Summary
蛋白质的定位和分布提供了重要的信息，了解他们的细胞功能。可以使用电子显微镜（EM）的优越的空间分辨率，以确定一个给定的抗原后免疫组化的亚细胞定位。对于组织的中枢神经系统（CNS），保持结构完整性的同时保持抗原性已经在EM研究特别困难。在这里，我们采用的程序已经被用来保存在中枢神经系统的研究和定性大鼠海马CA1锥体神经元突触蛋白的结构和抗原。
Abstract
在亚细胞水平研究生物分子免疫电镜是一个功能强大的工具。耦合到电子致密如胶体金标记的抗体，可以揭示在各种组织中的特定的抗原1的定位和分布。两个最广泛使用的技术是预嵌入和嵌入后的技术。在预嵌入免疫金电子显微镜（EM）技术中，组织必须透性以允许抗体渗透之前，它被嵌入。这些技术是理想的保护结构，而且渗透力差的抗体（通常只有几微米）是一个很大的缺点2。后嵌入标记方法可以避免这个问题，因为标签上发生的部分固定的组织抗原更容易获得。多年来，多次修改，完善后的嵌入方法，以提高免疫，并保留超微结构 组织固定EM研究的重要组成部分。固定剂的化学交联的大分子锁定的组织结构。固色剂的选择不仅影响结构保存，但也抗原性和对比度。几十年来，四氧化锇（OSO 4），甲醛，和戊二醛已被标准的固定剂，包括中枢神经系统（CNS）的组织，尤其是在化学和物理处理过程中容易产生结构损伤。不幸的是，OSO 4是反应性高的，并已被证明，以掩盖抗原6，从而导致在穷人和不足的标签。替代方法来避免化学固定，包括冻结的组织。但是，这些技术是难以执行，并需要昂贵的仪器。为了解决这些问题中的某些问题，并提高CNS组织标签，Phend 等 。 OSO 4醋酸铀（UA）和单宁的ACI代替D（TA），并成功地引入了额外的修改，以提高抗原检测的敏感性和结构保存在大脑和脊髓组织7。我们都采用了这种锇后埋线法对大鼠脑组织和优化的探测和研究突触蛋白的免疫胶体金标记技术。 我们在座的方法来确定大鼠海马CA1锥体神经元突触蛋白的超微结构定位。我们使用海马切片培养的切片。这些切片保持的trisynaptic的的电路的海马，从而学习突触可塑性是特别有用的，一个机制，人们普遍认为，学习和记忆的基础。如前所述8，可以制备从出生后的第5和6天小鼠/大鼠幼仔器官型海马切片，以及急性击倒或过度表达的外源蛋白是特别有用的。我们以前使用过该协议的通道aracterize的NG（NG），神经元特异性蛋白的关键作用，在调节突触功能8,9。我们还用它来 描述的超微结构定位钙调素（CAM）和Ca 2 + /钙调素依赖性蛋白激酶II（CaMKII）10。所示的结果，该协议允许的树突棘超微结构的保存和高效的标签，吴，，帮助刻画其分布在脊柱8。此外，这里所描述的过程可以有广泛的适用性，在研究参与神经元功能的许多其他蛋白质。
Protocol
1。固定术
固定剂是致癌物质，戴手套，在通风橱中的固定剂处理。除非另有说明，所有的孵化做冰，所有的解决方案在使用前，应进行过滤。使用电子显微镜级试剂。
第1天
- 后的实验条件下（ 例如，病毒注射剂，药物治疗），将膜与器官型海马切片，在60×15mm的聚苯乙烯培养皿中含有冰冷的0.1M的磷酸盐缓冲液（索伦森的磷酸盐缓冲液），pH值为7.3。加入1 - 2毫升0.1M磷酸盐缓冲液直接在顶部的切片，以保持它们的冷。
关键的步骤： 请务必使用新鲜配制的缓冲和固定剂。确保的缓冲液的pH值是在所需的范围之内。一个不这样做可能会破坏细胞结构。
- 片CA1区的隔离，使用一次性解剖刀轻轻横切旁边切片到DG，CA1区细胞层（ 图1）平行。然后切剩下的片垂直删除CA3区和下托。切的切片，以帮助识别组织的顶表面上的一个角落。
注：在没有病毒交付兴趣蛋白质的情况下是必需的，可以是固定的整个组织切片，用温和的冰冷的缓冲液冲洗后，除去介质。然后这之后是通过切出的CA1。
关键的步骤： 跟踪的上部的组织，以适当的网格切片上。
- 小心地取出的组织，从膜中使用的背面侧的手术刀。使用巴斯德吸液管轻轻地组织转移到含12孔板的0.1M磷酸盐缓冲液。
- 在井中取出缓冲从板，并添加500米ü;升 - 1毫升冰冷的固定剂（pH 7.3）的组成如下：0.1％苦味酸，1％多聚甲醛和2.5％戊二醛在0.1M磷酸盐缓冲液。孵育2小时，在4℃下
注：苦味酸干燥时可能会爆炸。保持湿润密闭容器中的水。应贮存在干燥，通风良好的地方。
- 移除固定液从井和洗涤样品在0.1M磷酸盐缓冲液中的3次（每次20分钟）。
- 孵育40分钟，在1％的单宁酸（重量/体积），在0.1M马来酸缓冲液，pH6.0。
- 马来酸盐缓冲液中冲洗两次（每次20分钟）。
- 在1％乙酸双氧铀（重量/体积）在黑暗中马来酸盐缓冲液中孵育40分钟。醋酸铀对光很敏感，是放射性的。量用Parafilm的烧杯中溶解时，在4℃下存放任何未使用的缓冲液在黑暗
- 马来酸盐缓冲液中冲洗两次（每次20分钟）。
- 孵育20分钟，在0.5％铂氯碱IDE（重量/体积）马来酸盐缓冲液中。
- 马来酸盐缓冲液中冲洗两次（每次20分钟）。将样品储存在4℃下直到他们准备好以供进一步处理。
2。脱水和嵌入
环氧丙烷是致癌物质。避免蒸气，在通风橱中工作。使用绝对的，100％纯乙醇，不包含任何水迹。这绝对乙醇稀释到不同浓度的脱水。
第2天
- 孵育5分钟，在50％乙醇中，然后在70％乙醇中的5分钟。
- 在新鲜制备的1％，在70％乙醇中的对苯二胺（PPD）孵育15分钟。
- 在70％乙醇中冲洗三次。
- 孵育5分钟，在80％乙醇中，然后在95％乙醇中的5分钟。
- 在100％的乙醇中温育两次每次5分钟。
- 准备带螺丝帽的玻璃小瓶，并确保它们是干净和完全干燥。将切片，玻璃瓶和简单而清楚地标示每小瓶。
- 孵育5分钟，在1:1的乙醇：氧化丙烯。
- 孵育在100％氧化丙烯两次每次5分钟。
- 加入树脂（EPON），每个管形瓶中，使与环氧丙烷的1:1混合物。轻轻搅拌2小时。不要摇晃瓶太严格，以防止泡沫，可能会干扰嵌入。
- 将树脂以3:1的混合物与环氧丙烷，和混合2小时。
- 转移到100％的树脂，并培育O / N。
第3天
- 夹层之间的采样条状的的ACLAR塑料和固化24小时在60℃下
3。切割和安装在网格
第4天
- 剪切半薄（0.5微米）的部分，和染色，用1％甲苯胺蓝+ 1％硼砂，以确定样本的正确方向。
- 切割超薄切片（60纳米）和安装在镍网格，每个网格的一个部分。
4。免疫组化
所有的缓冲液和水在使用前，应进行过滤。
第5天
- 将下降（〜50微升）的1％Tween-20/phosphate缓冲液（T / PB），pH为7.5，在平坦的表面上一块干净的封口膜。用干净的镊子轻轻拿起电网的边缘，浮动缓冲区，节下来，并在室温下孵育10分钟。
- 沥干多余的液体从电网通过载置部侧上的滤纸，然后浮于50mM甘氨酸在T / PB 15分钟，在RT。
关键步骤：为了避免过度的“进位”在孵育期间溶液液滴从一个到下一个的解决方案中，排出多余的液体通过轻轻触摸网格的边缘到＃1滤纸每个解决方案之间变化。同时删除任何解决方案被困在两臂之间的EM钳轻轻一小块滤纸之间的钳子武器排汗电网，同时可确保响的部分不完全干燥。
- 用滤纸擦干电网，然后漂浮在封闭液含2.5％BSA和2.5％血清的30分钟，在RT下的二次抗体在T / PB从该动物。
- 孵育在4℃下与第一抗体（在T / PB）在RT或O / N的最佳时间和保温温度，以及抗体的浓度，需要实验确定。
- 网格洗净3次（每次2分钟）与T / PB。
- 在RT下的1小时的二次抗体（1:20抗兔或抗小鼠耦合到10 nm的金）孵育。
- T / PB洗3次（每次2分钟）。
- Postfix和2％戊二醛在T / PB 5分钟。
- T / PB，然后三次（2分钟），用过滤水清洗3次（每次2分钟）。
- 孵育在水中10分钟，用2％乙酸双氧铀。
而电网染色，准备一个CO 2室placin嘎一块石蜡膜的玻璃陪替氏培养皿的中心。然后放置在盘4-6的NaOH粒料周围封口膜在空气中的CO 2的吸收。保持顶部封闭了几分钟。使用巴斯德吸管，并迅速转移雷诺的柠檬酸铅溶液的封口膜在玻璃陪替氏培养皿中的一个小体积的。打开顶盖，就足以插入巴斯德吸管，以减少CO 2的重新引入到室内。
注：为了使雷诺的柠檬酸铅溶液，煮沸100毫升去离子水在微波炉中，在一个密闭的容器中，放凉。在与止动件50毫升容量瓶中，混合1.33克硝酸铅，1.76克柠檬酸钠和30毫升的开水剧烈振摇1分钟。然后摇间歇30分钟。这浑浊的溶液中，加入8毫升的1 M氢氧化钠烧瓶中，慢慢地倒置了几次。解决方案将变得清晰起来。使溶液至50毫升与煮娃之三。紧紧密封存储解决方案。如果沉淀物出现，丢弃，使一个新的。
- 在三个小烧杯准备温暖，刚煮沸的去离子水。洗掉的醋酸铀浸在电网中的第一个烧杯中，轻轻摇动30秒左右。重复此步骤，在其他两个烧杯中。
- 打开的玻璃陪替氏培养皿的顶部刚好够放置在网格上的下拉雷诺柠檬酸铅溶液。如果可能的话，要戴上口罩，而这样做是为了避免呼吸柠檬酸铅和防止沉淀物的形成。孵育10分钟。
- 打开顶盖，就足以消除电网。避免吸入柠檬酸铅。三次浸渍，依次在三个烧杯用温水，刚煮沸的蒸馏水洗净电网。在一张滤纸，条达，让电网干燥的。现在已准备好用于电子显微镜的样品。
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Representative Results
图2B示出的一个例子的内源性伍分子分布在海马CA1区锥体神经元树突棘。与超薄（60 nm）的组织中的海马CA1区域的（如在图2A中可见）的镍网格覆盖在1％T / PB，50mM甘氨酸，然后，用2.5％BSA和2.5％血清阻塞之前，用抗孵育-吴抗体。洗涤后，使用T / PB，网格，然后覆盖在耦合到10nm的金的抗兔第二抗体。最后，网格，用T / PB后缀为2％戊二醛2％醋酸铀和雷诺的柠檬酸铅染色，以提高对比度。 左的，有代表性的电子显微照片，显示非对称突触。突触后室的鉴定促进电子致密的PSD（箭头的头）和良好定义的质膜。 右 ，每个伍（箭头）和细胞膜之间的最短距离是不rmalized的脊柱的半径。伍分子内的脊柱（但不是在PSD）表现出优惠的本地化到质膜。直方图最初发表于EMBO杂志8。
图1。概略夹层从海马切片培养的海马CA1区的片， 例如 ，药物治疗或病毒感染的实验性治疗后，该膜含有切片放置在冰冷的磷酸盐缓冲液。片先切断齿状回（DG），平行的CA1细胞层下方水平。 CA1区然后分离除去CA3区和下托（分）。为了帮助识别的CA1区的顶表面，切割一个角落取向的组织（在这种情况下，上部右上角）。
图2。免疫标记的NG器官海马脑片CA1区突触文化。 （A）透射电子显微照片，显示大鼠海马CA1区突触。 CA1锥体神经元树突（D）很容易分辨的。鉴定促进轴突终端9T）和树突棘（S）之间的非对称突触的突触后密度（PSD，箭头）和明确的质膜存在。（B）分布在树突棘的NG（NG）。 左 ，透射电子显微照片，显示胶体金免疫-EM标签NG（箭头）。对于定量分析，每个金粒子之间的距离（不包括那些在私营部门，箭头）从血浆中membr甲烷是正常化（x轴）的脊柱的半径。因此，0对应的膜和1的颗粒处在中心脊柱躺在颗粒。 右 ，一个随机分布（粉红色）是通过使用一个随机数发生器的宏（Microsoft Excel中）在一个棘形生成表面。伍（蓝色）显示了最高的峰值分布接近到质膜。比例尺，200纳米。直方图最初发表于EMBO杂志8。
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Discussion
在这个协议中，我们采取了Phend和Weinberg方法，对大脑和脊髓组织，研究在大鼠海马脑片培养的树突棘。在海马CA3-CA1区树突棘是脆弱的结构，包含一个庞大的多种蛋白质中发挥重要作用，在调节神经功能。所提出的方法提供了一个平衡的方法，用于实现增强的抗原性，同时保持良好的的超微结构保存（图2A），允许合理的标记效率和良好的再现性，可用于脊柱内的特定抗原的分布特征。在这里，我们与10 nm胶体金标记吴。然后，我们量化了黄金的吴生成标记模式，有助于了解其在突触功能的作用（ 图2B）8。
可以做各种方式11-13中定量分析的免疫金14-17。
锇由TA，UA，更换和对苯二胺（PPD）在这种方法大大提高抗原检测的灵敏度相比，以前的方法7在神经组织中。甲醛和戊二醛的使用确保小的可溶性抗原，如氨基酸的结构保存和保留。环氧系树脂，而不是丙烯酸塑料树脂，提供了更好的稳定性，而不影响抗原性7的电子束下嵌入。相较于标准：锇协议，Phend 等人。/ em>的显示，TA，UA和PPD也改进的结构保存（ 见图1原始Phend纸）7，并发现，有效的免疫染色的多种蛋白质，包括物质P，降钙素基因相关肽（CGRP）， AMPA受体亚基1（GluA1），和γ-氨基丁酸（GABA）7。这些研究结果表明这种方法来研究不同的蛋白质在神经组织的能力。这种方法的另一个优点是，TA，UA和PPD是很容易准备和处理，并造成更小的危险比锇的风险，这是非常波动，且毒性很强的吸入和皮肤接触。
这种方法的一个限制是，虽然它保留保留小抗原如氨基酸，它不显示出改进的常规锇处理相比这些分子的免疫标记。重金属氯化铂的优点是保留STRU王国芳和增强免疫反应也似乎被限制到脊髓，原因，不能完全了解7。虽然的锇无的方法提高了抗原性和组织对比度，它似乎并没有很好地工作的其他结构，如突触前囊泡（参见图2），以保存。此外，Phend 等人所观察到的情况下锇降低髓鞘保护，也导致TA有限的渗透性膜进入细胞内组分的保留7。由于这些原因，冻结试样的制备方法可能是更好的选择，如果超微结构的保护是最重要的问题。超速冻结试样允许保存的分子更自然的方式18中，所使用的化学固定剂可以引入没有潜在的工件。
之前执行EM，在场的应通过Western blot分析方法，如确认样本中的抗原。正如所有的免疫标记的研究的数据，正确的解释依赖于适当的，特异性抗体的使用。高度纯化的单克隆抗体应始终使用（如果可用）。控制实验是必不可少的，以确保生成的标记图案是由于之间的初级抗体和免疫原的特异性相互作用。的标记的特异性可以通过进行阴性和阳性对照，进行测试。例如，在阴性对照中，第一抗体可以由不相关的对照血清的非免疫IgG抗体被替换，而不改变任何其它步骤中的染色协议。其次，作为阳性对照，可以使用的一种蛋白质，是存在于一个电池舱，但不是在其他。例如在谷氨酸的突触，PSD-95是突触后的标记物，而GAP-43是主要存在于突触前的终端19-22。如果标签被认为是主要抗体时，被省略或在车厢的蛋白质被称为不存在，则是不特定的标签。
的主要抗体的特异性经过严格的测试后，应注意样品具有良好的标签不应该表现出许多结块或有过大的金颗粒的背景下，没有组织。黄金如果该量太高或太低，调整阻挡和抗体的浓度相应的水平或持续时间。 Maunsbach和阿弗兹列斯提供了一些很好的例子，提示免疫标记23。
保存的样品可以消除良好的结构与形态的文物，可能会干扰，影响了数据的解释。因此，优越的保护结构的示出通过该方法，使这种技术适用于一些的生物组织，尤其是在脆弱的结构可以是来样加工过程中容易变形或破坏。因此，除了器官海马脑片，这种方法还可以是非常有价值的其他神经元的准备工作，包括急性脑片和原代培养的神经元。器官海马脑片很容易可修正通过病毒感染的药物治疗和表达的蛋白质，它可以适用于海马突触可塑性的研究。这种方法也很有用，检查不同实验条件对抗原分布在细胞体，树突，树突棘或本地化的影响。此外，胶体金粒子与6，10，15或25 nm的大小是可用的，使得有可能进行，没有重叠的多个标签。我们认为，增强的抗原性，免疫金标记的探针的灵活性和可重复性的优点证明这种技术来研究各种抗原的功率。它可能是usefu升受体，受体相互作用蛋白，转运，离子通道，许多人在不同的脑组织，包括大脑皮质，丘脑，小脑和嗅球的定位和分布的特点。
总之，本议定书的锇，嵌入后的免疫胶体金标记的大鼠海马脑片文化是一种宝贵的工具，研究各种抗原的树突棘。检查的超微结构特点，不同的关键分子，并有助于了解其生物功能的作用，这种方法在其他微妙的中枢神经组织的潜在适用性将是非常有用的。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
作者要感谢马修佛罗伦萨准备的海马切片培养。这项工作是由美国国家老龄问题研究所和阿尔茨海默氏症协会NZG补助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 x 15 mm polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Disposable scalpel | EXELINT | 29552 | |
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| 10 nm Goat-anti-rabbit gold | Electron Microscopy Sciences | 25108 | |
| Anti-Neurogranin antibody | Millipore | AB5620 | |
| 100% Picric acid | Electron Microscopy Sciences | 19550 | |
| 96% Paraformaldehyde | Acros Organics | AC41678-0030 | |
| 25% Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma | G5882 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
| p-Phenylenediamine | Sigma | P6001 | |
| Platinum (IV) chloride | Sigma | 379840 | |
| Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 |
References
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Stirling, J. W. Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques. J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).
- Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).
- Berryman, M. A. Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).
- Akagi, T., et al. Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses. J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).
- Stirling, J. W. Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution. J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).
- Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).
- Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. Embo J. 28, 3027-3039 (2009).
- Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
- Zhong, L., Gerges, N. Z. Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation. PloS one. 7, e41275 (2012).
- Horisberger, M., Vauthey, M. Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin. Histochemistry. 80, 13-18 (1984).
- Bendayan, M. A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology. Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).
- Racz, B., Weinberg, R. J. Spatial organization of coflin in dendritic spines. J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).
- Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections. J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).
- Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5'-nucleotidase in frozen thin sections. Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 Forthcoming.
- Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. [Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency]. Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).
- Kehle, T., Herzog, V. Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation. Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).
- Bozzola, J. R., Lonnie, Ch. 2. Electron Microscopy. 30, Second Edition, Jones and Bartlett Publishers. (1992).
- Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
- Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses. J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).
- Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism. Brain Research. 328, 381-385 (1985).
- Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity. Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).
- Maunsbach, A. A., Bjorn, Ch. 16. Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , Academic Press. 383-426 (1999).
