Summary
הלוקליזציה וההפצה של חלבונים מספקים מידע חשוב להבנת הפונקציות הסלולריות שלהם. הרזולוציה מרחבית המעולה של מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) ניתן להשתמש כדי לקבוע את לוקליזציה subcellular של אימונוהיסטוכימיה ניתנה בעקבות אנטיגן. לרקמות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), שמירה על שלמות מבנית תוך שמירת antigenicity כבר קשה במיוחד במחקרי EM. כאן, אנו לאמץ נוהל אשר כבר משמש לשימור מבנים ואנטיגנים של מערכת העצבים המרכזיים ללימוד ואפיון חלבונים סינפטיים בCA1 נוירונים ביפוקמפוס עכברוש פירמידה.
Abstract
מיקרוסקופיה Immunoelectron היא כלי רב עצמה כדי לחקור מולקולות ביולוגיות ברמת subcellular. נוגדנים מצמידים את סמני אלקטרונים צפופים כגון זהב colloidal יכולים לחשוף את הלוקליזציה וההפצה של אנטיגנים ספציפיים ברקמות שונות 1. שתי הטכניקות הנפוצות ביותר הן-הטבעה של לפני או אחרי הטבעת טכניקות. במיקרוסקופיה טכניקות הטבעה מראש immunogold אלקטרונים (EM), הרקמה יש permeabilized כדי לאפשר חדיר נוגדן לפני שהוא משובץ. טכניקות אלה הן אידיאליות לשימור מבנים, אך חדירה נמוכה של הנוגדנים (לעתים קרובות רק כמה מיקרומטרים 1) היא חסרון ניכר 2. שיטות התיוג לאחר ההטבעה יכולות להימנע מבעיה זו, כי התיוג מתרחש בחלקים של רקמות קבועות בי אנטיגנים הם יותר נגישה בקלות. במהלך השנים מספר השינויים שפרו את השיטות שלאחר ההטבעה כדי לשפר immunoreactivity ולשמר ultrastructure קיבעון רקמה הוא חלק חיוני של לימודיהם. Fixatives כימי Crosslink מקרומולקולות לנעול את מבני רקמות במקום. הבחירה מקבעת משפיעה לא רק על שימור מבנים, אלא גם antigenicity וניגוד. tetroxide אוסמיום (אוסו 4), פורמלדהיד, וglutaraldehyde כבר את fixatives הרגיל במשך עשרות שנים, כוללים למערכת עצבים מרכזיות (CNS) רקמות הנוטות במיוחד לניזק מבני במהלך עיבוד כימי ופיזי. למרבה הצער, אוסו 4 הוא מאוד תגובתי והוכח כדי להסוות אנטיגנים 6, וכתוצאה מהתיוג גרוע ובלתי מספק. גישות חלופיות כדי למנוע קיבוע כימי כוללות הקפאת הרקמות. אבל טכניקות אלה הן קשות לביצוע ודורש מכשור יקר. כדי לענות על חלק מהבעיות הללו ולשפר את תיוג רקמות מערכת עצבים מרכזיים, Phend et al. החליף Oso 4 עם תצטט uranyl (UA) וACI טאניד (ת"א), והציג שינויים נוספים בהצלחה כדי לשפר את הרגישות של זיהוי אנטיגן ושימור מבנים במוח וברקמות בעמוד שדרת 7. אנחנו אמצנו שיטת אוסמיום זה ללא לאחר ההטבעה לרקמת מוח חולדה ואופטימיזציה טכניקת התיוג immunogold לזהות וללמוד חלבונים סינפטיים. אנו מציגים כאן שיטה כדי לקבוע את הלוקליזציה של חלבונים סינפטיים ultrastructural בCA1 נוירונים ביפוקמפוס עכברוש פירמידה. אנו משתמשים בפרוסות תרבית היפוקמפוס organotypic. פרוסות אלה לשמור מעגלי trisynaptic של ההיפוקמפוס, ולכן הם יעילים במיוחד לחקירת פלסטיות הסינפטית, מנגנון מקובל לראות בבסיס למידה וזיכרון. פרוסות ביפוקמפוס Organotypic מיום 5 ו 6 גורים לאחר לידת עכבר / עכברוש יכולות להיות מוכנות כפי שתואר לעיל 8, ושימושיים במיוחד לחריפות מציאה או חלבונים אקסוגניים overexpress. יש לנו להשתמש בפרוטוקול זה בעבר לפרקaracterize neurogranin (נג), חלבון נוירון ספציפי עם תפקיד קריטי בויסות תפקוד הסינפטי 8,9. יש לנו גם השתמשנו בו כדי לאפיין את הלוקליזציה של ultrastructural calmodulin (רמ"א) וCa 2 + חלבון / CAM תלוי קינאז השני (CaMKII) 10. כפי שמודגם בתוצאות, פרוטוקול זה מאפשר שימור ultrastructural טוב של קוצים הדנדריטים ותיוג יעיל של נג לעזור לאפיין ההפצה שלה בעמוד השדרה של 8. יתר על כן, התהליך המתואר כאן יכול להיות תחולה רחבה בחקר חלבונים רבים אחרים שהיו מעורבים בפונקציות עצביות.
Protocol
1. קבעון
Fixatives הם מסרטנים; ללבוש כפפות ולטפל בfixatives במנדף. אלא אם צוין אחרת, כל incubations נעשה על קרח ואת כל הפתרונים צריכים להיות מסוננים לפני השימוש. השתמש ריאגנטים אלקטרונים מיקרוסקופים בדרגה.
יום 1
- אחרי תנאי ניסוי (למשל הזרקה נגיפית, טיפול תרופתי), הצב את הקרום עם פרוסות ביפוקמפוס organotypic ב60 x 15 מ"מ צלחת פטרי קלקר המכילה 0.1 מ 'פוספט חיץ קר כקרח (חיץ פוספט של סורנסן), 7.3 pH. הוסף 1-2 מ"ל של חיץ פוספט 0.1 מ 'ישירות על גבי הפרוסות כדי לשמור אותם קר.
שלב קריטי: השתמש תמיד במאגרים טריים וfixatives. ודא pH של המאגר נמצא בטווח רצוי. כישלון לעשות זאת יכול לגרום ניזק למבנים תאיים.
- כדי לבודד את תת שדה CA1 של הפרוסה, השתמשאזמל חד פעמי בעדינות לחצות את הפרוסה הבאה לDG, במקביל לשכבת CA1 התא (איור 1). לאחר מכן לחתוך את הפרוסה אנכית שנותרה כדי להסיר CA3 subfield וsubiculum. חותך פינה של הפרוסה כדי לזהות את המשטח העליון של הרקמה.
הערה: במקרה שאין אספקה ויראלי של חלבון של עניין נדרשה, פרוסת הרקמה השלמה יכולה להיות קבועה אחרי התקשורת מוסרת עם שטיפה עדינה של חיץ קר כקרח. אז זה אחריו לחתוך את CA1.
שלב קריטי: עקוב אחר בצד העליון של הרקמה על מנת שחתך נכון של הרשתות בשלב מאוחר יותר.
- מוציא בזהירות את הרקמה מהקרום באמצעות הישבן של האזמל. השתמש פיפטה פסטר עדינות להעביר את הרקמות לצלחת המכילה גם 12-חיץ פוספט M 0.1.
- הסר את החיץ בבאר מהצלחת ולהוסיף 500 & Mu; l - 1 המ"ל של מקבע קר כקרח (pH 7.3) מורכבים מהפעולות הבאות: 0.1% חומצת picric, 1% paraformaldehyde, ו -2.5% בglutaraldehyde חיץ פוספט 0.1 מ '. דגירה עבור 2 שעות ב 4 ° C.
הערה: חומצת Picric עשויה להיות נפיצה כשהיא יבש. שמור את זה הורטב במים במכל הסגור היטב. אחסן במקום יבש ומאוורר היטב.
- הסר את המקבע מהבאר ולשטוף דגימות 3 פעמים (20 דקות כל אחד) בחיץ פוספט 0.1 מ '.
- דגירה במשך 40 דקות בחומצה טאנית% 1 (w / v) במאגר 0.1 מ 'maleate, 6.0 pH.
- שטוף פעמים (20 דקות כל אחד) בחיץ maleate.
- דגירה במשך 40 דקות ב1% יצטטו uranyl (w / v) במאגר maleate בחושך. תצטט Uranyl הוא רגיש לאור והוא רדיואקטיבי. לכסות את הכוס בParafilm כשההמסה ולאחסן את כל מאגר שאינו בשימוש בחושך ב 4 ° C.
- שטוף פעמים (20 דקות כל אחד) בחיץ maleate.
- דגירה במשך 20 דקות ב0.5% chlor פלטינהIDE (w / v) במאגר maleate.
- שטוף פעמים (20 דקות כל אחד) בחיץ maleate. אחסן את הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לעיבוד נוסף.
2. התייבשות והטבעה
פרופילן אוקסיד הוא מסרטן. הימנע מאדים על ידי עבודה עימו במנדף. השתמש 100% אתנול מוחלט, טהור, שאין בי עקבות של מים. למהול אתנול מוחלט זה כדי לייצר ריכוזים שונים להתייבשות.
יום 2
- דגירה במשך 5 דקות באתנול 50% ולאחר מכן במשך 5 דקות באתנול 70%.
- דגירה במשך 15 דקות בp-phenylenediamine% מוכנים טרי 1 (PPD) באתנול 70%.
- יש לשטוף שלוש פעמים באתנול 70%.
- דגירה במשך 5 דקות באתנול 80% ולאחר מכן במשך 5 דקות באתנול 95%.
- הדגירה באתנול 100% כפולים 5 דקות כל אחד.
- הכן בקבוקוני זכוכית עם פקקי בורג ולוודא שהם נקיים ויבשים לחלוטין. העברת פרוסות לבקבוקוני זכוכית ולתייג כל בקבוקון צורה פשוטה וברור.
- דגירה במשך 5 דקות ב01:01 אתנול: פרופילן אוקסיד.
- דגירה ב100% פרופילן אוקסיד פעמים 5 דקות כל אחד.
- הוסף שרף (EPON) לכל בקבוקון לעשות תערובת ביחס 1:1 עם פרופילן אוקסיד. לערבב בעדינות ל2 שעות. אל תנענע את הבקבוקונים מדי בקפדנות כדי למנוע בועות שעלולים להפריע להטבעה.
- הוסף שרף לעשות תערובת 03:01 עם פרופילן אוקסיד, ותערובת ל2 שעות.
- העברה לשרף 100% ולדגור O / נ
יום 3
- דגימות סנדוויץ' בין רצועות הפלסטיק ותרופה ל24 שעות ACLAR ב 60 ° C.
3. תבתר והרכבה ברשתות
יום 4
- לחתוך (0.5 מיקרומטר) חלקי חצי דק וכתם% toluidine כחול 1 + 1% בורקס לקבוע את הכיוון הנכון של דגימות.
- לחתוך קטעי Ultrathin (60 ננומטר) ולהרכיב על רשתות ניקל, בסעיף 1 לרשת.
4. אימונוהיסטוכימיה
כל המאגרים והמים צריכים להיות מסוננים לפני השימוש.
יום 5
- הנח טיפה (~ 50 μl) של 1% חיץ Tween-20/phosphate (ט / PB), 7.5 PH, על פיסת Parafilm הנקי על משטח שטוח. לוקחים בעדינות את הרשת עם מלקחיים נקיים על השפה ושתצוף על החיץ, סעיף למטה, ודגירה במשך 10 דקות ב RT.
- מסנן את נוזלי עודפים מהרשת על ידי הצבת צד סעיף על נייר כדי לסנן ולאחר מכן תצוף על 50 mM גליצין בT / PB במשך 15 דקות בRT.
שלב קריטי: כדי למנוע מוגזם "לסחוב על 'של פתרונות מאגל פתרון אחד למשנו במהלך incubations, ניקוז נוזל עודף על ידי נגיעה בקצה של הרשת בעדינות על נייר # 1 מסנן בין כל שינוי פתרון. גם להסיר כל פתרון לכוד בין זרועותיו של א"מ מלקחיים מחזיק רשת על ידי פתילה בעדינות עם פיסת נייר מסנן בין זרועות מלקחיים תוך ensuתצלצל הסעיפים לא יתייבשו לחלוטין.
- ייבש את הרשת עם נייר סינון ולאחר מכן צף על חסימת תמיסה המכילה BSA 2.5% ו -2.5% בסרום מהחיה של הנוגדן המשני בT / PB למשך 30 דקות ב RT.
- דגירה עם נוגדן ראשוני (בT / PB) בRT או O / N ב 4 ° C. הזמן אופטימלי והטמפרטורה של דגירה, כמו גם ריכוז נוגדנים, צריכים להיות נחושים בניסוי.
- לשטוף את הרשת שלוש פעמים (2 דקות כל אחד) עם T / PB.
- דגירה עם נוגדנים משני (01:20 נגד ארנב או אנטי עכבר מצמיד זהב ננומטר 10) לשעה 1 בRT.
- לשטוף שלוש פעמים (2 דקות כל אחד) עם T / PB.
- Postfix עם glutaraldehyde 2% בT / PB למשך 5 דקות.
- לשטוף שלוש פעמים (2 דקות כל אחד) עם T / PB ולאחר מכן שלוש פעמים (2 דקות כל אחד) במים מסוננים.
- דגירה עם 2% יצטט uranyl במים למשך 10 דקות.
בעוד הרשת נצבעת, להכין קאמרי CO 2-בחינם על ידי placinחתיכת ga של Parafilm במרכז צלחת פטרי זכוכית. לאחר מכן הנח 4-6 כדורים של NaOH במטבח סביב Parafilm לספוג CO 2 באוויר. שמור העליון נסגר לכמה דקות. השתמש פיפטה פסטר ולהעביר נפח קטן של תמיסת ציטרט להוביל של Reynold לParafilm בצלחת פטרי הזכוכית במהירות. פתח את הראש מספיק כדי להכניס את פיפטה פסטר למזער מחדש המבוא של CO 2 לבית הבליעה.
הערה: כדי להפוך את פתרון ציטראט להוביל של Reynold, להרתיח 100 מיליליטר מי deionized במיקרוגל ולתת מגניבים במכל אטום. בבקבוק נפח 50 מ"ל עם פקק, חנק להוביל תמהיל 1.33 גרם, 1.76 ציטראט גרם נתרן ו30 מ"ל של המים רתוחים בניעור נמרץ לדקות 1. ואז ללחוץ לסירוגין למשך 30 דקות. לפתרון עכור זה, להוסיף 8 מ"ל של הידרוקסיד 1 ז נתרן ולהפוך לאט את הבקבוק כמה פעמים. הפתרון יהיה ברור. תביא הפתרון ל50 מ"ל עם wa המבושלter. אחסן את הפתרון האטום בחוזקה. אם מופיע משקע, לבטל ולעשות אחת חדשה.
- בשלוש כוסות קטנות יותר להכין מים חמים, טרי מבושלים deionized. לשטוף תצטט uranyl על ידי טבילת רשת בכוס הראשונה ועדינות מערבלים קצת למשך 30 שניות. חזור על שלב זה בשתי כוסות האחרות.
- פתח את החלק העליון של צלחת פטרי הזכוכית רק מספיק כדי למקם את הרשת על הירידה של פתרון ציטראט להוביל של Reynold. במידת ההאפשר, ללבוש מסכה כשעושה את זה, כדי למנוע נשימה על ציטראט עופרת ולמנוע היווצרות של משקע. דגירה למשך 10 דקות.
- פתח את הראש מספיק כדי להסיר את הרשת. הימנע נושם בציטראט העופרת. לשטוף את הרשת שלוש פעמים על ידי טבילתו ברצף בשלוש כוסות עם מים חמים, טרי מבושלים מזוקקים. בואו הרשת יבשה על פיסת נייר סינון, סעיף למעלה. המדגם מוכן כעת למיקרוסקופ האלקטרונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התרשים 2B מראה דוגמה של ההפצה של מולקולות נג אנדוגניים בקוצים הדנדריטים של נוירונים CA1 פירמידליים היפוקמפוס. רשתות עם ניקל (60 ננומטר) המכילות רקמות Ultrathin CA1 אזור של ההיפוקמפוס (כפי שניתן לראות באיור 2 א) היו מכוסות ב1% T / PB, 50 mM גליצין, אז חסמה עם BSA 2.5% ו -2.5% בסרום לפני הדגירה עם אנטי נג-נוגדן. לאחר שטיפה עם T / PB, רשתות היו אז מכוסות בנוגדנים משניים נגד הארנב מצמידים זהב ננומטר 10. לבסוף, רשתות נשטפו עם T / PB וpostfixed עם glutaraldehyde 2% ואחרי 2% יצטט uranyl וציטרט הראשי של Reynold ההכתמה כדי לשפר את הניגודיות. Left micrographs, נציג האלקטרונים מראים סינפסות סימטריות. זיהוי של תא postsynaptic הוא בנחייתם של PSD אלקטרונים הצפופים (ראש החץ) וקרום פלזמה מוגדר היטב. ימין, המרחק הקצר ביותר בין כל נג (חיצים) וקרום הפלזמה לא היהrmalized לרדיוס של עמוד השדרה. מולקולות נג בתוך עמוד השדרה (אך לא בPSD) תערוכת לוקליזציה מועדפת לממברנת הפלזמה. היסטוגרמה זה פורסם במקור בEMBO Journal 8.
איור 1. סכמטי של נתיחת האזור CA1 מהתרבויות הפרוסות ביפוקמפוס. לאחר טיפול ניסיוני לפרוסת הטיפול, למשל תרופה או זיהום ויראלי, הקרום המכיל פרוסה הונח בחיץ פוספט קר כקרח. הפרוסה נחתכה 1 אופקי מתחת לרכס המשונן (DG), המקביל לשכבת תאי CA1. CA1 subfield היה אז בודד על ידי הסרת CA3 subfield וsubiculum (משנה). כדי לזהות את המשטח העליון של CA1, פינה נחתכה כדי למקם את הרקמה (במקרה זה העליוןפינה ימנית).
איור 2. תיוג Immunogold של neurogranin בCA1 הסינפסות בתרבויות פרוסות ביפוקמפוס organotypic. () Micrographs אלקטרוני ההילוכים מראה אזור חולדת היפוקמפוס CA1 וסינפסות. דנדריטים (ד) של CA1 נוירונים פירמידה הם להבחין בקלות. זיהוי של סינפסות הסימטרית בין מסוף axonal 9t) וקוצים הדנדריטים (הים) הוא הקל על ידי הנוכחות של צפיפות פוסט סינפטי (PSD, ראש החץ) וקרום פלזמה מוגדר היטב. (ב) התפלגות neurogranin (נג) בקוצים הדנדריטים. שמאל, micrographs שידור אלקטרונים מראה immunogold-EM תיוג של NG (חיצים). לכימות, המרחק של כל חלקיק זהב (למעט אלה בPSD, ראש חץ) מהפלזמה membrane הוא לנרמל (ציר X) לרדיוס של עמוד השדרה. לפיכך, 0 מתאימים לחלקיק שוכב על הקרום ו1 עד חלקיק שוכב במרכזו של עמוד השדרה. ימני, התפלגות אקראית (ורוד) שנוצרה על ידי השימוש במספר מחולל מאקרו אקראי (Microsoft Excel) בעמוד שדרה בצורה פני שטח. נג (כחול) מראה את התפלגות הפסגה הגבוהה ביותר בסמוך לממברנת הפלזמה. סרגל קנה מידה, 200 ננומטר. היסטוגרמה זה פורסם במקור בEMBO Journal 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מאמצים את שיטת Phend ויינברג למוח ורקמות בעמוד שדרה כדי ללמוד קוצים הדנדריטים בתרבויות פרוסות ביפוקמפוס חולדה. קוצים הדנדריטים באזור היפוקמפוס CA3-CA1 הם מבנים עדינים המכילים מגוון עצום של חלבונים שממלאים תפקידים חשובים בויסות תפקודים עצביים. השיטה הוצגה מספקת גישה מאוזנת להשגת antigenicity המשופר, תוך שמירה על שימור ultrastructural טוב (איור 2 א), ומאפשר יעילות תיוג סבירה ושחזור שימושי לאפיון ההפצה של אנטיגנים ספציפיים בתוך עמוד השדרה טוב. הנה, אנחנו מתויגים נג עם 10 ננומטר זהב colloidal. לאחר מכן, אנו לכמת את הזהב כדי לייצר דפוס תיוג של נג שעזר להבין את תפקידיו בתפקוד סינפטי (האיור 2B) 8.
ניתוח כמותי של immunogold ניתן לעשות זאת במגוון הדרכים 11-13 14-17.
ההחלפה של אוסמיום בת"א, UA, וp-phenylenediamine (PPD) בגישה זו משפרת את הרגישות של זיהוי אנטיגן ברקמות עצביות בהשוואה לשיטות קודמות 7. השימוש בפורמלדהיד וglutaraldehyde מבטיח שימור ושמירה מבני של אנטיגנים מסיסים קטנים כגון חומצות אמינו. רפי אפוקסי מבוססים, ולא שרפי פלסטיק אקריליק, לספק יציבות טובה יותר להטבעה תחת אלומת האלקטרונים מבלי להתפשר על 7 antigenicity. בהשוואה לרמת אוסמיום פרוטוקול, Phend et al. </ Em> הראה שת"א, UA, וגם שפרו PPD שימור מבני (ראה איור 1 של נייר Phend המקורי) 7, ושנמצא היעיל immunostaining לחלבונים רבים הכוללים חומר P, פפטיד גן הקשור לקלציטונין (CGRP), מקטע הקולטן AMPA 1 (GluA1), וגמא-aminobutyric חומצה (GABA) 7. ממצאים אלה מעידים על יכולתו של הליך זה ללמוד חלבונים שונים ברקמות עצביות. יתרון נוסף של שיטה זו הוא שת"א, UA וPPD הם קלים להכנה ולטפל בו, ומהווה סיכון מסוכן הרבה יותר קטן מאשר אוסמיום, וזה מאוד תנודתי ומאוד רעיל בשאיפה ומגע עם עור.
מגבלה אחת של שיטה זו היא שלמרות שהיא שומרת ושומרת אנטיגנים קטנים כגון חומצות אמינו, זה לא מראה immunolabeling השתפר למולקולות אלה בהשוואה לטיפול קונבנציונלי אוסמיום. היתרון של כלוריד פלטינת המתכת הכבד לשמר struצלום וכדי לשפר immunoreactivity גם נראה מוגבל לחוט השדרה, מסיבות שאינם מובנות לחלוטין 7. למרות ששיטת אוסמיום חינם משפרת antigenicity וניגוד רקמה, זה לא נראה לי לעבוד גם לשימור מבנים אחרים כגון שלפוחית presynaptic (ראה איור 2). בנוסף, Phend et al. הבחין שהיעדר אוסמיום הביא גם מיאלין שימור מופחת, כת"א יש חדירות מוגבלות לרכיבים התאיים לשמר קרומים 7. מסיבות אלה, בשיטות הקפאה להכנת דגימה עשויות להיות חלופות טובות יותר אם שימור ultrastructural הוא הנושא החשוב ביותר. הקפאת Ultrarapid של דגימה מאפשרת שימור של מולקולות בצורה טבעית יותר 18, ללא חפצים פוטנציאליים שיכול להיות מוצג על ידי השימוש בfixatives הכימי.
קודם לביצוע EM, הנוכחות שלאנטיגן במדגם חייב להיות מאושר בדרכים כגון ניתוח כתם מערבי. כמו בכל מחקרי immunolabeling, פרשנות נכונה של נתונים מסתמכת על השימוש בנוגדנים מתאימים, ספציפיים. נוגדנים חד שבטי מטוהרים יש להשתמש תמיד אם הוא זמין. ניסויים שליטים הם חיוניים כדי להבטיח כי דפוס התיוג נוצר בשל האינטראקציה הספציפית בין הנוגדן הראשוני וimmunogen. הספציפיות של התיוג, ניתן לבדוק על ידי ביצוע בקרות שליליות וחיוביות. לדוגמה, בשליטה שלילית, הנוגדן הראשוני יכול להיות מוחלף על ידי סרום שליטה קשורה של IgG שאינו מחוסן, ללא שינוי בצעדים כלשהם אחרים בפרוטוקול המכתים. שנית, חלבון שנמצא בתא תא אחד אבל לא באחרים יכול לשמש כביקורת חיובית. לדוגמה בסינפסות glutamatergic, PSD-95 הם סמן postsynaptic תוך GAP-43 הם בעיקר בהווה מסוף presynaptic 19-22.אם תיוג אפשר לראות כאשר הנוגדן ראשוני מושמט או בתאים שבו החלבון ידוע לא להיות קיים, אז התיוג לא ספציפי.
ברגע שאת הספציפיות של נוגדן ראשוני נבדקו בקפדנות, אחד צריך להיות מודע לכך שדגימות עם תיוג טוב לא צריכות להפגין clumping רבים או שיש לי חלקיקי זהב מוגזמים ברקע שבו אין רקמה היא הווה. אם כמות הזהב גבוהה מדי או נמוכה מדי, להתאים את הרמה או משך הזמן של חסימה והריכוז של נוגדנים בהתאם. Maunsbach וAfzelius לספק כמה דוגמאות וטיפים לimmunolabeling 23 מצוינות.
שימור מבני טוב של דגימות יכול לחסל חפצים שעשויים להפריע למורפולוגיה ולבלבל את הפרשנות של נתונים. לפיכך, השימור המעולה של מבנים מודגם על ידי שיטה זו הופך את הטכניקה זו החלה על מספר הרקמות ביולוגיות במיוחד כאשר מבנים עדינים יכולים להיותעיוות בקלות או נהרס במהלך עיבוד מדגם. לפיכך, בנוסף לפרוסות ביפוקמפוס organotypic, שיטה זו יכולה להיות גם מאוד יקרה להכנות עצביות אחרות, כולל פרוסות מוח חריפים ותרבויות העצביות העיקריות. פרוסות ביפוקמפוס Organotypic קלות amendable לטיפול תרופתי וביטוי של חלבונים באמצעות זיהום נגיפי, אשר יכול להיות רלוונטי לחקר פלסטיות הסינפטית ביפוקמפוס. שיטה זו שימושית גם כדי לבחון את ההשפעות של תנאי ניסוי שונים על הפצת אנטיגן או לוקליזציה בגוף התא, דנדריטים, או קוצים הדנדריטים. יתר על כן, חלקיקי זהב colloidal עם גדלים של 6, 10, 15 או 25 ננומטר זמינים, כך שניתן לבצע את התיוג מרובה ללא חפיפה. אנו מאמינים כי היתרון של antigenicity המשופר, גמישות של בדיקות ושחזור של תיוג immunogold להדגים את כוחה של טכניקה זו כדי ללמוד מגוון אנטיגנים. זה הוא פוטנציאל useful לאפיין הלוקליזציה וההפצה של קולטנים, חלבוני הקולטן-אינטראקציה, טרנספורטר, תעלות יונים ועוד רבים אחרים ברקמות מוח שונות כולל הקליפה, התלמוס, המוח הקטנים ונורת חוש ריח.
לסיכום, הפרוטוקול הנוכחי של תיוג אוסמיום חופשי, לאחר הטבעת immunogold של תרבויות פרוסות ביפוקמפוס עכברוש הוא כלי רב ערך כדי ללמוד אנטיגנים שונים בתוך קוצים הדנדריטים. התחולה הפוטנציאלית של שיטה זו ברקמות עדינות מרכזיות אחרות עצבים תהיה שימושית מאוד לבחון את מאפייני ultrastructural של מולקולות מפתח שונים ולעזור להבין את תפקידם בתפקודים ביולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות למתיו פירנצה להכנה של התרבויות הפרוסות ביפוקמפוס. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי להזדקנות בארה"ב ואיגוד האלצהיימר לNZG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 x 15 mm polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Disposable scalpel | EXELINT | 29552 | |
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| 10 nm Goat-anti-rabbit gold | Electron Microscopy Sciences | 25108 | |
| Anti-Neurogranin antibody | Millipore | AB5620 | |
| 100% Picric acid | Electron Microscopy Sciences | 19550 | |
| 96% Paraformaldehyde | Acros Organics | AC41678-0030 | |
| 25% Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma | G5882 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
| p-Phenylenediamine | Sigma | P6001 | |
| Platinum (IV) chloride | Sigma | 379840 | |
| Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 |
References
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Stirling, J. W. Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques. J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).
- Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).
- Berryman, M. A. Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).
- Akagi, T., et al. Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses. J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).
- Stirling, J. W. Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution. J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).
- Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).
- Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. Embo J. 28, 3027-3039 (2009).
- Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
- Zhong, L., Gerges, N. Z. Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation. PloS one. 7, e41275 (2012).
- Horisberger, M., Vauthey, M. Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin. Histochemistry. 80, 13-18 (1984).
- Bendayan, M. A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology. Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).
- Racz, B., Weinberg, R. J. Spatial organization of coflin in dendritic spines. J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).
- Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections. J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).
- Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5'-nucleotidase in frozen thin sections. Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 Forthcoming.
- Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. [Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency]. Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).
- Kehle, T., Herzog, V. Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation. Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).
- Bozzola, J. R., Lonnie, Ch. 2. Electron Microscopy. 30, Second Edition, Jones and Bartlett Publishers. (1992).
- Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
- Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses. J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).
- Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism. Brain Research. 328, 381-385 (1985).
- Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity. Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).
- Maunsbach, A. A., Bjorn, Ch. 16. Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , Academic Press. 383-426 (1999).
