Summary
توطين وتوزيع البروتينات توفير معلومات هامة لفهم وظائفها الخلوية. يمكن استخدام دقة فائقة المكاني للالمجهر الإلكتروني (EM) لتحديد توطين التحت خلوية من مستضد معين بعد المناعية. لأنسجة الجهاز العصبي المركزي (CNS)، والحفاظ على السلامة الهيكلية بينما استضداد كان من الصعب الحفاظ على وخاصة في الدراسات EM. هنا، ونحن اعتماد إجراءات التي استخدمت للحفاظ على الهياكل ومولدات المضادات في الجهاز العصبي المركزي لدراسة وتوصيف البروتينات متشابك في قرن آمون الفئران الخلايا العصبية الهرمية CA1.
Protocol
1. تثبيت
مثبتات مسببة للسرطان؛ ارتداء القفازات والتعامل مع مثبتات في غطاء الدخان. ما لم يذكر خلاف ذلك، وتتم جميع حضانات على الجليد، وينبغي أن تتم تصفيته قبل الاستعمال كل الحلول. استخدام الإلكترون المجهري الصف الكواشف.
يوم 1
- بعد الظروف التجريبية (حقن الفيروسية مثل العلاج من تعاطي المخدرات)، ضع الغشاء مع شرائح قرن آمون في عضوي النمط لمدة 60 × 15 مم طبق بتري تحتوي على الجليد البوليسترين الباردة الفوسفات 0.1 M عازلة (عازلة للفوسفات سورنسن)، ودرجة الحموضة 7.3. إضافة 1-2 مل من 0.1 العازلة الفوسفات M مباشرة على أعلى من شرائح للحفاظ على الباردة.
خطوة حاسمة: استخدم دوما طازجة أعدت مخازن ومثبتات. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني للالعازلة هو داخل النطاق المطلوب. ويمكن لعدم القيام بذلك تلف الهياكل الخلوية.
- لعزل الحقل الفرعي CA1 للشريحة، استخدممشرط لقطع القابل للتصرف بلطف عبر شريحة بجوار DG، بالتوازي مع طبقة الخلايا CA1 (الشكل 1). ثم قص شريحة المتبقية عموديا لإزالة الحقل الفرعي CA3 ومرفد و. قطع زاوية من شريحة للمساعدة في تحديد السطح العلوي للنسيج.
ملاحظة: في حالة تسليم أي مطلوب من البروتين الفيروسي من الفائدة، يمكن ان تكون ثابتة في شريحة الأنسجة كامل بعد إزالة وسائل الإعلام مع طيف شطف من الجليد الباردة العازلة. ثم اعقب ذلك عن طريق الاستغناء عن CA1.
خطوة حاسمة: تتبع الجانب العلوي من الأنسجة من أجل باجتزاء السليم للشبكات في وقت لاحق.
- إزالة الأنسجة بعناية من الغشاء باستخدام مساعدات من مشرط. استخدام ماصة باستور لنقل بلطف الأنسجة إلى لوحة تحتوي على 12-جيدا العازلة الفوسفات 0،1 M.
- إزالة المخزن المؤقت في البئر من لوحة وإضافة 500 & Mش؛ L - 1 مل من الجليد الباردة مثبت (الرقم الهيدروجيني 7.3) تتألف مما يلي: 0.1٪ حمض البكريك، بارافورمالدهيد 1٪، وغلوتارالدهيد 2.5٪ في 0.1 العازلة الفوسفات M. احتضان لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: قد يكون حمض البكريك متفجرة عندما تجف. يبقيه مبلل بالماء في حاوية مغلقة بإحكام. تخزينها في مكان جاف وجيد التهوية.
- إزالة مثبت من البئر وغسل العينات 3 مرات (20 دقيقة لكل منهما) في 0.1 العازلة الفوسفات M.
- احتضان لمدة 40 دقيقة في حمض التانيك 1٪ (W / V) في 0.1 العازلة ماليات M، 6.0 درجة الحموضة.
- شطف مرتين (20 دقيقة لكل منهما) في المخزن المؤقت ماليات.
- احتضان لمدة 40 دقيقة في خلات اليورانيل 1٪ (W / V) في المخزن المؤقت ماليات في الظلام. خلات اليورانيل حساسة للضوء وغير المشعة. تغطية الكأس مع Parafilm عندما حل وتخزين أي العازلة المستخدمة في الظلام في C. ° 4
- شطف مرتين (20 دقيقة لكل منهما) في المخزن المؤقت ماليات.
- احتضان لمدة 20 دقيقة في الكلور البلاتين 0.5٪IDE (ث / ت) في المخزن المؤقت ماليات.
- شطف مرتين (20 دقيقة لكل منهما) في المخزن المؤقت ماليات. تخزين العينات في 4 درجات مئوية حتى تكون جاهزة لمزيد من المعالجة.
2. الجفاف وتضمينها
أكسيد البروبيلين هو مسرطنة. تجنب أبخرة من خلال العمل معها في غطاء الدخان. استخدام المطلقة، والإيثانول النقي 100٪ يحتوي على أي أثر للماء. هذا تمييع الإيثانول المطلق لإنتاج تركيزات مختلفة للجفاف.
يوم 2
- احتضان لمدة 5 دقائق في الايثانول 50٪ ثم لمدة 5 دقائق في الايثانول 70٪.
- احتضان لمدة 15 دقيقة في٪ 1 الطازجة ف فينيلين (PPD) في الايثانول 70٪.
- شطف ثلاث مرات في الايثانول 70٪.
- احتضان لمدة 5 دقائق في الايثانول 80٪ ثم لمدة 5 دقائق في الايثانول 95٪.
- احتضان في الإيثانول بنسبة 100٪ مرتين كل 5 دقائق.
- إعداد قوارير الزجاج مع الأغطية الملولبة والتأكد من أنها نظيفة وجافة تماما. نقل قوارير الزجاج إلى شرائح وتسمية كل فيال ببساطة ووضوح.
- احتضان لمدة 5 دقائق في 01:01 الإيثانول: أكسيد البروبيلين.
- احتضان أكسيد البروبيلين في 100٪ مرتين كل 5 دقائق.
- إضافة الراتنج (EPON) إلى كل قارورة لجعل مزيج 1:1 مع أكسيد البروبيلين. المزيج بلطف لمدة 2 ساعة. لا يهز قنينة بدقة جدا لمنع الفقاعات التي يمكن أن تتداخل مع التضمين.
- إضافة الراتنج لجعل خليط مع أكسيد البروبيلين 03:01، ومزيج لمدة 2 ساعة.
- نقل الراتنج إلى 100٪ واحتضان O / N.
اليوم 3
- ساندويتش شرائح عينات من البلاستيك بين ACLAR وعلاج ل24 ساعة عند 60 ° C.
3. باجتزاء وتركيب شبكات على
يوم 4
- قطع شبه رقيقة (0.5 ميكرومتر) وصمة عار مع أقسام 1٪ + البوراكس زرقة الطولويدين 1٪ لتحديد الاتجاه الصحيح من العينات.
- قطع المقاطع سامسونج (60 نانومتر) وجبل على شبكات النيكل، مقطع واحد في الشبكة.
4. المناعية
يجب أن تتم تصفيته جميع مخازن والماء قبل الاستخدام.
اليوم 5
- وضع قطرة (~ 50 ميكرولتر) من العازلة Tween-20/phosphate 1٪ (T / PB)، ودرجة الحموضة 7.5، على قطعة من Parafilm نظيفة على سطح مستو. اختيار ما يصل بلطف الشبكة مع ملقط على حافة نظيفة وتطفو على المخزن المؤقت، القسم الأسفل، واحتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
- استنزاف السائل الزائد من الشبكة عن طريق وضع الجانب القسم حتى على ورقة لتصفية ثم تطفو على جليكاين 50 مم في T / PB لمدة 15 دقيقة في RT.
خطوة حاسمة: لتجنب الإفراط في 'ترحيل' من الحلول من حل قطرة واحدة إلى أخرى خلال حضانات، واستنزاف السائل الزائد عن طريق لمس برفق على حافة الشبكة على الورق 1 # التصفية بين كل تغيير الحل. أيضا إزالة أي حل محاصرين بين أحضان EM ملقط عقد الشبكة من فتل بلطف مع قطعة من ورق الترشيح بين الأسلحة ملقط بينما ل ensuدق أبواب لا تجف تماما.
- تجفيف الشبكة مع ورقة الترشيح ثم تطفو على منع محلول يحتوي على 2.5٪ BSA والمصل 2.5٪ من الحيوانات من الأجسام المضادة الثانوية في T / PB لمدة 30 دقيقة في RT.
- احتضان مع الأجسام المضادة الأولية (في T / PB) في RT أو O / N ° 4 في C. الوقت الأمثل ودرجة حرارة الحضانة، فضلا عن تركيز الأجسام المضادة، يجب أن يتم تحديد تجريبيا.
- غسل الشبكة ثلاث مرات (2 دقيقة لكل منهما) مع T / PB.
- احتضان الضد الثانوية مع (1:20 المضادة للأرنب أو مكافحة الماوس بالإضافة إلى الذهب نانومتر 10) ل1 ساعة في RT.
- يغسل ثلاث مرات (2 دقيقة لكل منهما) مع T / PB.
- POSTFIX مع غلوتارالدهيد 2٪ في T / PB لمدة 5 دقائق.
- يغسل ثلاث مرات (2 دقيقة لكل منهما) مع T / PB ثم ثلاث مرات (2 دقيقة لكل منهما) مع الماء المصفى.
- احتضان مع خلات اليورانيل 2٪ في الماء لمدة 10 دقيقة.
في حين أن الشبكة هو تلطيخ، وإعداد CO 2-مجانا من قبل غرفة placinGA قطعة من Parafilm في وسط طبق بتري الزجاج. ثم ضع 4-6 كريات هيدروكسيد الصوديوم في طبق في جميع أنحاء Parafilm لامتصاص CO 2 في الهواء. الحفاظ على أعلى إغلاق لبضع دقائق. استخدام ماصة باستور ونقل بسرعة حجم صغير من محلول سترات رينولد يؤدي إلى Parafilm في طبق بتري الزجاج. فتح الجزء العلوي يكفي لإدراج ماصة باستور للحد من إعادة إدخال CO 2 في الغرفة.
ملاحظة: لجعل حل رينولد سترات الرصاص، يغلي 100 مل من الماء منزوع الأيونات في فرن ميكروويف والسماح لتبرد في وعاء محكم. في قارورة 50 مل الحجمي بالسدادة، مزيج الرصاص 1،33 ز نترات، 1،76 ز سترات الصوديوم و 30 مل من الماء المغلي عن طريق هز بقوة لمدة 1 دقيقة. ثم يهز بشكل متقطع لمدة 30 دقيقة. لهذا الحل غائم، إضافة 8 مل من 1 M هيدروكسيد الصوديوم وعكس ببطء القارورة عدة مرات. والحل أصبح واضحا. تقديم حل ل50 مل مع وا المغليثالثا. يخزن المحلول مغلقة بإحكام. إذا راسب يظهر، تجاهل وجعل واحدة جديدة.
- في ثلاثة أكواب أصغر إعداد الدافئة، والمياه المغلية الطازجة منزوع الأيونات. يغسل خلات اليورانيل بواسطة غمس الشبكة في الدورق الأول ودوامة برفق لمدة 30 ثانية حول. كرر هذه الخطوة في الأكواب الأخريين.
- فتح الجزء العلوي من الزجاج طبق بتري يكفي لوضع الشبكة في قطرة من محلول سترات رينولد الرصاص. إذا كان ذلك ممكنا، وارتداء قناع أثناء القيام هذا لتجنب التنفس على الرصاص وسترات لمنع تشكيل راسب. احتضان لمدة 10 دقيقة.
- فتح الجزء العلوي يكفي لإزالة الشبكة. تجنب التنفس على سترات الرصاص. غسل الشبكة ثلاث مرات متتالية عن طريق غمس ذلك في ثلاثة أكواب الماء الدافئ مع، المقطر المغلي طازجة. السماح للشبكة الجافة على قطعة من ورق الترشيح، قسم أعلى. العينة هو الآن على استعداد للالمجهر الإلكتروني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الرقم 2B مثالا على توزيع جزيئات نج المحلية في العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية الهرمية CA1 قرن آمون. تمت تغطية شبكات النيكل مع الأنسجة (60 نانومتر) التي تحتوي على سامسونج CA1 منطقة قرن آمون (كما رأينا في الشكل 2A) في 1٪ T / PB، 50 مم جليكاين، ومنعت بعد ذلك مع BSA 2.5٪ و 2.5٪ المصل قبل الحضانة مع المضادة -نج الأجسام المضادة. بعد الغسيل مع T / PB، ثم تمت تغطية شبكات في مكافحة الأرانب الأجسام المضادة الثانوية بالإضافة إلى 10 نانومتر الذهب. وأخيرا، تم غسلها مع شبكات T / PB وpostfixed مع غلوتارالدهيد 2٪ تليها خلات اليورانيل 2٪ وسترات رينولد الرصاص تلطيخ لتعزيز التباين. بقي، micrographs الإلكترون ممثل تظهر نقاط الاشتباك العصبي غير متناظرة. ومما يسهل تحديد المقصورة بعد المشبكي من قبل PSD الإلكترون الكثيفة (السهم الرأس) ومحددة جيدا غشاء البلازما. الحق، كان أقصر مسافة بين كل نغ (السهام) وغشاء البلازما لاrmalized إلى مكان من العمود الفقري. جزيئات نانوغرام في العمود الفقري (ولكن ليس على PSD) يحمل التعريب تفضيلية للغشاء البلازما. نشرت هذه في مجلة الرسم البياني EMBO 8.
الشكل 1. التخطيطي للتشريح المنطقة CA1 من الثقافات شريحة الحصين، وبعد علاج تجريبي للشريحة، على سبيل المثال العلاج من تعاطي المخدرات أو عدوى فيروسية، وضعت الغشاء الذي يحتوي على شريحة عازلة في الفوسفات الجليد الباردة. وقطعت لأول مرة شريحة أفقيا تحت التلفيف المسنن (DG)، بالتوازي مع طبقة الخلايا CA1. تم عزل ثم الحقل الفرعي CA1 عن طريق إزالة الحقل الفرعي CA3 ومرفد و(دون). للمساعدة في تحديد السطح العلوي للCA1، وقطع ركلة ركنية لأنسجة المشرق (في هذه الحالة العلويالحق الزاوية).
الشكل 2. Immunogold وسم neurogranin في نقاط الاشتباك العصبي في CA1 عضوي النمط الثقافات شريحة الحصين. (A) micrographs الإلكترون ناقل الفئران تبين منطقة الحصين CA1 ونقاط الاشتباك العصبي. التشعبات (د) من الخلايا العصبية الهرمية CA1 يمكن تمييزها بسهولة. ومما يسهل تحديد نقاط الاشتباك العصبي بين محطة محور عصبي غير متناظرة 9T) والعمود الفقري شجيري (ق) عن وجود كثافة متشابك بعد (PSD، رأس السهم) ومحددة جيدا غشاء البلازما. (B) توزيع neurogranin (NG) في العمود الفقري شجيري. اليسار، micrographs الإلكترون انتقال تظهر immunogold-EM وسم NG (الأسهم). لالكمي، والمسافة من كل الجسيمات الذهب (باستثناء تلك التي في مديرية الأمن العام، رأس السهم) من البلازما membrانو هو تطبيع (خ المحور) إلى دائرة نصف قطرها من العمود الفقري. وبالتالي، 0 يتوافق مع الجسيمات الكذب على الغشاء و1 إلى جسيم القابعة في وسط العمود الفقري. الحق، يتم إنشاء التوزيع العشوائي (الوردي) باستخدام مولد رقم عشوائي الماكرو (مايكروسوفت اكسل) في العمود الفقري على شكل السطح. نانوغرام (الأزرق) يبين توزيع الذروة أعلى بالقرب من غشاء البلازما. شريط النطاق، 200 نانومتر. نشرت هذه في مجلة الرسم البياني EMBO 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، فقد اعتمدنا أسلوب Phend واينبرغ للدماغ والحبل الشوكي الأنسجة لدراسة العمود الفقري شجيري في قرن آمون شريحة الثقافات الفئران. العمود الفقري شجيري في منطقة قرن آمون CA3-CA1 هي الهياكل الحساسة التي تحتوي على مجموعة واسعة من البروتينات التي تلعب دورا هاما في تنظيم وظائف الخلايا العصبية. طريقة عرض يوفر نهج متوازن لتحقيق استضداد تعزيز الحفاظ التركيبية مع الحفاظ على جيد (الشكل 2A)، والسماح كفاءة معقولة ووضع العلامات استنساخ جيدة مفيدة لوصف توزيع مستضدات معينة داخل العمود الفقري. هنا، وصفت ونحن نج مع 10 نانومتر الذهب الغروية. نحن كميا ثم ذهب لتوليد نمط من وضع العلامات نغ التي ساعدت على فهم دورها في وظيفة متشابك (الشكل 2B) 8.
ويمكن أن يتم التحليل الكمي من immunogold في مجموعة متنوعة من الطرق 11-13 14-17.
استبدال الأزميوم بواسطة TA، UA، وف فينيلين (PPD) في هذا النهج ساهم كثيرا في دعم حساسية الكشف عن مستضد في الأنسجة العصبية بالمقارنة مع الأساليب السابقة 7. استخدام الفورمالدهايد ويضمن الحفاظ غلوتارالدهيد الهيكلية والإبقاء على مستضدات للذوبان صغيرة مثل الأحماض الأمينية. على أساس راتنجات الايبوكسي، بدلا من راتنجات البلاستيك الاكريليك، وتوفير أفضل الاستقرار لتضمين تحت شعاع الالكترون دون المساس استضداد 7. مقارنة لمعيار الأزميوم البروتوكول، Phend وآخرون. </ م> أظهرت أن TA، UA، وPPD تحسنت أيضا الحفاظ الهيكلي (انظر الشكل 1 من الوثيقة الأصلية Phend) 7، ووجد أن البروتينات المناعية فعالة لمتعددة بما في ذلك مادة P، كالسيتونين الببتيد الجينات ذات الصلة (CGRP)، أمبا الوحيدات مستقبلات 1 (GluA1)، وغاما أمينو حمض (GABA) 7. تؤكد هذه النتائج على قدرة هذا الإجراء لدراسة البروتينات في الأنسجة العصبية المختلفة. ميزة أخرى لهذا الأسلوب هو أن TA، UA وPPD هي سهلة التحضير والتعامل معها، وتشكل مخاطر الخطرة أصغر بكثير من الأزميوم، وهو مضطرب للغاية وشديدة السمية عن طريق الإستنشاق وملامسة الجلد.
واحد الحد من هذه الطريقة هو أنه على الرغم من أنه يحفظ ويحتفظ المستضدات صغيرة مثل الأحماض الأمينية، فإنه لا تظهر تحسن immunolabeling لهذه الجزيئات مقارنة مع العلاج الأزميوم التقليدية. والاستفادة من كلوريد البلاتين معدن ثقيل للحفاظ على structure وتعزيز تفاعلية مناعية ويبدو أيضا أن يكون مقصورا على الحبل الشوكي، وذلك لأسباب ليست مفهومة تماما 7. على الرغم من أن طريقة الأزميوم خالية يحسن استضداد وعلى النقيض من الأنسجة، لا يبدو للعمل بشكل جيد للحفاظ على هياكل أخرى مثل حويصلات قبل المشبكي (انظر الشكل 2). وبالإضافة إلى ذلك، قد Phend وآخرون لوحظ أن عدم وجود الأزميوم أسفرت أيضا عن الحفاظ على المايلين مخفض، حيث لديه قابلية اختراق TA محدودة في مكونات داخل الخلايا للحفاظ على الأغشية 7. لهذه الأسباب، قد طرق تجميد لإعداد عينة من الأفضل الحفاظ البدائل إذا التركيبية هو الشاغل الأكثر أهمية. تجميد Ultrarapid من العينة يسمح الحفاظ على الجزيئات بطريقة أكثر طبيعية 18، دون القطع الأثرية المحتملة التي يمكن إدخالها عن طريق استخدام مثبتات كيميائية.
قبل تنفيذ EM، فإن وجودينبغي تأكيد مستضد في العينة من خلال طرق مثل تحليل لطخة غربية. كما هو الحال مع جميع الدراسات immunolabeling، التفسير الصحيح للبيانات يعتمد على استخدام الأجسام المضادة، حسب محددة. وينبغي دائما الاجسام المضادة عالي النقاء يمكن استخدامها إذا كانت متوفرة. تجارب السيطرة ضرورية للتأكد من أن نمط وضع العلامات ولدت ويرجع ذلك إلى التفاعل بين الأجسام المضادة المحددة الابتدائية ومستمنع و. ويمكن اختبار خصوصية وضع العلامات من خلال تنفيذ الضوابط السلبية والإيجابية. على سبيل المثال، في عنصر تحكم السلبية، يمكن الاستعاضة عن الأجسام المضادة الأولية من قبل المصل لا علاقة لها السيطرة غير المناعي مفتش، دون تغيير أي خطوات أخرى في البروتوكول تلطيخ. الثانية، يمكن استخدام البروتين الذي موجود في مقصورة خلية واحدة ولكن ليس في الآخرين كعنصر تحكم إيجابية. على سبيل المثال في نقاط الاشتباك العصبي الجلوتاميرجي، PSD-95 هو علامة بعد المشبكي في حين GAP-43 موجود في المقام الأول في محطة قبل المشبكي 19-22.إذا رأيت العلامات عندما تم حذف الأجسام المضادة الأولية أو في مقصورات حيث يعرف هذا البروتين لا تكون موجودة، ثم وضع العلامات ليست محددة.
مرة واحدة يتم اختبارها بدقة خصوصية الأجسام المضادة الأولية، ينبغي للمرء أن يكون على علم بأن العينات مع وضع العلامات الجيدة يجب أن لا يحمل العديد من التثاقل أو لديك جزيئات الذهب المفرطة في الخلفية حيث لا وجود الأنسجة. إذا كان مقدار الذهب مرتفعة جدا أو منخفضة جدا، ضبط مستوى أو مدة الحجب وتركيز الأجسام المضادة تبعا لذلك. Maunsbach وAfzelius توفير بعض أمثلة ممتازة ونصائح لimmunolabeling 23.
يمكن للحفاظ على هيكلية جيدة من عينات القضاء على الأعمال الفنية التي قد تتداخل مع الصرف ونخلط تفسير البيانات. وبالتالي، فإن الحفاظ متفوقة من الهياكل يتضح من هذا الأسلوب يجعل هذه التقنية المطبقة في عدد من الأنسجة البيولوجية وخصوصا حيث الهياكل الحساسة يمكن أن تكونتشويه بسهولة أو دمرت خلال تجهيز العينات. ومن هنا، بالإضافة إلى شرائح قرن آمون عضوي النمط، وهذه الطريقة يمكن أيضا أن تكون قيمة هائلة لتحضير الخلايا العصبية الأخرى بما في ذلك شرائح الدماغ الحادة والثقافات العصبية الأولية. شرائح قرن آمون قابلة للتعديل بسهولة عضوي النمط إلى العلاج من تعاطي المخدرات والتعبير من البروتينات عن طريق العدوى الفيروسية، والتي يمكن أن تنطبق لدراسة اللدونة متشابك قرن آمون. هذه الطريقة مفيدة أيضا لدراسة آثار الظروف التجريبية المختلفة على توزيع مستضد أو التوطين في خلايا الجسم، التشعبات، أو العمود الفقري شجيري. وعلاوة على ذلك، جزيئات الذهب الغروية مع أحجام 6، 15، 10 أو 25 نانومتر متوفرة، مما يجعل من الممكن لتنفيذ وضع العلامات المتعددة مع عدم وجود التداخل. ونحن نعتقد أن الاستفادة من استضداد تعزيز والمرونة من تحقيقات واستنساخ لوضع العلامات immunogold إثبات قوة هذه التقنية لدراسة مجموعة متنوعة من مولدات المضادات. فمن المحتمل usefuل لتوصيف توطين وتوزيع المستقبلات والبروتينات المستقبلة للتفاعل، نقل، القنوات الأيونية وغيرها الكثير في أنسجة المخ المختلفة بما في ذلك القشرة، المهاد، المخيخ والبصلة الشمية.
وباختصار، فإن البروتوكول من الأزميوم خالية، ووضع العلامات immunogold بعد دمج الثقافات شريحة الحصين الفئران هو أداة قيمة لدراسة مستضدات مختلفة داخل العمود الفقري شجيري. وإمكانية تطبيق هذه الطريقة في أنسجة حساسة العصبي المركزي الأخرى أن تكون مفيدة جدا لدراسة الخصائص التركيبية للجزيئات مختلفة ومفتاح للمساعدة في فهم دورها في الوظائف البيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر فلورنسا ماثيو لإعداد الثقافات شريحة الحصين. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني الأمريكي للشيخوخة وجمعية الزهايمر لNZG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 x 15 mm polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Disposable scalpel | EXELINT | 29552 | |
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| 10 nm Goat-anti-rabbit gold | Electron Microscopy Sciences | 25108 | |
| Anti-Neurogranin antibody | Millipore | AB5620 | |
| 100% Picric acid | Electron Microscopy Sciences | 19550 | |
| 96% Paraformaldehyde | Acros Organics | AC41678-0030 | |
| 25% Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma | G5882 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
| p-Phenylenediamine | Sigma | P6001 | |
| Platinum (IV) chloride | Sigma | 379840 | |
| Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 |
References
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Stirling, J. W. Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques. J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).
- Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).
- Berryman, M. A. Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).
- Akagi, T., et al. Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses. J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).
- Stirling, J. W. Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution. J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).
- Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).
- Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. Embo J. 28, 3027-3039 (2009).
- Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
- Zhong, L., Gerges, N. Z. Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation. PloS one. 7, e41275 (2012).
- Horisberger, M., Vauthey, M. Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin. Histochemistry. 80, 13-18 (1984).
- Bendayan, M. A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology. Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).
- Racz, B., Weinberg, R. J. Spatial organization of coflin in dendritic spines. J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).
- Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections. J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).
- Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5'-nucleotidase in frozen thin sections. Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 Forthcoming.
- Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. [Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency]. Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).
- Kehle, T., Herzog, V. Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation. Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).
- Bozzola, J. R., Lonnie, Ch. 2. Electron Microscopy. 30, Second Edition, Jones and Bartlett Publishers. (1992).
- Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
- Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses. J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).
- Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism. Brain Research. 328, 381-385 (1985).
- Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity. Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).
- Maunsbach, A. A., Bjorn, Ch. 16. Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , Academic Press. 383-426 (1999).
