Endotrakeal intubering i Mus Published: April 5, 2014 doi: 10.3791/50269

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Joanna L. Thomas^1,2, Justin Dumouchel², Jinghong Li², Jenna Magat², Dana Balitzer³, Timothy D. Bigby^1,2

¹Medical and Research Services, VA San Diego Healthcare System, ²Department of Medicine, University of California, San Diego, ³School of Medicine, University of California, San Diego

Summary

Vi har utviklet en enkel, pålitelig, og relativt billig metode for endotrakeal intubasjon hos mus via direkte laryngoskopi ved hjelp av en Otoskop med en 2,0 mm spekulum. Denne teknikken er atraumatisk og kan anvendes for gjentatte målinger i kroniske eksperimenter. Vi synes det er bedre enn trakeostomi eller tidligere rapportert nonsurgical teknikker.

Abstract

Mus, både villtype og transgene, er rektor pattedyr modell i biomedisinsk forskning i dag. Intubasjon og mekanisk ventilasjon er nødvendig for hele dyreforsøk som krever kirurgi etter dype anestesi eller målinger av lungefunksjonen. Trakeostomi har vært standard for intubering luftveiene hos disse mus for å tillate mekanisk ventilasjon. Orotracheal intubasjon er blitt rapportert, men har ikke blitt brukt i mange studier på grunn av den betydelige tekniske vanskeligheter eller et krav for høyt spesialisert og kostbart utstyr. Her rapporterer vi en teknikk for direkte laryngoskopi ved hjelp av en otoscope utstyrt med en 2,0 mm spekulum og ved hjelp av en 20 G intravenøs kateter som en endotrakeal tube. Vi har brukt denne teknikken i stor utstrekning og pålitelig å intubere og gjennomføre nøyaktige vurderinger av lungefunksjon hos mus. Denne teknikken har vist seg trygge, med egentlig ingen dyr tap i erfarne hender. Dessuten, denne teknikkenkan brukes for gjentatt studier av mus i kroniske modeller.

Introduction

Laboratoriet musen har fortrengt nesten alle arter som rektor pattedyr modell av biologi og patobiologi. Laboratoriet musen er de minste pattedyrarter som har vært tydelig og omfattende vist seg å være av verdi som en modell for menneskelig sykdom og har vist seg uvurderlig i fremskritt i vår forståelse av menneskets biologi og sykdom. Den korte drektighetsperiode og vesentlig lavere kostnader har gjort at utvikling og studier av null og transgene mus som et vanlig verktøy i biomedisinsk forskning. Imidlertid er størrelsen av den gjennomsnittlige laboratoriemus (20-25 g) begrenset deres studier i fysiologisk eller kirurgisk baserte undersøkelser, og følgelig noen forskere studere større pattedyr-arter. Et hinder for å bruke mus i disse studiene er vanskelighetene ved intubasjon teknikker som ville tillate fysiologiske målinger eller omfattende kirurgiske prosedyrer under dyp narkose. Trakeostomi ^en har blitt brukt som en standard technique stedet for intubasjon på grunn av den større enkelhet i denne teknikken, og beskjeden dyktighet som kreves. Imidlertid er trakeostomi ikke bidrar til kroniske eller gjenopprettings studier ved kirurgi; således, er det begrenset til akutte eksperimenter. Trakeostomi kan også være en forvirrende variabel i forskning hvor betennelsen eller sensitive fysiologiske reflekser er viktig.

Våre laboratorie har forsøkt fleste av teknikkene som er beskrevet av andre forskere, og fant dem utilstrekkelig for en rekke grunner. Trakeostomi er altfor traumatisk og induserer blødning og luftveier betennelse. Mye mer problematisk er at det ikke kan være praktisk mulig gjentas. Mange relativt invasiv teknikker som krever en beskjeden investering i utstyr er ikke tilstrekkelig pålitelig. Andre teknikker krever dyrt utstyr som er vanskelig å rettferdiggjøre uten å vite om utstyret vil fungere i et bestemt program. Dermed forsøkte vi å utvikle en nontraumatic teknikk som kreves ikke mer thå en moderat investering i spesialisert utstyr, kan oppnås raskt og pålitelig kan repeteres i kroniske modeller, og kan brukes i et stort antall dyr. Her kan vi rapportere en slik teknikk.

Protocol

En. Animal Forberedelse

1. Skaff mus som er eldre enn 8 uker, og mer enn 20 g (mindre mus kan intuberes av en ekspert).
2. Anestesi
   1. Injisere mus med 20 mg / kg hver, av ketamin og xylazin intraperitonealt som en preoperativ anestesi. (Denne dosen er utilstrekkelig til fullt bedøve musa, men letter sikker overføring, etter intubering, til mekanisk ventilasjon.) Kan imidlertid justering av doser være nødvendig i henhold til narkosen respons i samråd med den institusjonelle veterinær.)
   2. Indusere anestesi i mus med 3,5% isofluran / oksygen i en induksjonskammeret for 90 til 120 sek.
   3. Observer respirasjonsfrekvens nøye. Det bør bremse gradvis til ikke mindre enn 45 bpm.

2. Forberedelse til Intubering

1. Fjern musen fra induksjonskammeret og Scruff tett.
2. Bruk polstrede fin pinsett til gently strekker tungen fra munnen.
3. Oppretthold forlengelse av tungen ved å holde tungen mellom to fingre, og påføring av et lett kraft.
4. Trekk mus opp på spekulum over otoscope med en vertikal bevegelse.
5. Se gjennom okulær av otoskop mens scruffing tett og dra musen opp forsiktig med tungen og Scruff.
6. Se nøye på stemmebåndene. De bør være lett synlig på dette tidspunktet. Den laryngis aditus (strukturen i strupeåpningen) bør se relativt hvit. Det skal være bevegelse av ledningene med hvert åndedrag. Hvis ledningene ikke er i bevegelse eller er dårlig visualisert, rotere dyret litt og forsiktig hyperextend halsen.
7. Med den dominerende hånden til å holde 20 G, en i kateteret, med en 1 cm lengde av PE10 slange som strekker seg gjennom enden av kateteret, for eksempel en blyant, og sette den inn i siden av spekulum. PE-rør fungerer som en stilett eller bougie.
8. Rett PE10 Tubing (stylet) gjennom stemmebåndene og fremme 20 G kateter (Trachealtube) over PE rør til navet er på nivå med den nedre fortann. Fjern denne stylet raskt.
9. Forsiktig ta dyret ut av spekulum og verifisere røret plassering ved å plassere dyret på en mekanisk ventilator med 2% isofluran kontinuerlig for å opprettholde generell anestesi i løpet av eksperimentet. Visual utåndingsluft (bobler) går gjennom en PEEP felle for å bekrefte intubering. Selv øsofageal intubasjon kan resultere i noen få bobler, vil det ikke være så markant, eller som i samsvar med endotracheal intubasjon. Også observere en luftveistrykk sporing for negative nedbøyninger (Figur 1). Disse bekrefter riktig plassering av røret. Alternativt kan man legge en liten mengde vann i IV rør og koble den til ET tube. Kontrollere bevegelse til og fra musen med åndedrett ^to. I tilfelle av spiserør intubasjon, prykk tracing vil avsløre betydelig høyere trykk og ingen negative blokkeringer. Selv om end-tidal CO ₂ ville være nyttig, teknisk dette ville være svært vanskelig gitt de små tidalvolum (~ 200 mL) og utstyr for å gjøre dette ville være svært kostbart. De enkle teknikker som er beskrevet er helt tilstrekkelig, og mye mindre kostbart. Hvis isoflurananestesi ikke er tilgjengelig, kan alle prosedyrer skal utføres ved bruk ketamin 80-120 mg / kg i forbindelse med xylazin 10-20 mg / kg for generell anestesi.

Tre. Alternativ teknikk: Direkte Laryngoskopi med Otoskop teknikken brukes Lett for andre formål, hovedsakelig for direkte instillasjon av Study stoffer inn i Lung.

1. Indusere anestesi i dyr med isofluran alene for denne prosedyren på 3,5% for 90 til 120 sekunder i induksjonskammeret.
2. Scruff dyret tett ved bunnen av hodeskallen og strekker tungen forsiktigmed fin pinsett.
3. Holde tungen forsiktig, trekker dyret rett opp på spekulum (uendret) inntil dyret ikke kan trekkes opp ytterligere.
4. Stemmebåndene kan visualiseres oftest ved denne teknikken alene, men roter dyret og hyper-utvidet nakken for å bringe dem i full størrelse.
5. Advance en gel-lasting pipette inneholder instillate til glottis og innpode væsken. Fordi spekulum gjør en tetning med hypofarynks musen vil aspirere eventuell gjenværende væske som ikke går gjennom ledningene. Dette er lett verifiseres av rhonchorous lyder mus gjør nå når puste inntil væsken er fordelt helt i lungene.
6. Alternativt kan man koble PE10 slange til en 0,5 ml sprøyte inneholdende 50 mL av fluid med en luft bolus bak væsken. Advance PE rør nøye gjennom stemmebåndene til 0,5 cm og utslipp innholdet inn i luftveiene sakte. Imidlertid forekommer sporadisk traumer til nedre luftveis usynge denne teknikken uten å bedre levering av prøven.

Representative Results

Intubasjon med ovennevnte teknikken er pålitelig og rask. Den aktuelle plasseringen av endotrakealtuben er lettest verifisert ved å observere utløpt gass boblende fra neddykket ekspiratorisk lem av av ventilatorkretsen (vanligvis i en PEEP felle) og negative nedbøyninger på en luftveistrykk tracing (Figur 1). De negative blokkeringer på luftveistrykk sporing er den mest pålitelige. Andre har brukt bevegelse av en liten væskedråpe i intravenøse slanger som er koblet til den ekspiratoriske ventilator krets ^2. Selv om vi ikke har brukt denne teknikken i stor utstrekning, bør det være tilstrekkelig å verifisere tube plassering. En erfaren operatør kan intubere mus ved hjelp av denne metoden ca 90% av tiden på første pass. For de som ikke, røret blir umiddelbart fjernet, blir dyret reinduced med isofluran anestesi, og plassering på nytt forsøk. Hvis dyret er igjen koblet til respiratoren kretsen i tilfelle av en esophageal intubasjon, vil magen gradvis insufflate generere høye peak luftveistrykk, hypoksemi, og til slutt død hvis det ikke er noen intervensjon. Hvis høy topp luftveistrykk er observert uten negative inspiratoriske innsats, skal dyret straks fjernes fra ventilator og extubated. Imidlertid fjerner dyret fra respiratoren og fjerne det endotrakeale røret lett reversere dette. I løpet av de siste 300 dyrestudier som krever intubasjon intubert en erfaren operatør på 80% med den første forsøk, og mer enn 95% av det andre forsøk. Alle dyrene ble intubert med den tredje forsøk på erfarne operatører. Tiden det tar å intubere mus er opp til 5 min for preoperativ anestesi, 90-120 sek å indusere musen med isofluran, og 30 sek for å identifisere og faktisk intubere luftveiene. Vi har funnet at nye traineer bør lære å visualisere de stemmebåndene først. Hvis de lykkes kan demonstrere en full oversikt over stemmebåndene ti ganger, er de klare to begynne å trene for å intubere. Når traineer har lykkes intubert 10 ganger, som demonstrert av negative nedbøyninger på en luftveistrykk sporing i en spontant pustende dyr, er de klare til å utføre studier i forsøksdyr. Imidlertid vil en trening video sterkt akselerere læringskurve. Bare uerfarne operatører indusere luftveis traumer av denne teknikken og dødsfall av dyr kan forekomme i denne innstillingen mens du lærer teknikken. Imidlertid er tap av dyr med en erfaren operator sjeldne. Dette er vår erfaring i mer enn 1000 dyr i løpet av de siste fire årene.

A 20 G kateter blir brukt som et endotrakealt rør i mus, fordi det gjør en tett forsegling med luftveiene, noe som tillater nøyaktige målinger av luftveistrykk og det er av tilstrekkelig diameter for målinger av luftveismotstanden. Men bruk av PE rør som en stilett eller bougie gjør at 20 G til å passere lett og mer pålitelig gjennom stemmebåndene. Den 1 in(2.5 cm) lengde av kateteret tillater røret å bli plassert med navet ved de nedre fortenner for stabilitet, men uten å forårsake skade på nedre luftveier eller å intubere mainstem bronkiene.

Vi bruker denne teknikken for å gjøre målinger av luftveismotstand, utfører metakolin dose-respons-kurver (figur 2), og for å måle trykk-volum-forhold i lungene (figur 3). For alle disse målingene dyrene må være helt paralysert å få brukbare og nøyaktige data. For dette formålet har vi brukt pancuronium bromide som en billig, depolariserende lamme i nonrecovery eksperimenter. Imidlertid er pancuronium ikke lenger er tilgjengelig, og kan ikke brukes på dyr som kommer til å gjenvinne på grunn av dets lange halveringstid. Derfor har vi byttet til vekuronium (30 min) eller rocuronium for lammelser på grunn av deres kortere halveringstid, noe som gir mulighet for gjentatte målinger over tid. Andre forskere har bruktsuccinylcholine som en depolariserende lammende, men halveringstiden har vært for kort for de fleste av våre eksperimenter. Også succinylcholine kan forårsake histaminfrigjøring ³ og vil derfor være et potensielt konfunderende variabel.

Vi har også benyttet den direkte laryngoskopi teknikk i stor utstrekning for levering av teststoffer i lunge basert på en teknikk som opprinnelig rapportert hos rotter ved Hastings ^4. De fleste undersøkelser har brukt nasal inndrypping for levering av teststoffer på det nedre luftveier fordi mus er obligate nasal breathers og nasal inndrypping er lett. Vi har imidlertid funnet at nasal inndrypping metoden til å være upålitelige for kvantitativ levering. Ved å bruke den direkte laryngoskopi teknikk har vi funnet at kvantitativ levering er mer pålitelig og fordeling i lungen er mer ensartet. Vår hoved bruk av den direkte instillasjon teknikk har vært å levere antigen til den nedre luftveier ina modell for allergisk inflammasjon (figur 4) og luftveier hyperreaktivitet (figur 2). Vi har også levert andre testsubstanser slik som cytokiner og narkotika via denne fremgangsmåten.

Figur 1. Luftveistrykk tracing. Den blå linjen gjenspeiler luftveistrykk og den røde linjen gjenspeiler den tidevolum tracing i musen umiddelbart etter intubering. De negative (nedover) blokkeringer av trykkkurve (svarte piler) indikerer generering av negative intrathoracic trykket i mus (C57BL / 6, 24 g) med spontan respirasjon og viser riktig plassering av endotrakealtuben. Vennligst klikk her for å v IEW en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Luftveisresistens og metakolin dose-respons kurver. Mus (C57BL / 6) intubert ved denne teknikk kan gjennomgå mål på luftveisresistens og bronkial reaktivitet ved hjelp dobling doser av metakolin levert via ultralyd-forstøver. I dette representativt eksempel, har et kontrolldyr en minimal respons på metakolin opp til 25 mg / ml ovalbumin og immunisert og utfordret mus viser hyperreaktivitet til metakolin. Disse målinger er utført med mus intubert med en 20 G kateter og er umulig å skille fra de som er laget i et trakeostomerte mus.

/ Files/ftp_upload/50269/50269fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50269/50269fig3.jpg "/>
Figur 3. Trykk-volumkurve. Dette er et representativt trykk-volum-kurven i en 20 g mus som har blitt intubert med en 20 G venekateter, paralysert med pancuronium, og er mekanisk ventilert. Det viser at kateteret ikke lekker opp til 30 cm H ₂ O trykk og kan derfor brukes til å foreta nøyaktige målinger trykk-volum-forhold i mus.

Figur 4. Ovalbumin modell for allergisk inflammasjon. Dette er en representativ hematoxylin og eosin farget i muselunge som er blitt immunisert og utfordret med ovalbumin. Det demonstrerer generalisert effekt av instillasjon av ovalbumin administreres via direkte laryngoskopi metoden (forstørrelse 4X).

Discussion

I denne rapporten beskriver vi en enkel og pålitelig teknikk for å intubere mus som er nontraumatic og kan brukes flere ganger i samme dyr. Denne teknikken kan oppnås med enkle laboratorium eller medisinsk utstyr som kan kjøpes for en beskjeden sum. Teknikken med direkte laryngoskopi, opprinnelig rapportert av Hastings og kolleger ^{til 4,} kan også brukes for en rekke formål, men først og fremst for å levere nøyaktig teststoffer på det nedre luftveier. Vi har funnet denne teknikken bedre enn de som er rapportert av andre etterforskere til dato på grunn av sin enkle, hastighet, enkelhet, pålitelighet, lav kostnad, og potensialet for gjentatte tiltak.

Teknikker for å intubere mus er ikke ny. En av de tidligste rapportene, brukte transilluminasjon av luftrøret fulgt av oral intubasjon med en 24 G kateter ^fem. Men denne studien og andre ^6,7 gir ikke tilstrekkelig informasjon til å gjenskape technique i vårt laboratorium. Nylig andre etterforskere har brukt denne transilluminasjon teknikken med større suksess ^8,9. Den første detaljerte studier av Brown og kolleger rapporterte en studie der mus, suspendert på en 45 ° bakplate, hadde sine luftrør transilluminated og deres luftrøret intubert muntlig med PE90 rør under direkte visualisering ved hjelp av en fabrikkert laryngoskop blad ^10. Denne teknikken har vist seg vanskelig å gjenskape, og derfor ikke har vært benyttet i stor utstrekning. Flere rapporter beskriver bruk av stive optiske scopes eller fiberoptikk for å forbedre påliteligheten av teknikkene. Vergari og kolleger ^11,12 brukt en rigid arthroscope 1,7 mm i ytre diameter for å visualisere de stemmebåndene og deretter plassert en guidekabel gjennom glottis. Forfatterne rapporterer 100% suksess med denne teknikken at de utføres med spesialisert og kostbart utstyr. Kostnaden for dette kirurgisk utstyr virker prohibitive for utstrakt bruk i mus. Andre teknikker har blitt utviklet ved hjelp av en drifts mikroskop og en 2f guidekabel ^13. Denne teknikken er lik våre, men krever bruk av et operasjonsmikroskop, og dermed vi foretrekker å bruke en otoscope som er vesentlig mindre kostbart.

Fiberoptiske intubasjon teknikker har også blitt rapportert ved bruk av en relativt billig batteridrevet fiberoptiske kilde ^14. Vi har forsøkt å bruke denne fiberoptisk teknikk, men har funnet lyset mindre enn nyttig fordi det ikke finnes noen tilsvarende fiberoptiske visualisering kanal. MacDonald og kolleger brukte en kraftigere halogen lyskilde og rapportert suksess i en liten prøve. De var i stand til å gjentatte ganger måle luftveismotstand ¹⁵ også. Gjentatte målinger av luftveismotstand ved forskjellige tidspunkt har blitt rapportert av andre ^16. Zhao, et al. Brukt en retrograd teknikk ved punktering av luftrøret og fôring en guidekabel gjennom hypo-og orofarynx ^17. Mer nylig Singer, et al. Har utført selektiv intubasjon av den venstre mainstem bronchus hos mus ved hjelp av et operasjonsmikroskop og gjennomlysning for å dokumentere plasseringen av kateteret ^18.. De deretter brukt denne metoden til å innpode forsøksstoffer selektivt inn i lungen. Men denne gang ikke ville være en metode som kunne brukes uten betydelig utgift og høyt teknisk trening. Videre vil gjennomlysning også legge til en strålingsfare for studien.

Oppsummert er direkte laryngoskopi av mus ved hjelp av en pediatrisk otoscope en verdifull teknikk for intubasjon, gjentatte intubasjon og forsøksstoffet levering uten intubasjon. Vi finner denne teknikken overlegen trakeostomi og tidligere rapportert metoder for invasivt utføre endotrakeal intubasjon hos mus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Operating Otoscope Head	Welch Allyn	21700	$188.98
Otoscope Handle	Welch Allyn	71000	$112.20
Reuseable Speculum	Welch Allyn	22002	$3.98
Fine Forceps	Miltex	18-779	$107.18
Small clamp stand to hold otoscope
Isoflurane Vaporizer (multiple circuit with vacuum waste gas handling)	Summit Medical		$3,000
Flexivent (Animal Ventilator)	SCIREQ		$35,000
Intravenous catheter (20 G, 1 in)	BD	381233	$9.62
Polyethylene tubing (PE10) (0.011 in I.D., 0.024 in O.D.) 100 ft	Intramedic, Clay-Adams	427401	$115.70
Ketamine 100 mg/ml (10 ml bottle)	Butler	23061	$10.00
Xylazine (100 ml bottle)	Vedco	24105	$20.00
Isoflurane (250 ml bottle)			$15.00
Vecuronium bromide 10 mg/10 ml	Pfizer	NDC 0069-0094-01	$15.00