Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

После вложения Immunogold маркировки синаптические белки в гиппокампе культур Slice

Published: April 3, 2013 doi: 10.3791/50273

Summary

Локализация и распределение белков содержат важную информацию для понимания их клеточных функций. Улучшенные пространственное разрешение электронного микроскопа (ЭМ) может быть использован для определения внутриклеточной локализации данного антигена после иммуногистохимии. Для тканях центральной нервной системы (ЦНС), сохраняя структурную целостность при сохранении антигенности было особенно трудно в EM исследований. Здесь мы принять процедуру, которая используется для сохранения структуры и антигенов в ЦНС изучить и охарактеризовать синаптические белки в CA1 гиппокампа крысы пирамидальных нейронов.

Protocol

1. Фиксация

Фиксаторы являются канцерогенными, перчатках и обращаться с фиксаторами в вытяжном шкафу. Если не указано иное, все сделано инкубации на льду и все решения должны быть отфильтрованы перед использованием. Использование электронной микроскопии класса реагентов.

День 1

  1. После экспериментальных условиях (например, вирусные инъекции, медикаментозное лечение), поместите мембрану с органотипических срезов гиппокампа в 60 х 15 мм полистирола чашке Петри содержащие ледяной 0,1 М фосфатный буфер (фосфатный буфер Соренсена), рН 7,3. Добавить 1 - 2 мл 0,1 М фосфатного буфера непосредственно на кусочки, чтобы держать их холодными.

Важным шагом: Всегда используйте свежеприготовленный буферов и фиксаторов. Убедитесь, что рН буфера находится в пределах желаемого диапазона. Невыполнение этого требования может привести к повреждению клеточных структур.

  1. Чтобы изолировать подполе CA1 среза, используйтеодноразовые скальпеля, чтобы аккуратно разрезать поперек кусочек рядом с DG, параллельно CA1 слой клеток (рис. 1). Затем вырежьте оставшийся кусочек вертикально, чтобы удалить CA3 подполе и подлежащая ткань. Отрежьте угол среза, чтобы помочь определить верхнюю поверхность ткани.

ПРИМЕЧАНИЕ: В случае отсутствия вирусной поставки интересующего белка требуется, весь кусок ткани могут быть установлены после того, как средства массовой информации удаляется с нежной промыть ледяной буфера. Это то следует вырезать CA1.

Важным шагом: следите за верхней ткани для того, чтобы надлежащим секционирования сетей в дальнейшем.

  1. Осторожно выньте ткань из мембранных использованием обратной стороне скальпель. С помощью пипетки Пастера, чтобы мягко передать тканей на 12-луночный планшет, содержащий 0,1 М фосфатного буфера.
  2. Снимите буфер в колодец, из пластины и добавить 500 м иU, L - 1 мл ледяной фиксатором (рН 7,3) состоит из следующих: 0,1% пикриновой кислоты, 1% параформальдегида и 2,5% глутарового альдегида в 0,1 М фосфатного буфера. Выдержите в течение 2 часов при температуре 4 ° C.

ПРИМЕЧАНИЕ: пикриновой кислоты может быть взрывоопасной, когда сухо. Держите его смачивают водой в плотно закрытой таре. Хранить в сухом и хорошо проветриваемом месте.

  1. Снимите фиксатор из колодца и мыть образцы 3 раза (20 мин каждая) в 0,1 М фосфатного буфера.
  2. Инкубировать в течение 40 мин в 1% дубильной кислоты (вес / объем) в 0,1 М малеат буфера, рН 6,0.
  3. Промыть два раза (20 мин каждая) в малеата буфера.
  4. Инкубировать в течение 40 мин в 1% уранилацетата (вес / объем) в малеата буфера в темноте. Уранилацетата чувствителен к свету и является радиоактивным. Накройте стакан с Parafilm при растворении и хранить неиспользованную буфера в темноте при 4 ° C.
  5. Промыть два раза (20 мин каждая) в малеата буфера.
  6. Инкубировать в течение 20 мин в 0,5% платины хлораIDE (вес / объем) в малеата буфера.
  7. Промыть два раза (20 мин каждая) в малеата буфера. Храните образцы при 4 ° С, пока они не готовы для дальнейшей обработки.

2. Обезвоживание и внедрения

Окись пропилена является канцерогенным. Избегайте паров работать с ней в вытяжном шкафу. Используйте абсолютный, 100% чистого этанола, который содержит никаких следов воды. Разбавить это абсолютный этанол для производства различных концентрациях для обезвоживания.

День 2

  1. Выдержите в течение 5 мин в 50% этаноле, а затем в течение 5 мин в 70% этаноле.
  2. Инкубировать в течение 15 мин в свежеприготовленный 1% р-фенилендиамин (PPD) в 70% этаноле.
  3. Промойте три раза в 70% этаноле.
  4. Выдержите в течение 5 мин в 80% этанола, а затем в течение 5 мин в 95% этаноле.
  5. Инкубируйте в 100% этанола в два раза 5 мин.
  6. Подготовить стеклянные флаконы с винтовой крышкой и убедитесь, что они чистые и абсолютно сухими. Передача кусочки стеклянные флаконы имаркировать каждый флакон просто и ясно.
  7. Выдержите в течение 5 мин в смеси 1:1 этанол: оксид пропилена.
  8. Инкубируйте в 100% окиси пропилена в два раза 5 мин.
  9. Добавить смолы (Epon) для каждого флакона, чтобы сделать смесь 1:1 с окисью пропилена. Тщательно перемешать в течение 2 часов. Не трясите флаконах слишком строго, чтобы предотвратить пузыри, которые могут помешать вложения.
  10. Добавить смолой, чтобы сделать смеси 3:1 с окисью пропилена, и перемешивают в течение 2 часов.
  11. Переход на 100% смолы и инкубировать O / N.

День 3

  1. Сэндвич образцов между полосами ACLAR пластика и лечение в течение 24 ч при температуре 60 ° C.

3. Секционирование и монтаж на сетях

День 4

  1. Вырезать полу-тонкие (0,5 мкм) разделов и пятно с 1% толуидиновым синим + 1% буры, чтобы определить правильную ориентацию образцов.
  2. Вырезать ультратонких срезов (60 нм) и установить на никелевой сетки, одна секция в сетку.

4. Иммуногистохимия

Все буферы и воду следует фильтровать перед использованием.

День 5

  1. Место падения (~ 50 мкл) 1% Tween-20/phosphate буфера (T / PB), рН 7,5, на кусок чистой Parafilm на плоской поверхности. Аккуратно поднимите сетку с чистой щипцы по краю и плавать его на буфер, в разделе вниз, и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
  2. Слейте лишнюю жидкость из сетки, создав раздел вверх на фильтровальную бумагу и затем плавают на 50 мМ глицина в T / PB в течение 15 мин при комнатной температуре.

Важный шаг: во избежание чрезмерного "перенос" решений от одного решения капли на следующий течение инкубации, слейте лишнюю жидкость, слегка касаясь края сетки на # 1 фильтровальную бумагу между решением изменений. Кроме того, удалите любое решение в ловушке между руками EM щипцы проведения сетку, аккуратно влагу с кусочек фильтровальной бумаги между руками щипцами в то время как ensuпозвонить в разделах не высыхают полностью.

  1. Высушите сетку с фильтровальной бумагой, а затем плавают на блокирующий раствор, содержащий 2,5% BSA и 2,5% сыворотки от животных вторичных антител в T / PB в течение 30 мин при комнатной температуре.
  2. Инкубируйте с первичными антителами (в т / PB) при комнатной температуре или O / N при 4 ° C. Оптимальное время и температуру инкубации, а также концентрации антител, должны быть определены экспериментально.
  3. Промойте сетку в три раза (2 мин каждая) с T / PB.
  4. Инкубируйте с вторичными антителами (1:20 анти-кролик или анти-мышь соединена с 10 нм золота) в течение 1 часа при комнатной температуре.
  5. Вымойте три раза (2 мин каждая) с T / PB.
  6. Postfix с 2% глутаральдегида в Т / PB в течение 5 мин.
  7. Вымойте три раза (2 мин каждая) с Т / PB, а затем три раза (2 мин каждая) с фильтрованной водой.
  8. Инкубируйте с 2% уранилацетата в воде в течение 10 мин.

В то время как сетка окрашивание, подготовить CO 2-бесплатные камеры placinга кусок Parafilm в центре стеклянное блюдо Петри. Затем поместите 4-6 гранулы NaOH в блюдо вокруг Parafilm поглощать CO 2 в воздухе. Держите верхний закрыта в течение нескольких минут. С помощью пипетки Пастера и быстро передавать небольшие объемы раствора цитрата свинца Рейнольдса в Parafilm в стеклянном блюде Петри. Откройте верхний достаточно вставить пипетки Пастера, чтобы свести к минимуму повторное введение CO 2 в камеру.

ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы ведущий раствора цитрата Рейнольдса, кипятить 100 мл деионизированной воды в микроволновую печь и дайте остыть в герметичном контейнере. В 50 мл мерную колбу с пробкой, смесь 1,33 г нитрата свинца, 1,76 г цитрата натрия и 30 мл кипяченой воды путем встряхивания энергично в течение 1 мин. Затем встряхнуть с перерывами в течение 30 мин. Для этого мутный раствор, добавьте 8 мл 1 М раствором гидроксида натрия и медленно перевернуть колбу несколько раз. Решение станет ясно. Доведите раствор до 50 мл с вареной ватер. Хранить раствор плотно закрытыми. Если появляется осадок, выбросить и сделать новую.

  1. В трех небольших стаканах подготовить теплую, свежекипяченой деионизированной воды. Смыть уранилацетата путем погружения сетки в первый стакан и осторожно закружить вокруг в течение 30 сек. Повторите этот шаг, в других двух стаканах.
  2. Откройте крышку стеклянной посуде Петри достаточно, чтобы поместить сетку на каплю раствора цитрата свинца Рейнольдса. Если это возможно, носить маску, делая это, чтобы избежать вдыхания на цитратом свинца и для предотвращения образования осадка. Инкубировать в течение 10 мин.
  3. Откройте верхний достаточно, чтобы удалить сетку. Избегайте вдыхания на цитратом свинца. Промойте сетку в три раза путем погружения его последовательно в трех стаканах теплой, свежекипяченой дистиллированной воды. Пусть сетка сухая на кусок фильтровальной бумаги, раздел вверх. Образец готов к электронным микроскопом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Рисунок 2B показан пример распределения эндогенных молекул Нг в дендритных шипиков в CA1 пирамидальных нейронов гиппокампа. Никель сетки с ультратонкими (60 нм) тканей, содержащих региона CA1 гиппокампа (как показано на рисунке 2А) были покрыты в 1% T / PB, 50 мМ глицина, то их с 2,5% BSA и 2,5% сыворотки до инкубации с анти Ng-антитело. После промывания T / PB, сетки были затем покрыты анти-кролик вторичные антитела, соединенный с 10 нм золота. Наконец, сетки промывают T / PB и заканчиваются на 2% глутарового альдегида, затем 2% ацетата уранила и цитратом свинца Рейнольдса окрашивания для повышения контраста. Слева, представитель электронного микроскопа показывает асимметричные синапсы. Определение постсинаптической отсека способствует электронно-плотные PSD (стрелки) и четко плазматической мембраны. Право, кратчайшее расстояние между каждым Ng (стрелки) и мембраны плазмы не былоrmalized с радиусом позвоночника. Ng молекул внутри позвоночника (но не в PSD) имеют преимущественную локализацию в плазматической мембране. Эта гистограмма была первоначально опубликована в журнале EMBO 8.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема СА1 рассечение от гиппокампа культур срез. После экспериментального лечения на срезе, например, медикаментозное лечение или вирусная инфекция, мембраной, содержащей срез был сделан в ледяной фосфатный буфер. Срез был сначала разрезать горизонтально под зубчатой ​​извилине (DG), параллельно CA1 слой клеток. CA1 подполе был затем выделяют путем удаления CA3 подполе и подлежащая ткань (суб). Чтобы определить верхнюю поверхность CA1, угол был сокращен ориентироваться ткани (в данном случае верхняяправом углу).

Рисунок 1
Рисунок 2. Immunogold маркировки neurogranin в CA1 синапсов в гиппокампе органотипических культур срез. (A) просвечивающей электронной микроскопии показывает гиппокампа крысы области CA1 и синапсов. Дендриты (г) CA1 пирамидальных нейронов легко различимы. Определение асимметричные синапсы между аксональной терминала 9Т) и дендритных шипиков (ы) способствует наличие постсинаптической плотности (PSD, стрелки) и четко плазматической мембраны. (B) Распределение neurogranin (Ng) в дендритных шипиков. Слева, передача электронного микроскопа показывает immunogold-EM маркировка NG (стрелки). Для количественного определения, расстояние от каждой частицы золота (за исключением тех, в PSD, стрелки) из плазмы membrАНХ является нормализация (ось х) с радиусом позвоночника. Таким образом, 0 соответствует частице лежал на мембране и от 1 до частиц, лежащих в центре позвоночника. Право, случайное распределение (розовый) создается с помощью генератора случайных чисел макро (Microsoft Excel) в позвоночнике форме поверхность. Ng (синий) показывает самый высокий пик распределения близка к плазменной мембране. Шкала бар, 200 нм. Эта гистограмма была первоначально опубликована в журнале EMBO 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом протоколе, мы приняли Phend и Вайнберга метод головного и спинного ткани шнур для изучения дендритных шипиков в гиппокампа крысы культур срез. Дендритных шипиков в гиппокампе СА3-СА1 тонкие структуры, содержащие огромное разнообразие белков, которые играют важную роль в регуляции функций нейронов. Представленный метод обеспечивает сбалансированный подход для обеспечения более антигенности при сохранении хорошей сохранности ультраструктурным (рис. 2A), что позволяет разумные эффективность маркировки и хорошую воспроизводимость полезной для характеризующие распределение антигенов в позвоночнике. Здесь мы обозначили Ng с 10 нм коллоидного золота. Затем мы количественно золота для создания маркировки картина Ng, которая помогла понять его роль в синаптическую функцию (рис. 2В) 8.

Количественный анализ immunogold может быть сделано разными способами 11-13 14-17.

Замена осмия Т.А., UA, а п-фенилендиамин (PPD) в этом подходе значительно повысить чувствительность выявления антигена в нейронной ткани по сравнению с предыдущими методами 7. Использование формальдегида и глутарового альдегида обеспечивает структурную сохранение и удержание небольших растворимые антигены, такие как аминокислоты. Эпоксидные смолы на основе, а не акриловой пластмассы смолы, обеспечивают лучшую стабильность для встраивания под электронным пучком без ущерба для антигенности 7. По сравнению со стандартным протоколом осмий, Phend и соавт. </ EM> показали, что TA, UA, и PPD также улучшились структурные сохранения (см. Рисунок 1 из оригинальной работе Phend) 7, и эффективная иммуноокрашивания было найдено несколько белков, включая вещество Р, связанный с геном кальцитонина пептид (CGRP), АМРА субъединица 1 (GluA1), и гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) 7. Эти результаты демонстрируют возможности этой процедуры для изучения различных белков в нейронной ткани. Еще одним преимуществом этого метода является то, что Т.А., UA и PPD легки в приготовлении и использовании, и создают гораздо меньше опасных рисков, чем осмий, которая является крайне нестабильной и очень токсичен при вдыхании и попадании на кожу.

Одним из ограничений этого метода является то, что, хотя он сохраняет и удерживает небольшую антигены, такие как аминокислоты, он не показывает улучшить иммунного для этих молекул по сравнению с обычным лечением осмия. Преимущество тяжелой хлоридов платиновых металлов сохранить STRUcture и повышения иммунореактивности также, кажется, ограничивается спинного мозга, по причинам, которые не совсем понятны 7. Несмотря на то, осмий-свободный метод улучшает антигенности и тканей Напротив, он, кажется, не работают хорошо для сохранения других структур, таких как пресинаптические везикулы (см. Рисунок 2). Кроме того, Phend и соавт. Заметил, что отсутствие осмия также привело к снижению миелина сохранение, как TA имеет ограниченную проницаемость в внутриклеточных компонентов сохранения мембраны 7. По этим причинам, замораживание методы подготовки образцов может быть лучше альтернативы, если ультраструктурным сохранения является наиболее важной проблемой. Сверхбыстрая заморозка образцов позволяет сохранить молекул в более естественным способом 18, без потенциальных артефактов, которые могут быть введены с использованием химических фиксаторов.

Перед выполнением EM, наличиеантигена в образце должна быть подтверждена путем способы, такие как Вестерн-блоттинга. Как и все иммунного исследования, правильной интерпретации данных основывается на использовании соответствующих, специфические антитела. Высоко очищенные моноклональные антитела, всегда следует использовать, если доступно. Контрольные эксперименты необходимы для того, чтобы маркировка шаблона генерируемых за счет специфического взаимодействия между первичным антителом и иммуногена. Специфика маркировки может быть проверена путем проведения отрицательного и положительного контроля. Например, в качестве отрицательного контроля, первичные антитела могут быть заменены на не связанные сыворотки контроля не иммунной IgG, без изменения каких-либо других шагов в окрашивании протокол. Во-вторых, белок, который присутствует в одной ячейке отсеке, а в других могут быть использованы в качестве положительного контроля. Например, в глутаматергической синапсов, PSD-95 является постсинаптические маркер в то время как GAP-43 в основном присутствует в пресинаптических окончаний 19-22.Если маркировка видна, когда первичные антитела опущен или в помещениях, где белок известен не присутствовать, то маркировка не является специфичным.

После того, специфика первичного антитела тщательно проверяется, следует иметь в виду, что образцы с хорошей маркировка не должна проявлять многие слипания или имеют чрезмерное частиц золота в фоновом режиме, где нет ткани присутствует. Если количество золота, это слишком высоко или слишком низко, регулировать уровень и продолжительность блокировки и концентрация антител соответственно. Maunsbach и Afzelius обеспечивают несколько прекрасных примеров и советов для иммунного 23.

Хорошо структурных сохранение образцов может устранить артефакты, которые могут помешать морфологии и посрамить интерпретации данных. Таким образом, превосходную сохранность структуры иллюстрирует этот метод делает этот метод применяется к ряду биологических тканей, особенно там, где тонкие структуры могут бытьлегко искажены или разрушены во время обработки образцов. Таким образом, в дополнение к органотипических срезов гиппокампа, этот метод также может быть чрезвычайно ценным для других нейронов препаратов в том числе острых кусочков мозга и первичных нейронов культур. Органотипической срезов гиппокампа легко исправимый для лечения наркомании и экспрессию белков через вирусная инфекция, которая может быть применима для изучения гиппокампа синаптической пластичности. Этот метод также полезно изучить влияние различных условий эксперимента по распределению антигена или локализации в клетке тела, дендритов, или дендритных шипиков. Кроме того, частицы коллоидного золота с размерами 6, 10, 15 или 25 нм доступны, что позволяет выполнять несколько маркировка без перекрытия. Мы считаем, что преимущества повышенной антигенности, гибкость зондов и воспроизводимость маркировки immunogold продемонстрировать мощь этого метода для изучения различных антигенов. Это потенциально usefuл охарактеризовать локализацию и распределение рецепторов, рецепторов взаимодействующих белков, транспортер, ионных каналов и многие другие в различных тканях мозга, включая кору, таламус, мозжечок и обонятельные луковицы.

В общем, настоящий Протокол осмия-бесплатно, после вложения immunogold маркировки гиппокампа крысы культур срез является ценным инструментом для изучения различных антигенов в дендритных шипиков. Потенциальные возможности применения этого метода в других деликатных центральной нервной ткани будет очень полезно изучить ультраструктурные характеристики различных ключевых молекул, и, чтобы помочь понять их роль в биологических функций.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Мэтью Флоренцию для подготовки гиппокампе культур срез. Эта работа была поддержана грантами от американского Национального института по проблемам старения и Ассоциации Альцгеймера NZG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 x 15 mm polystyrene Petri dish Falcon 351007
Disposable scalpel EXELINT 29552
Cell culture inserts Millipore PICM03050
10 nm Goat-anti-rabbit gold Electron Microscopy Sciences 25108
Anti-Neurogranin antibody Millipore AB5620
100% Picric acid Electron Microscopy Sciences 19550
96% Paraformaldehyde Acros Organics AC41678-0030
25% Glutaraldehyde (EM grade) Sigma G5882
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 22400
p-Phenylenediamine Sigma P6001
Platinum (IV) chloride Sigma 379840
Tannic acid Electron Microscopy Sciences 21710

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  2. Stirling, J. W. Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques. J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).
  3. Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).
  4. Berryman, M. A. Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).
  5. Akagi, T., et al. Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses. J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).
  6. Stirling, J. W. Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution. J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).
  7. Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).
  8. Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. Embo J. 28, 3027-3039 (2009).
  9. Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
  10. Zhong, L., Gerges, N. Z. Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation. PloS one. 7, e41275 (2012).
  11. Horisberger, M., Vauthey, M. Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin. Histochemistry. 80, 13-18 (1984).
  12. Bendayan, M. A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology. Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).
  13. Racz, B., Weinberg, R. J. Spatial organization of coflin in dendritic spines. J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).
  14. Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections. J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).
  15. Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5'-nucleotidase in frozen thin sections. Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 Forthcoming.
  16. Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. [Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency]. Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).
  17. Kehle, T., Herzog, V. Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation. Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).
  18. Bozzola, J. R., Lonnie, Ch. 2. Electron Microscopy. 30, Second Edition, Jones and Bartlett Publishers. (1992).
  19. Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
  20. Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses. J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).
  21. Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism. Brain Research. 328, 381-385 (1985).
  22. Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity. Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).
  23. Maunsbach, A. A., Bjorn, Ch. 16. Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , Academic Press. 383-426 (1999).

Tags

Neuroscience выпуск 74 иммунологии нейробиологии биохимии молекулярной биологии клеточной биологии генетики белки иммуногистохимии иммунологических синапсов синапсы гиппокамп микроскопия Electron пластичность нейронов пластичность нервной системы органотипической культур гиппокамп электронной микроскопии после вложения immunogold маркировки фиксации культура клеток изображений
После вложения Immunogold маркировки синаптические белки в гиппокампе культур Slice
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhong, L., Brown, J. C., Wells, C.,More

Zhong, L., Brown, J. C., Wells, C., Gerges, N. Z. Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures. J. Vis. Exp. (74), e50273, doi:10.3791/50273 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter