Summary
La localizzazione e la distribuzione delle proteine forniscono informazioni importanti per la comprensione delle loro funzioni cellulari. La superiore risoluzione spaziale di microscopia elettronica (EM) può essere utilizzato per determinare la localizzazione subcellulare di un dato antigene immunoistochimica seguito. Per tessuti del sistema nervoso centrale (CNS), preservando l'integrità strutturale mentre antigenicità mantenendo è stato particolarmente difficile in studi EM. Qui, si adotta una procedura che è stata usata per conservare le strutture e gli antigeni del sistema nervoso centrale per studiare e caratterizzare le proteine sinaptiche nel ratto CA1 dell'ippocampo neuroni piramidali.
Abstract
Microscopia Immunoelectron è un potente strumento per studiare molecole biologiche a livello subcellulare. Anticorpi accoppiati elettroni dense marcatori come oro colloidale può rivelare la localizzazione e la distribuzione di antigeni specifici in vari tessuti 1. Le due tecniche più utilizzate sono pre-embedding e post-embedding tecniche. In pre-embedding immuno-microscopia elettronica (EM) tecniche, il tessuto deve essere permeabilizzate per consentire la penetrazione di anticorpi prima di essere incorporato. Queste tecniche sono l'ideale per conservare le strutture, ma scarsa penetrazione dell'anticorpo (spesso solo i primi micrometri) è uno svantaggio notevole 2. I post-embedding metodi di etichettatura possibile evitare questo problema perché l'etichettatura avviene su sezioni di tessuti fissati in cui gli antigeni sono più facilmente accessibili. Nel corso degli anni, una serie di modifiche hanno migliorato le post-embedding metodi per migliorare e preservare immunoreattività ultrastruttura Fissazione dei tessuti è una parte cruciale di studi EM. Fissativi chimicamente reticolare le macromolecole per bloccare le strutture di tessuto in posizione. La scelta di fissativo influenza non solo la conservazione strutturale ma anche antigenicità e contrasto. Tetrossido di osmio (OsO 4), formaldeide e glutaraldeide sono stati i fissativi standard per decenni, anche per il sistema nervoso centrale (SNC), tessuti che sono particolarmente inclini a danni strutturali durante la lavorazione chimica e fisica. Purtroppo, OsO 4 è altamente reattivo e ha dimostrato di mascherare antigeni 6, con conseguente etichettatura povero e insufficiente. Approcci alternativi per evitare la fissazione chimica comprendono il congelamento dei tessuti. Ma queste tecniche sono difficili da eseguire e richiedono strumentazione costosa. Per risolvere alcuni di questi problemi e di migliorare tessuto del SNC etichettatura, Phend et al. sostituito OsO 4 con acetato di uranile (UA) e tannico acid (TA), e introdotto con successo ulteriori modifiche per migliorare la sensibilità della rilevazione dell'antigene e conservazione strutturale nel cervello e del midollo spinale 7. Abbiamo adottato questo osmio senza post-embedding metodo al tessuto del cervello di ratto e ottimizzato la tecnica immunogold etichettatura per rilevare e studiare le proteine sinaptiche. Vi presentiamo qui un metodo per determinare la localizzazione ultrastrutturale delle proteine sinaptiche nel ratto CA1 dell'ippocampo neuroni piramidali. Usiamo organotipiche fettine di ippocampo in coltura. Queste fette mantenere la circuiteria trisynaptic dell'ippocampo, e quindi sono particolarmente utili per studiare la plasticità sinaptica, un meccanismo ampiamente pensato alla base dell'apprendimento e della memoria. Organotipiche fettine ippocampali di postnatali giorni 5 e 6 di topo / ratto cuccioli possono essere preparati come descritto in precedenza 8, e sono particolarmente utili per acutamente knockdown o esprimono molti proteine esogene. Abbiamo già usato questo protocollo per characterize neurogranin (Ng), un neurone-specifica proteina con un ruolo critico nella regolazione della funzione sinaptica 8,9. Abbiamo anche usato per caratterizzare la localizzazione ultrastrutturale di calmodulina (CaM) e Ca 2 + / CaM-dipendente proteina chinasi II (CaMKII) 10. Come illustrato nei risultati, questo protocollo permette una buona conservazione ultrastrutturale delle spine dendritiche e l'etichettatura efficiente del Ng per caratterizzare la sua distribuzione nella colonna vertebrale 8. Inoltre, la procedura qui descritta può avere un'ampia applicabilità in studio molte altre proteine coinvolte in funzioni neuronali.
Protocol
1. Fissazione
Fissativi sono cancerogene, indossare guanti e gestire i fissativi in una cappa aspirante. Se non diversamente specificato, tutte le incubazioni sono effettuate su tutte le soluzioni ghiaccio e deve essere filtrata prima dell'uso. Utilizzare microscopia elettronica di grado reagenti.
Giorno 1
- Dopo condizioni sperimentali (ad esempio iniezione virale, trattamento farmacologico), posizionare la membrana con organotipiche fettine di ippocampo in un 60 x 15 millimetri capsula di Petri in polistirolo contenente ghiacciata 0.1 M tampone fosfato (tampone fosfato Sorensen), pH 7,3. Aggiungere 1 - 2 ml di tampone fosfato 0,1 M direttamente sopra le fette per tenerli freddo.
FASE CRITICA: utilizzare sempre freschi tamponi preparati e fissativi. Assicurarsi che il pH del tampone è nel raggio d'azione desiderato. Un fallimento in tal senso potrebbe danneggiare le strutture cellulari.
- Per isolare il sottocampo CA1 della fetta, utilizzare unmonouso bisturi per tagliare delicatamente sulla fetta successiva alla DG, parallelo allo strato CA1 cella (Figura 1). Poi tagliare la fetta rimanente in verticale per rimuovere il sottocampo CA3 e subiculum. Tagliare un angolo della fetta per identificare la superficie superiore del tessuto.
NOTA: Nel caso di consegna virale di proteina di interesse è richiesta, la sezione intero tessuto può essere fissato dopo che il supporto viene rimosso con un delicato risciacquo di tampone ghiacciato. Questo è seguito da tagliare il CA1.
Passaggio critico: tenere traccia del lato superiore del tessuto in modo corretto per il sezionamento delle griglie in seguito.
- Rimuovere accuratamente il tessuto dalla membrana utilizzando il retro del bisturi. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire delicatamente il tessuto ad un 12-pozzetti contenente 0,1 M tampone fosfato.
- Rimuovere il tampone nel pozzo dalla piastra e aggiungere 500 & mu; l - 1 ml di fissativo ghiacciato (pH 7,3) comprende il seguente: 0,1% acido picrico, 1% paraformaldeide e glutaraldeide 2,5% in tampone fosfato 0,1 M. Incubare per 2 ore a 4 ° C.
NOTA: L'acido picrico può essere esplosivo allo stato secco. Keep it bagnato con acqua in un contenitore ermeticamente chiuso. Conservare in luogo asciutto e ben ventilato.
- Rimuovere il fissativo dal pozzo e lavare campioni 3 volte (20 minuti ciascuna) in tampone fosfato 0,1 M.
- Incubare per 40 min in 1% acido tannico (w / v) in tampone maleato 0,1 M, pH 6,0.
- Risciacquare due volte (20 minuti ciascuna) in tampone maleato.
- Incubare per 40 min in acetato di uranile 1% (w / v) in tampone maleato al buio. Acetato di uranile è sensibile alla luce ed è radioattivo. Coprire il becher con Parafilm per soluzioni e memorizzare qualsiasi buffer utilizzato al buio a 4 ° C.
- Risciacquare due volte (20 minuti ciascuna) in tampone maleato.
- Incubare per 20 min a cloro platino 0,5%ide (w / v) in tampone maleato.
- Risciacquare due volte (20 minuti ciascuna) in tampone maleato. Conservare i campioni a 4 ° C fino a quando non sono pronti per ulteriori elaborazioni.
2. Disidratazione e Embedding
Ossido di propilene è cancerogeno. Evitare i vapori lavorando con essa in una cappa aspirante. Utilizzare assoluto, etanolo puro al 100% che non contiene alcuna traccia di acqua. Diluire la etanolo assoluto per la produzione di diverse concentrazioni per la disidratazione.
Giorno 2
- Incubare per 5 min in 50% etanolo e poi per 5 minuti in etanolo al 70%.
- Incubare per 15 min in appena preparato 1% p-fenilendiammina (PPD) in etanolo al 70%.
- Risciacquare tre volte in 70% di etanolo.
- Incubare per 5 min in 80% etanolo e poi per 5 minuti in etanolo al 95%.
- Incubare in etanolo al 100% due volte ogni 5 min.
- Preparare fiale di vetro con tappo a vite e assicurarsi che siano puliti e completamente asciutti. Trasferimento fette di fiale di vetro eetichettare ogni flacone semplice e chiaro.
- Incubare per 5 min in etanolo 01:01: ossido di propilene.
- Incubare in ossido di propilene al 100% due volte ogni 5 min.
- Aggiungi resina (Epon) ad ogni flacone di fare una miscela 1:1 con ossido di propilene. Mescolare delicatamente per 2 ore. Non agitare le fiale troppo rigorosamente per evitare bolle che potrebbero interferire con l'incorporamento.
- Aggiungere resina per fare una miscela 3:1 con ossido di propilene, e mescolare per 2 h.
- Trasferimento al 100% resina e incubare O / N.
Giorno 3
- Campioni Sandwich tra strisce di plastica ACLAR e cura per 24 ore a 60 ° C.
3. Sezionamento e Montaggio su griglie
Giorno 4
- Tagliare semi-sottili (0,5 micron) sezioni e macchia con l'1% blu di toluidina + 1% borace per determinare il corretto orientamento dei campioni.
- Tagliare sezioni ultrasottili (60 nm) e montare sulle griglie di nichel, una sezione per ogni griglia.
4. Immunoistochimica
Tutti i tamponi e l'acqua deve essere filtrata prima dell'uso.
Giorno 5
- Posizionare una goccia (~ 50 ml) di tampone Tween-20/phosphate 1% (T / PB), pH 7,5, su un pezzo di Parafilm pulito su una superficie piana. Delicatamente sollevare la griglia con pinza pulita dal bordo e galleggiare sul buffer, sezione giù, e incubare per 10 minuti a RT.
- Drenare il liquido in eccesso dalla griglia mettendo fianco sezione sulla carta da filtro e poi galleggiare su 50 mM glicina in T / PB per 15 minuti a RT.
PUNTO CRITICO: per evitare 'riporto' eccessivo di soluzioni da una goccia soluzione all'altra durante le incubazioni, scolare il liquido in eccesso toccando delicatamente il bordo della griglia su # 1 carta da filtro tra ogni cambio di soluzione. Rimuovere anche la soluzione intrappolato tra le braccia della EM pinza che tiene la griglia delicatamente assorbente con una scheggia di carta da filtro tra le braccia, mentre pinze assicusuonare le sezioni non si asciughi completamente.
- Asciugare la griglia con carta da filtro e poi galleggiano sul blocco soluzione contenente 2,5% di BSA e 2,5% di siero da animali dell'anticorpo secondario in T / PB per 30 minuti a RT.
- Incubare con l'anticorpo primario (in T / PB) a RT o O / N a 4 ° C. Il tempo ottimale e la temperatura di incubazione, nonché la concentrazione di anticorpi, devono essere determinati sperimentalmente.
- Lavare la griglia di tre volte (2 min ciascuno) con T / PB.
- Incubare con anticorpo secondario (1:20 anti-coniglio o anti-topo accoppiata a 10 nm oro) per 1 ora a RT.
- Lavare tre volte (2 min ciascuno) con T / PB.
- Postfix con 2% di glutaraldeide in T / PB per 5 min.
- Lavare tre volte (2 min ciascuno) con T / PB e poi tre volte (2 min ciascuno) con acqua filtrata.
- Incubare con acetato di uranile 2% in acqua per 10 min.
Mentre la griglia è la colorazione, preparare un 2-free camera di CO mise enga pezzo di Parafilm nel centro di un piatto di vetro Petri. Quindi posizionare 4-6 pellet di NaOH nel piatto intorno Parafilm di assorbire CO 2 nell'aria. Mantenere alto chiuso per alcuni minuti. Utilizzare una pipetta Pasteur e trasferire rapidamente un piccolo volume di soluzione di citrato di piombo Reynold alla Parafilm nella capsula Petri di vetro. Aprire il top appena sufficiente inserire la pipetta Pasteur per minimizzare la reintroduzione di CO 2 nella camera.
NOTA: Per la soluzione di piombo citrato di Reynold, far bollire 100 ml di acqua deionizzata in un forno a microonde e lasciate raffreddare in un contenitore ermetico. In un pallone da 50 ml con tappo, nitrato di piombo mix 1,33 g, 1,76 g di citrato di sodio e 30 ml di acqua bollita agitando vigorosamente per 1 min. Poi agitare intermittenza per 30 min. A questa soluzione nuvoloso, aggiungere 8 ml di idrossido di sodio 1 M e lentamente invertire il pallone un paio di volte. Soluzione sarà chiaro. Portare la soluzione a 50 ml con il wa bollitoter. Conservare la soluzione ermeticamente chiusi. Se precipitato, scartare e fare una nuova.
- In tre bicchieri più piccoli preparare calda, acqua appena bollita deionizzata. Lavare l'acetato di uranile immergendo la griglia nel bicchiere prima e delicatamente roteare intorno per 30 sec. Ripetere questa operazione per le altre due bicchieri.
- Aprire la parte superiore del piatto di vetro Petri basta per inserire la griglia sulla goccia di soluzione di citrato di piombo Reynold. Se possibile, indossare una maschera mentre si fa questo per evitare di inalare il citrato di piombo e per prevenire la formazione di precipitato. Incubare per 10 min.
- Aprire il top basta per eliminare la griglia. Evitare di respirare il citrato di piombo. Lavare la griglia di tre volte, immergendolo in sequenza in tre bicchieri con acqua calda e bollente distillata. Lasciare asciugare la griglia su un pezzo di carta da filtro, la sezione. Il campione è pronto per il microscopio elettronico.
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Representative Results
La Figura 2B mostra un esempio di distribuzione di molecole endogene Ng in spine dendritiche dei neuroni dell'ippocampo CA1 piramidale. Griglie nichel con ultrasottili (60 nm) tessuti contenenti regione CA1 dell'ippocampo (come visto in Figura 2A) sono stati coperti in 1% T / PB, 50 mM glicina, poi bloccate con BSA 2,5% e 2,5% di siero prima dell'incubazione con anticorpi anti Ng-anticorpo. Dopo lavaggio con T / PB, griglie sono state poi coperto in anti-coniglio anticorpo secondario accoppiato a 10 nm oro. Infine, le reti sono state lavate con T / PB e suffisso con il 2% glutaraldeide seguita da acetato di uranile 2% e citrato di piombo Reynold colorazione per aumentare il contrasto. Sinistra, microscopio elettronico rappresentativi che mostrano sinapsi asimmetriche. Identificazione del compartimento postsinaptico è facilitato dalla elettrone-densi PSD (testa di freccia) e ben definito membrana plasmatica. Destra, la distanza più breve tra ogni Ng (frecce) e la membrana plasmatica non erarmalized al raggio della colonna vertebrale. Molecole ng all'interno della colonna vertebrale (ma non al PSD) esporre localizzazione preferenziale alla membrana plasmatica. Questo istogramma è stato originariamente pubblicato nella Gazzetta EMBO 8.
Figura 1. Schematica di dissezione dell'area CA1 dalle culture fetta dell'ippocampo. Dopo trattamento sperimentale al, trattamento farmacologico fetta es o infezione virale, la membrana contenente la fetta è stato posto in tampone ghiacciato fosfato. La fetta è stato tagliato orizzontalmente sotto il giro dentato (DG), parallela allo strato CA1 cella. Il sottocampo CA1 è stato poi isolato rimuovendo il sottocampo CA3 e il subiculum (sub). Per identificare la superficie superiore del CA1, un angolo è stato tagliato per orientare il tessuto (in questo caso la tomaianell'angolo inferiore destro).
Figura 2. Etichettatura immunogold di neurogranin a CA1 sinapsi in organotipiche culture fetta dell'ippocampo. (A) al microscopio elettronico a trasmissione che mostra nell'area CA1 dell'ippocampo di ratto e sinapsi. Dendriti (d) di neuroni piramidali CA1 sono facilmente distinguibili. Identificazione delle sinapsi asimmetriche tra terminale assonale 9t) e spine dendritiche (s) è facilitata dalla presenza di post-sinaptica densità (PSD, freccia) e ben definito membrana plasmatica. (B) Distribuzione di neurogranin (Ng) in spine dendritiche. A sinistra, al microscopio elettronico di trasmissione mostrano immunogold-EM etichettatura dei nG (frecce). Per la quantificazione, la distanza di ogni particella d'oro (escluse quelle al PSD, punta di freccia) dal plasma membrane è normalizzare (asse x) al raggio della colonna vertebrale. Quindi, 0 corrisponde a una particella sdraiato sulla membrana e 1 per una particella situata al centro della colonna vertebrale. Destra, una distribuzione casuale (rosa) viene generato utilizzando un generatore di numeri casuali macro (Microsoft Excel) in una colonna a forma superficie. Ng (blu) mostra la distribuzione più alto picco vicino alla membrana plasmatica. Scala bar, 200 nm. Questo istogramma è stato originariamente pubblicato nella Gazzetta EMBO 8.
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Discussion
In questo protocollo, abbiamo adottato il metodo Phend e Weinberg per il cervello e del midollo spinale per studiare spine dendritiche nelle culture fetta dell'ippocampo di ratto. Spine dendritiche in ippocampo CA3-CA1 zona sono strutture delicate che contengono una grande varietà di proteine che svolgono un ruolo importante nel regolare le funzioni neuronali. Il metodo proposto fornisce un approccio equilibrato per raggiungere antigenicità maggiore pur mantenendo una buona conservazione ultrastrutturale (Figura 2A), permettendo ragionevole efficienza etichettatura e buona riproducibilità utile per caratterizzare la distribuzione di antigeni specifici all'interno della colonna vertebrale. Qui, abbiamo etichettato Ng con 10 nm di oro colloidale. Abbiamo poi quantificato l'oro per generare schema di etichettatura Ng che ha aiutato a capire il suo ruolo nella funzione sinaptica (Figura 2B) 8.
Analisi quantitativa di immunogold può essere fatto in diversi modi 11-13 14-17.
La sostituzione di osmio da TA, UA, e p-fenilendiammina (PPD) in questo approccio notevolmente migliorata la sensibilità della rilevazione dell'antigene nei tessuti neuronali rispetto ai metodi precedenti 7. L'uso di formaldeide e glutaraldeide assicura la conservazione strutturale e conservazione dei piccoli antigeni solubili quali aminoacidi. Epossidica a base di resine acriliche, piuttosto che resine plastiche, fornire una migliore stabilità per l'incorporamento sotto il fascio di elettroni senza compromettere antigenicità 7. Rispetto alla norma osmio protocollo, Phend et al. </ Em> aveva mostrato che TA, UA, e PPD anche migliorato conservazione strutturale (vedi figura 1 della carta Phend originale) 7, e che immunostaining efficiente trovata per proteine, come le sostanza P, calcitonin gene-related peptide (CGRP), subunità dei recettori AMPA 1 (GluA1), e acido gamma-aminobutirrico (GABA) 7. Questi risultati dimostrano la capacità di questa procedura per studiare le proteine in differenti tessuti neuronali. Un altro vantaggio di questo metodo è che TA, UA e PPD sono facili da preparare e gestire, e rappresentano molto più piccoli rischi pericolose al di osmio, che è estremamente volatile e molto tossico per inalazione e contatto con la pelle.
Una limitazione di questo metodo è che pur conserva e mantiene antigeni piccole quali aminoacidi, non mostra immunomarcatura migliorato per queste molecole rispetto al trattamento convenzionale osmio. Il vantaggio del cloruro di platino metallo pesante preservare STRUcture e migliorare immunoreattività sembra anche essere limitata al midollo spinale, per ragioni che non sono completamente compresi 7. Sebbene l'osmio metodo privo migliora antigenicità e contrasto dei tessuti, non sembra funzionare bene per la conservazione di altre strutture come vescicole presinaptiche (vedi Figura 2). Inoltre, Phend et al. Aveva osservato che l'assenza di osmio anche provocato una diminuzione mielina conservazione, come TA è limitata penetrabilità nei componenti intracellulari di preservare membrane 7. Per queste ragioni, i metodi di congelamento per la preparazione dei campioni possono essere alternative migliori se conservazione ultrastrutturale è la preoccupazione più importante. Congelamento ultrarapido del campione permette la conservazione di molecole in modo più naturale 18, senza artefatti potenziali che potrebbero essere introdotti con l'uso di fissativi chimici.
Prima di eseguire l'EM, la presenza dil'antigene nel campione dovrebbe essere confermato attraverso modi come l'analisi Western blot. Come con tutti gli studi immunomarcatura, corretta interpretazione dei dati si basa sull'utilizzo di appropriati anticorpi specifici. Altamente purificati anticorpi monoclonali devono essere utilizzati se disponibile. Esperimenti di controllo sono essenziali per garantire che il modello di etichettatura generato è dovuto alla interazione specifica tra l'anticorpo primario e l'immunogeno. La specificità della etichettatura può essere testato effettuando controlli negativi e positivi. Ad esempio, in un controllo negativo, l'anticorpo primario può essere sostituito da un siero di controllo non correlato non immune IgG, senza modificare le altre fasi del protocollo di colorazione. Secondo, una proteina che è presente in un compartimento cellulare, ma non in altri può essere utilizzato come controllo positivo. Ad esempio, in sinapsi glutamatergiche, PSD-95 è un marcatore postsinaptico, mentre GAP-43 è principalmente presente nel terminale presinaptico 19-22.Se l'etichettatura è visto quando l'anticorpo primario è omesso oppure in vani in cui è nota la proteina non essere presente, l'etichettatura non è specifico.
Una volta che la specificità dell'anticorpo primario è rigorosamente testato, si deve essere consapevoli che i campioni con una corretta etichettatura non deve presentare grumi di molti o di particelle d'oro sono eccessivi in background in cui non è presente il tessuto. Se la quantità di oro è troppo alta o troppo bassa, regolare il livello o la durata del blocco e concentrazione di anticorpo di conseguenza. Maunsbach e Afzelius fornire alcuni ottimi esempi e suggerimenti per immunomarcatura 23.
Buona conservazione strutturale dei campioni in grado di eliminare gli artefatti che possono interferire con la morfologia e confondere l'interpretazione dei dati. Quindi, la conservazione superiore di strutture illustrato da questo metodo rende questa tecnica ad un certo numero di tessuti biologici soprattutto dove delicate strutture possono esserefacilmente distorta o distrutti durante l'elaborazione del campione. Quindi, oltre a fettine ippocampali organotipiche, questo metodo può anche essere estremamente utile per altre preparazioni neuronali compresi fettine cerebrali acute e colture neuronali primarie. Organotipiche fettine ippocampali sono facilmente modificabili a trattamento farmacologico e l'espressione di proteine mediante infezione virale, che può essere applicabile per studiare plasticità sinaptica ippocampale. Questo metodo è utile anche per esaminare gli effetti delle diverse condizioni sperimentali sulla distribuzione antigene o la localizzazione nel corpo cellulare, dendriti, o spine dendritiche. Inoltre, particelle di oro colloidale con dimensioni di 6, 10, 15 o 25 nm sono disponibili, rendendo possibile effettuare etichettatura multipla senza sovrapposizioni. Riteniamo che il vantaggio maggiore di antigenicità, flessibilità di sonde e riproducibilità di etichettatura immunogold dimostrare la potenza di questa tecnica per studiare una varietà di antigeni. E 'potenzialmente useful per caratterizzare la localizzazione e la distribuzione dei recettori, recettore-proteine interagenti, trasportatori, canali ionici e molti altri nei tessuti cerebrali tra cui la corteccia, talamo, cervelletto e bulbo olfattivo.
In sintesi, il presente protocollo di osmio-free, post-embedding etichettatura immunogold di culture fetta dell'ippocampo di ratto è uno strumento prezioso per studiare vari antigeni all'interno di spine dendritiche. Il potenziale applicabilità di questo metodo in altri delicati tessuti del sistema nervoso centrale sarà molto utile per esaminare le caratteristiche ultrastrutturali delle diverse molecole chiave e per aiutare a capire il loro ruolo nelle funzioni biologiche.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Matteo Firenze per la preparazione delle culture fetta dell'ippocampo. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institute on Aging e Associazione Alzheimer di NZG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 x 15 mm polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Disposable scalpel | EXELINT | 29552 | |
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| 10 nm Goat-anti-rabbit gold | Electron Microscopy Sciences | 25108 | |
| Anti-Neurogranin antibody | Millipore | AB5620 | |
| 100% Picric acid | Electron Microscopy Sciences | 19550 | |
| 96% Paraformaldehyde | Acros Organics | AC41678-0030 | |
| 25% Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma | G5882 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
| p-Phenylenediamine | Sigma | P6001 | |
| Platinum (IV) chloride | Sigma | 379840 | |
| Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 |
References
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Stirling, J. W. Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques. J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).
- Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).
- Berryman, M. A. Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).
- Akagi, T., et al. Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses. J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).
- Stirling, J. W. Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution. J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).
- Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).
- Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. Embo J. 28, 3027-3039 (2009).
- Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
- Zhong, L., Gerges, N. Z. Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation. PloS one. 7, e41275 (2012).
- Horisberger, M., Vauthey, M. Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin. Histochemistry. 80, 13-18 (1984).
- Bendayan, M. A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology. Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).
- Racz, B., Weinberg, R. J. Spatial organization of coflin in dendritic spines. J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).
- Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections. J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).
- Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5'-nucleotidase in frozen thin sections. Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 Forthcoming.
- Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. [Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency]. Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).
- Kehle, T., Herzog, V. Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation. Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).
- Bozzola, J. R., Lonnie, Ch. 2. Electron Microscopy. 30, Second Edition, Jones and Bartlett Publishers. (1992).
- Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
- Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses. J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).
- Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism. Brain Research. 328, 381-385 (1985).
- Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity. Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).
- Maunsbach, A. A., Bjorn, Ch. 16. Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , Academic Press. 383-426 (1999).
