Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Post-inbäddade immunoguld Märkning av Synaptic proteiner i hippocampus slice kulturer

Published: April 3, 2013 doi: 10.3791/50273

Summary

Lokaliseringen och distribution av proteiner ger viktig information för att förstå deras cellulära funktioner. Den överlägsna rumsliga upplösningen av elektronmikroskopi (EM) kan användas för att bestämma den subcellulära lokaliseringen av ett givet antigen efter immunohistokemi. För vävnader i centrala nervsystemet (CNS), bevarar strukturell integritet bibehållen antigenicitet har varit särskilt svårt i EM studier. Här antar vi ett förfarande som har använts för att bevara strukturer och antigener i CNS för att studera och karakterisera synaptiska proteiner i råtta hippokampala CA1 pyramidala neuroner.

Abstract

Immunelektronmikroskopi är ett kraftfullt verktyg för att studera biologiska molekyler på subcellulär nivå. Antikroppar kopplade till elektron-täta markörer såsom kolloidalt guld kan avslöja lokaliseringen och distributionen av specifika antigener i olika vävnader 1. De två mest använda teknikerna är pre-inbäddning och efter inbäddning tekniker. I pre-inbäddning immunoguld-elektronmikroskopi (EM) tekniker måste vävnaden permeabiliserade att tillåta antikroppar penetration innan den är inbäddad. Dessa tekniker är idealiska för att bevara strukturer men dålig penetrering av antikroppen (ofta endast de första få mikrometer) är en avsevärd nackdel 2. De efter inbäddning märkning metoder kan undvika detta problem eftersom märkningen sker delar av fasta vävnader där antigener är mer lättillgängliga. Under årens lopp har ett antal modifieringar förbättrat efter inbäddning metoder för att öka immunoreaktiviteten och bevara ultrastruktur

Vävnadsfixering är en viktig del av EM studier. Fixativ tvärbinder kemiskt makromolekylerna att låsa vävnadsstrukturer på plats. Valet av fixativ påverkar inte bara strukturellt bevarande utan också antigenicitet och kontrast. Osmiumtetroxid (OSO 4), formaldehyd och glutaraldehyd har varit standard fixativ i årtionden, bland annat för centrala nervsystemet (CNS) vävnader som är särskilt utsatta för strukturell skada under kemisk och fysikalisk behandling. Olyckligtvis, är OSO 4 mycket reaktiv och har visat att maskera antigener 6, vilket resulterar i dålig och otillräcklig märkning. Alternativa metoder för att undvika kemisk fixering inkluderar frysning vävnaderna. Men dessa tekniker är svåra att utföra och kräver dyrbar instrumentering. För att lösa några av dessa problem och att förbättra CNS-vävnad märkning Phend et al. ersatt OSO 4 med uranylacetat (UA) och garvsyra acid (TA), och framgångsrikt infört ytterligare ändringar för att förbättra känsligheten hos antigen och strukturell konservering i hjärnan och ryggmärgsvävnad 7. Vi har antagit denna osmium-fri efter inbäddning metod för råtthjärna vävnad och optimerat immunoguld märkning teknik för att detektera och studera synaptiska proteiner.

Vi presenterar här en metod för att bestämma den ultrastrukturella lokalisering av synaptiska proteiner i råtta hippokampala CA1 pyramidala neuroner. Vi använder organotypic hippocampus odlade skivor. Dessa skivor upprätthålla trisynaptic kretsen i hippocampus, och sålunda är speciellt användbara för att studera synaptisk plasticitet, tänkte en mekanism allmänt att ligga bakom inlärning och minne. Organotypiska hippokampala skivor från postnatala dag 5 och 6 mus / råtta valpar kan framställas såsom beskrivits tidigare 8, och är särskilt användbara för akut ÖVERVÄLDIGANDE eller överuttrycker exogena proteiner. Vi har tidigare använt detta protokoll till characterize neurogranin (Ng), en neuron-specifikt protein med en kritisk roll vid reglering av synaptisk funktion 8,9. Vi har också använt det att karakterisera ultrastrukturella lokalisering av kalmodulin (CaM) och Ca 2 + / CaM-beroende proteinkinas II (CaMKII) 10. Som illustreras i slutändan kan detta protokoll god ultrastrukturella bevarande av Dendritutskotten och effektiv märkning av Ng för att karakterisera sin distribution i ryggen 8. Vidare kan det förfarande som beskrivs här har bred tillämpbarhet i studera många andra proteiner involverade i neuronala funktioner.

Protocol

1. Fixering

Fixativ är cancerframkallande, handskar och hantera fixativ i ett dragskåp. Om inget annat anges, är alla inkubationer utförs på is och alla lösningar bör filtreras före användning. Använd Elektronmikroskopi-grade reagens.

Dag 1

  1. Efter experimentella förhållanden (t.ex. viral injektion, missbruksbehandling), placera membranet med organotypic hippocampus skivor i en 60 x 15 mm polystyren Petriskål innehållande iskall 0,1 M fosfatbuffert (Sorensens fosfatbuffert), pH 7,3. Tillsätt 1 - 2 ml 0,1 M fosfatbuffert direkt ovanpå skivorna för att hålla dem kalla.

Avgörande steg: Använd alltid nylagade buffertar och fixativ. Kontrollera pH av bufferten är inom önskat intervall. En underlåtenhet att göra detta kan skada cellstrukturer.

  1. Att isolera CA1 delfältet av skivan, använd endisponibel skalpell att försiktigt skära över segmentet bredvid generaldirektoratet, parallellt med CA1 cellskiktet (figur 1). Skär sedan resterande skiva vertikalt för att avlägsna CA3 delfält och subiculum. Skär ett hörn av skivan för att identifiera den övre ytan av vävnaden.

OBS: Om ingen viralt leveranssystem av protein av intresse krävs kan hela vävnaden skiva fastställas efter mediet avlägsnas med en mild sköljning iskall buffert. Detta följs sedan genom att skära ut CA1.

Avgörande steg: Håll koll på ovansidan av vävnaden för att korrekt sektionering av gallren senare.

  1. Försiktigt bort vävnad från membranet med användning av baksidan av skalpell. Använd en Pasteurpipett att försiktigt överföra vävnaden till en 12-brunnsplatta innehållande 0,1 buffert M fosfat.
  2. Avlägsna bufferten i brunnen från plattan och tillsätt 500 & mU, L - 1 ml iskall fixativ (pH 7,3) bestående av följande: 0,1% pikrinsyra, 1% paraformaldehyd, och 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffert. Inkubera under 2 timmar vid 4 ° C.

OBS: Pikrinsyra kan vara explosiv i torrt tillstånd. Håll det fuktas med vatten i en väl tillsluten. Förvara på en torr och väl ventilerad plats.

  1. Avlägsna fixativ från brunnen och tvätta prover 3 gånger (20 minuter vardera) i 0,1 M fosfatbuffert.
  2. Inkubera under 40 min i 1% garvsyra (vikt / volym) i 0,1 M buffert maleat, pH 6,0.
  3. Skölj två gånger (20 minuter vardera) i maleat buffert.
  4. Inkubera under 40 min i 1% uranylacetat (vikt / volym) i buffert maleat i mörker. Uranylacetat är känslig för ljus och är radioaktiv. Täck bägaren med Parafilm Vid upplösning och lagra oanvänt buffert i mörker vid 4 ° C.
  5. Skölj två gånger (20 minuter vardera) i maleat buffert.
  6. Inkubera 20 minuter i 0,5% platina kloride (vikt / volym) i buffert maleat.
  7. Skölj två gånger (20 minuter vardera) i maleat buffert. Lagra proverna vid 4 ° C tills de är redo för ytterligare bearbetning.

2. Dehydrering och inbäddning

Propylenoxid är cancerframkallande. Undvik ångor genom att arbeta med den i ett dragskåp. Använd absolut, 100% ren etanol som innehåller några spår av vatten. Späd denna absolut etanol för att producera olika koncentrationer för uttorkning.

Dag 2

  1. Inkubera under 5 min i 50% etanol och därefter under 5 min i 70% etanol.
  2. Inkubera under 15 min i nyberedd 1% p-fenylendiamin (PPD) i 70% etanol.
  3. Skölj tre gånger i 70% etanol.
  4. Inkubera under 5 min i 80% etanol och därefter under 5 min i 95% etanol.
  5. Inkubera i 100% etanol två gånger 5 minuter vardera.
  6. Förbered glasflaskor med skruvlock och se till att de är rena och helt torra. Överför skivor till glasflaskor ochmärka varje flaska enkelt och tydligt.
  7. Inkubera i 5 min i 1:1 etanol: propylenoxid.
  8. Inkubera i 100% propylenoxid två gånger 5 minuter vardera.
  9. Lägg harts (Epon) till varje flaska för att göra en 1:1 blandning med propylenoxid. Blanda försiktigt under 2 timmar. Skaka inte flaskorna alltför strikt för att förhindra bubblor som kan störa inbäddning.
  10. Lägg harts för att göra en 3:1 blandning med propylenoxid, och blanda under 2 timmar.
  11. Överföring till 100% harts och inkubera O / N.

Dag 3

  1. Sandwich prover mellan remsor av ACLAR plast och botemedel för 24 timmar vid 60 ° C.

3. Sektionering och Montering på Grids

Dag 4

  1. Skär semi-tunna (0,5 um) sektioner och färgas med 1% toluidinblått + 1% borax för att bestämma den korrekta orienteringen av prover.
  2. Skär ultratunna sektioner (60 nm) och montera på nickel galler, ett avsnitt per rutnät.

4. Immunohistokemi

Alla buffertar och vatten bör filtreras före användning.

Dag 5

  1. Placera en droppe (~ 50 ^) på 1% Tween-20/phosphate buffert (T / PB), pH 7,5, på en bit ren Parafilm på en plan yta. Försiktigt plocka upp gallret med rena tång av kanten och flyter den på bufferten, avsnitt nedåt, och inkubera under 10 min vid RT.
  2. Dränera överskottsvätska från nätet genom att placera sektionen uppåt på filterpapper och sedan flyta på 50 mM glycin i T / PB under 15 min vid RT.

Avgörande steg: För att undvika överdriven "överföring" av lösningar från en lösning droppe till nästa under inkubationer, dränera överskottsvätska genom att försiktigt trycka på kanten av gallret på # 1 filterpapper mellan varje lösning förändring. Ta också bort alla lösningar fångad mellan armarna på EM tången håller nätet genom att försiktigt uppsugning med en flisa av filterpapper mellan pincett armarna medan ensuringa sektionerna inte torka ut helt.

  1. Torka gallret med filterpapper och sedan flyta på blockerande lösning innehållande 2,5% BSA och 2,5% serum från djuret av den sekundära antikroppen i T / PB under 30 min vid RT.
  2. Inkubera med primär antikropp (i T / PB) vid RT eller O / N vid 4 ° C. Den optimala tiden och temperaturen för inkubationen liksom antikroppskoncentration, måste bestämmas experimentellt.
  3. Tvätta gallret tre gånger (2 min vardera) med T / PB.
  4. Inkubera med sekundär antikropp (1:20 anti-kanin eller anti-mus kopplad till 10 nm guld) under 1 h vid RT.
  5. Tvätta tre gånger (2 min vardera) med T / PB.
  6. Postfix med 2% glutaraldehyd i T / PB under 5 min.
  7. Tvätta tre gånger (2 min vardera) med T / PB och därefter tre gånger (2 min vardera) med filtrerat vatten.
  8. Inkubera med 2% uranylacetat i vatten under 10 minuter.

Medan gallret färgning, förbereda ett CO 2-fri kammare av placinga bit Parafilm i mitten av en glas petriskål. Placera sedan 4-6 pellets av NaOH i skålen runt Parafilm att absorbera CO 2 i luften. Håll upp stängt för ett par minuter. Använd en Pasteurpipett och snabbt överföra en liten volym av Reynolds blycitrat lösning på Parafilm i glaset petriskålen. Öppna toppen precis tillräckligt för att infoga Pasteurpipett för att minimera återinförande av CO 2 in i kammaren.

OBS: För att göra Reynolds blycitrat lösning koka 100 ml avjoniserat vatten i en mikrovågsugn och låt svalna i en lufttät behållare. I en 50 ml volumetrisk kolv med propp, blanda 1,33 g blynitrat, 1,76 g natriumcitrat och 30 ml av den kokt vatten genom kraftig skakning under 1 minut. Sedan skaka intermittent under 30 minuter. Till denna molniga lösning, tillsätt 8 ml 1 M natriumhydroxid och långsamt invertera kolven några gånger. Lösning kommer att bli tydliga. Låt lösningen till 50 ml med kokt waTER. Förvara lösningen tätt tillsluten. Om fällningen börjar kasta och göra en ny.

  1. Under tre mindre bägare förbereder varma, nykokt avjoniserat vatten. Tvätta bort uranylacetat genom att doppa nätet i den första bägaren och försiktigt snurra den runt 30 sekunder. Upprepa detta steg i de andra två bägare.
  2. Öppna toppen av glaset petriskålen precis tillräckligt för att placera gallret på droppe Reynolds blycitrat lösning. Om möjligt, använd en mask medan du gör detta för att förhindra inandning av blycitrat och för att förhindra bildning av fällning. Inkubera i 10 min.
  3. Öppna toppen precis tillräckligt för att ta bort gallret. Undvik att andas på blycitrat. Tvätta gallret tre gånger genom att doppa den sekventiellt i tre bägare med varmt, nykokt destillerat vatten. Låt gallret torka på en bit filterpapper, avsnitt upp. Provet är nu redo för elektronmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2B visar ett exempel på fördelningen av endogena Ng molekyler i Dendritutskotten av CA1 hippocampus pyramidala nervceller. Nickel galler med ultratunna (60 nm) vävnader som innehåller CA1 regionen av hippocampus (såsom visas i figur 2A) var täckta med 1% T / PB, 50 mM glycin, blockerades sedan med 2,5% BSA och 2,5% serum innan inkubation med anti -Ng-antikropp. Efter tvättning med T / PB, var galler sedan täckt i anti-kanin sekundär antikropp kopplad till 10 nm guld. Slutligen galler tvättas med T / PB och efterfixerades med 2% glutaraldehyd, följt av 2% uranylacetat och Reynolds blycitrat färgning för att öka kontrasten. Vänster, representativa elektronmikrografer visar asymmetriska synapser. Identifiering av den postsynaptiska facket underlättas av den elektron-täta PSD (pilspets) och väldefinierad plasmamembran. Höger, var det kortaste avståndet mellan varje Ng (pilar) och plasmamembranet ingenrmalized till radien av ryggraden. Ng molekyler inom ryggraden (men inte på PSD) uppvisar preferens för lokalisering till plasmamembranet. Detta histogram publicerades ursprungligen i EMBO Journal 8.

Figur 1
Figur 1. Schematisk bild av CA1 område dissektion från hippocampus slice kulturer. Efter experimentell behandling till skiva, t.ex. läkemedelsbehandling eller virusinfektion, har membranet innehåller skivan placeras i iskall fosfatbuffert. Segmentet skars först horisontellt under dentate gyrus (DG), parallellt med CA1 cellskiktet. CA1 underfältet isolerades sedan genom avlägsnande av CA3 delfält och subiculum (under). Att identifiera den övre ytan av CA1, var ett hörn skars att orientera vävnaden (i detta fall den övrehögra hörnet).

Figur 1
Figur 2. Immunoguld märkning av neurogranin vid CA1 synapser i organotypiska hippocampus slice kulturer. (A) Transmission elektronmikrografer visar råtta hippocampus CA1 område och synapser. Dendriter (d) av CA1 pyramidala nervceller är lätta att särskilja. Identifiering av asymmetriska synapser mellan axonal terminalen 9t) och Dendritutskotten (s) underlättas av närvaron av postsynaptiska densitet (PSD, pilspets) och väldefinierade plasmamembranet. (B) Fördelning av neurogranin (Ng) i Dendritutskotten. Vänster, transmission elektronmikrografer visar immunoguld-EM märkning av NG (pilar). För kvantifiering, avståndet för varje guld partikel (exklusive de på PSD, pilspets) från plasma Membrane är normalisera (x-axel) mot radien av ryggraden. Följaktligen, motsvarar 0 till en partikel som ligger på membranet och 1 till en partikel som ligger i centrum av ryggraden. Höger, är en slumpmässig fördelning (rosa) genereras genom användning av ett slumpmässigt nummer makro generatorn (Microsoft Excel) i en ryggrad-formad yta. Ng (blå) visar den högsta toppen fördelningen nära plasmamembranet. Skala bar, 200 nm. Detta histogram publicerades ursprungligen i EMBO Journal 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta protokoll har vi antagit Phend och Weinberg metod för hjärna och ryggmärgsvävnad att studera Dendritutskotten i råtta hippocampus slice kulturer. Dendritutskotten i hippocampus CA3-CA1 området är känsliga strukturer som innehåller ett stort utbud av proteiner som spelar en viktig roll i regleringen av neuronala funktioner. Denna metod ger en balanserad strategi för att uppnå förbättrad antigenicitet bibehållen god ultrastrukturella konservering (figur 2A), som medger rimlig märkning effektivitet och god reproducerbarhet användbar för karakterisering av fördelningen av specifika antigener inom ryggraden. Här, märkt vi Ng med 10 nm kolloidalt guld. Vi kvantifieras sedan guldet att generera märkning mönster av Ng som hjälp att förstå sin roll i synaptisk funktion (Figur 2B) 8.

Kvantitativ analys av immunoguld kan göras på en mängd olika sätt 11-13 14-17.

Ersättningen av osmium av TA, UA, och p-fenylendiamin (PPD) i denna metod förbättras avsevärt känsligheten hos antigendetektion i neuronala vävnader jämfört med tidigare metoder 7. Användningen av formaldehyd och glutaraldehyd säkerställer strukturell bevarande och bibehållande av små lösliga antigener, såsom aminosyror. Epoxi-hartser, snarare än akryl plasthartser, ge bättre stabilitet för inbäddning i elektronstrålen utan att kompromissa antigenicitet 7. Jämfört med vanlig osmium protokollet, Phend et al. </ Em> hade visat att TA, UA, och PPD även förbättrad strukturell konservering (se figur 1 i den ursprungliga Phend papper) 7, och att effektiv immunfärgning visade för flera proteiner, inklusive substans P, kalcitonin-gen-relaterad peptid (CGRP), AMPA-receptor-subenhet 1 (GluA1) och gamma-aminosmörsyra (GABA) 7. Dessa upptäckter visar att förmågan hos detta förfarande för att studera olika proteiner i neuronala vävnader. En annan fördel med denna metod är att TA, UA och PPD är lätta att förbereda och hantera, och utgör betydligt mindre farliga risker än osmium, vilket är mycket flyktig och mycket giftig vid inandning och hudkontakt.

En begränsning av denna metod är att även om det bevarar och kvarhåller små antigener såsom aminosyror, inte uppvisar förbättrad immunomärkning för dessa molekyler jämfört med konventionell behandling osmium. Fördelen av tungmetallen platina-klorid för att bevara structure och förbättra immunreaktivitet tycks också vara begränsad till ryggmärgen, av skäl som inte är helt klarlagda 7. Även om den osmium-fri metod förbättrar antigenicitet och vävnader Däremot verkar det inte fungera bra för bevarandet av andra strukturer som presynaptiska vesiklar (se figur 2). Dessutom hade Phend et al. Konstaterat att avsaknaden av osmium även resulterat i minskad myelin bevarande, eftersom TA har begränsad penetrerbarhet i de intracellulära komponenter för att bevara membran 7. Av dessa skäl kan frysning metoder för provberedning vara bättre alternativ om ultrastrukturell konservering är det mest viktig. Ultrasnabb frysning av provet möjliggör bevarandet av molekyler på ett mer naturligt sätt 18 utan potentiella artefakter som skulle kunna införas genom användning av kemiska fixeringsmedel.

Före utförande av EM, närvaron avantigenet i provet bör bekräftas genom metoder såsom Western blot-analys. Som med alla immunomärkning studier bygger korrekt tolkning av uppgifter om användningen av lämpliga, specifika antikroppar. Högrenade monoklonala antikroppar skall alltid användas om det finns. Kontrollexperiment är viktigt att säkerställa att märkningen som genereras beror på den specifika interaktionen mellan den primära antikroppen och immunogenen. Specificiteten av märkningen kan testas genom att utföra negativa och positiva kontroller. Till exempel, i en negativ kontroll, kan den primära antikroppen kan ersättas av en obesläktad kontrollserum av icke-immun-IgG, utan att ändra några andra steg i färgningsprotokollet. Det andra, kan ett protein som är närvarande i en cell fack men inte i andra kan användas som en positiv kontroll. Till exempel i glutamaterga synapser är PSD-95 en postsynaptisk markör medan GAP-43 är i första hand finns i presynaptiska terminalen 19-22.Om märkningen ses när primära antikroppen utelämnas eller i utrymmen där proteinet är kända att inte vara närvarande, då märkningen är inte specifik.

När specificitet primära antikropp noggrant testade, bör man vara medveten om att prover med god märkning inte bör uppvisa många klumpning eller har alltför guldpartiklar i bakgrunden där ingen vävnad är närvarande. Om mängden guld är för hög eller för låg, justera nivån eller varaktigheten av blockering och koncentrationen av antikropp i enlighet därmed. Maunsbach och Afzelius ge några utmärkta exempel och tips för immunomärkning 23.

God strukturell konservering av prover kan eliminera artefakter som kan störa morfologi och förbrylla tolkningen av data. Följaktligen gör den överlägsna bevarandet av strukturer illustreras av denna metod denna teknik tillämpas på ett antal biologiska vävnader, särskilt där ömtåliga strukturer kan varalätt förvrängd eller förstörs under provbearbetning. Följaktligen, förutom organotypic hippocampala skivor, kan denna metod också oerhört värdefull för andra neuronala preparat innefattande akuta hjärnsnitt och primära neuronala kulturer. Organotypic hippocampus skivor är lätt kan ändras till läkemedelsbehandling och uttryck av proteiner genom virusinfektion, som kan tillämpas för att studera hippocampus synaptisk plasticitet. Denna metod är också användbar för att undersöka effekterna av olika experimentella förhållanden på antigen distribution eller lokalisering i cellen kroppen, dendriter eller Dendritutskotten. Vidare, kolloidala guldpartiklar med storlekar av 6, 10, 15 eller 25 nm är tillgängliga, vilket gör det möjligt att utföra multipel märkning utan överlappning. Vi tror att fördelen av ökad antigenicitet, flexibilitet prober och reproducerbarhet av immunoguld märkningen visar kraften i denna teknik för att studera en mängd olika antigener. Det är potentiellt useful för att karakterisera lokalisering och distribution av receptorer, receptor-interagerande proteiner, Transporter, jonkanaler och många andra i olika hjärnvävnader inklusive cortex, thalamus, lillhjärnan och luktloben.

Sammanfattningsvis är detta protokoll ett osmium-fri, efter inbäddade immunoguld märkning av råtta hippocampus slice kulturer ett värdefullt verktyg för att studera olika antigener inom Dendritutskotten. Den potentiella tillämpningen av denna metod i andra känsliga centrala nervsystemet vävnader kommer att vara mycket värdefullt att undersöka ultrastrukturella egenskaperna hos olika viktiga molekyler och för att förstå deras roll i biologiska funktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har inget att lämna ut.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Matt Florens för beredning av hippocampus slice kulturer. Detta arbete har finansierats med bidrag från US National Institute on Aging och Alzheimers Association till NZG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 x 15 mm polystyrene Petri dish Falcon 351007
Disposable scalpel EXELINT 29552
Cell culture inserts Millipore PICM03050
10 nm Goat-anti-rabbit gold Electron Microscopy Sciences 25108
Anti-Neurogranin antibody Millipore AB5620
100% Picric acid Electron Microscopy Sciences 19550
96% Paraformaldehyde Acros Organics AC41678-0030
25% Glutaraldehyde (EM grade) Sigma G5882
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 22400
p-Phenylenediamine Sigma P6001
Platinum (IV) chloride Sigma 379840
Tannic acid Electron Microscopy Sciences 21710

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  2. Stirling, J. W. Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques. J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).
  3. Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).
  4. Berryman, M. A. Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).
  5. Akagi, T., et al. Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses. J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).
  6. Stirling, J. W. Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution. J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).
  7. Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).
  8. Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. Embo J. 28, 3027-3039 (2009).
  9. Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
  10. Zhong, L., Gerges, N. Z. Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation. PloS one. 7, e41275 (2012).
  11. Horisberger, M., Vauthey, M. Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin. Histochemistry. 80, 13-18 (1984).
  12. Bendayan, M. A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology. Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).
  13. Racz, B., Weinberg, R. J. Spatial organization of coflin in dendritic spines. J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).
  14. Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections. J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).
  15. Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5'-nucleotidase in frozen thin sections. Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 Forthcoming.
  16. Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. [Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency]. Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).
  17. Kehle, T., Herzog, V. Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation. Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).
  18. Bozzola, J. R., Lonnie, Ch. 2. Electron Microscopy. 30, Second Edition, Jones and Bartlett Publishers. (1992).
  19. Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
  20. Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses. J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).
  21. Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism. Brain Research. 328, 381-385 (1985).
  22. Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity. Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).
  23. Maunsbach, A. A., Bjorn, Ch. 16. Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , Academic Press. 383-426 (1999).

Tags

Neurovetenskap immunologi Neurobiologi biokemi molekylärbiologi Cellulär biologi genetik proteiner immunohistokemi Immunological synapser synapser Hippocampus mikroskopi Electron neuronal plasticitet formbarhet Nervsystemet Organotypiska kulturer hippocampus elektronmikroskopi efter inbäddning immunoguld märkning fixering cellodling imaging
Post-inbäddade immunoguld Märkning av Synaptic proteiner i hippocampus slice kulturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhong, L., Brown, J. C., Wells, C.,More

Zhong, L., Brown, J. C., Wells, C., Gerges, N. Z. Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures. J. Vis. Exp. (74), e50273, doi:10.3791/50273 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter