Vi har dock funnit det nasala instilla metoden att vara opålitliga för kvantitativ leverans. Genom att använda den direkta laryngoskopi teknik har vi funnit att kvantitativ leveransen är mer tillförlitlig och distribution i lungan är mer enhetlig. Vårt huvudsakliga användningen av den direkta tillförseln teknik har varit att leverera antigen till de nedre luftvägarna ina modell av allergisk inflammation (Figur 4) och luftvägsöverkänslighet (figur 2). Vi har även levererat andra test ämnen såsom cytokiner och läkemedel via denna metod.

Figur 1. Luftvägstryck spårning. Den blå linjen visar den luftvägstryck och den röda linjen visar den tidalvolym spårning i musen direkt efter intubering. De negativa (nedåt) omläggningar av tryckkurvan (svarta pilar) indikerar generering av intratorakala trycket i musen (C57BL / 6, 24 g) genom spontan andningsansträngning och visar korrekt placering av endotrakealtub. Klicka här för att v iew en större version av denna figur.

Figur 2. Luftvägsmotståndet och metakolin dosresponskurvor. Möss (C57BL / 6) intuberades med denna teknik kan genomgå mått på luftvägsmotståndet och bronkiell reaktivitet med användning av dubblerings doser av metakolin som levereras via ultraljudnebulisator. I detta representativt exempel, har en styr djur en minimal respons på metakolin upp till 25 mg / ml och ovalbumin vaccineras och utmanade musen visar hyperreaktivitet för metakolin. Dessa mätningar är gjorda med möss intuberade med en 20 G kateter och inte kan skiljas från dem som gjorts i ett trakeostomiopererad mus.

/ Files/ftp_upload/50269/50269fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50269/50269fig3.jpg "/>
Figur 3. Tryck-volymkurvan. Detta är en representativ tryckvolymkurvan i en 20 g mus som har intuberade med en 20 G intravenös kateter, förlamad med pankuronium, och mekaniskt ventilerade. Det visar att katetern inte läcker upp till 30 cm _H2O tryck och kan därför användas för att göra korrekta mätningar tryck-volymrelationer i musen.

Figur 4. Ovalbumin modell av allergisk inflammation. Det här är ett representativt hematoxylin och eosin färgade området i muslunga som har immuniserats och utmanades med ovalbumin. Det visar den generaliserade effekten av instillation av ovalbumin administrerat via direkt laryngoskopi metoden (förstoring 4X).

Discussion

I denna rapport beskriver vi en enkel, tillförlitlig teknik för att intubate möss som är icke traumatisk och kan användas flera gånger i samma djur. Denna teknik kan åstadkommas med enkla laboratorium eller medicinsk utrustning som kan köpas för en blygsam summa. Tekniken att direkt laryngoscopy ursprungligen rapporterades av Hastings och kollegor ^4, kan också användas för en mängd olika ändamål, men främst för att exakt leverera testämnen till de nedre luftvägarna. Vi har funnit denna teknik överlägsen de som rapporterats av andra forskare hittills på grund av dess enkelhet, snabbhet, enkelhet, tillförlitlighet, låg kostnad, och potentialen för upprepade mätningar.

Tekniker för att intubate möss är inte nya. En av de tidigaste rapporterna, används genomlysning av luftstrupen, följt av oral intubation med en 24 G kateter ^5. Men denna studie och andra ^6,7 inte tillräcklig information för att replikera technique i vårt laboratorium. Nyligen andra forskare har använt denna genomlysning teknik med större framgång ^8,9. Den första detaljerade studien av Brown och kollegor rapporterade en studie där möss, upphängd på en 45 ° bakplatta, hade sina tracheas genomlysta och deras luftstrupen intuberades oralt med PE90 slangen under direkt visualisering med hjälp av en fabricerade laryngoskop blad ^10. Denna teknik har visat sig vara svår att replikera, och därför inte har utnyttjats i stor omfattning. Andra rapporter beskriver användningen av stela optiska oscilloskop eller fiberoptik för att förbättra tillförlitligheten hos de tekniker. Vergari och kollegor ^11,12 använde en styv artroskopet 1,7 mm i ytterdiameter för att visualisera stämbanden och sedan placeras en styrtråd genom glottis. Författarna rapporterar 100% framgång med denna teknik att de utförs med specialiserade och dyr utrustning. Kostnaden för denna kirurgisk utrustning verkar oöverkomliga för utbredd användning i möss. Ytterligare tekniker har utvecklats med hjälp av ett operationsmikroskop och en 2f styrtråd ^13. Denna teknik liknar vårt, men kräver användning av ett operationsmikroskop, och därmed gynna vi användning av ett otoskop som är väsentligt billigare.

Fiberoptiska intubation tekniker har också rapporterats med hjälp av en relativt billig batteridriven fiberoptisk källa ^14. Vi har försökt att använda denna fiberoptisk teknik, men har funnit ljuset mindre än nytta, eftersom det inte finns någon motsvarande fiberoptisk visualisering kanal. MacDonald och kollegor använde en mer kraftfull halogen ljuskälla och rapporterade framgång i ett litet prov. De kunde upprepade gånger mäta luftvägsmotstånd ¹⁵ också. Upprepade mått på motståndet i luftvägarna vid olika tidpunkter har rapporterats av andra ^16. Zhao, et al. Använde en retrograd teknik genom punktering av luftstrupe och matning av en styrtråd genom den hypo-och orofarynx ^17. Mer nyligen Singer et al. Har utfört selektiv intubation av vänster huvudbronken i mus med användning av ett operationsmikroskop och fluoroskopi för att dokumentera läget av katetern ^18. De använde sedan denna metod för att ingjuta testsubstanser selektivt in i lungan. Men detta återigen inte skulle vara en metod som kunde användas utan betydande kostnad och mycket teknisk träning. Dessutom skulle fluoroscopy också lägga en strålningsfara för studien.

Sammanfattningsvis är direkt laryngoskopi av möss med användning av en pediatrisk otoskop en värdefull teknik för intubation, upprepade intubation och testämne leverans utan intubation. Vi finner denna teknik överlägsen trakeostomi och tidigare rapporterade metoder för icke-invasivt utföra endotrakeal intubation hos möss.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Operating Otoscope Head	Welch Allyn	21700	$188.98
Otoscope Handle	Welch Allyn	71000	$112.20
Reuseable Speculum	Welch Allyn	22002	$3.98
Fine Forceps	Miltex	18-779	$107.18
Small clamp stand to hold otoscope
Isoflurane Vaporizer (multiple circuit with vacuum waste gas handling)	Summit Medical		$3,000
Flexivent (Animal Ventilator)	SCIREQ		$35,000
Intravenous catheter (20 G, 1 in)	BD	381233	$9.62
Polyethylene tubing (PE10) (0.011 in I.D., 0.024 in O.D.) 100 ft	Intramedic, Clay-Adams	427401	$115.70
Ketamine 100 mg/ml (10 ml bottle)	Butler	23061	$10.00
Xylazine (100 ml bottle)	Vedco	24105	$20.00
Isoflurane (250 ml bottle)			$15.00
Vecuronium bromide 10 mg/10 ml	Pfizer	NDC 0069-0094-01	$15.00