Summary
De lokalisatie en distributie van eiwitten leveren belangrijke informatie voor het begrijpen van hun cellulaire functies. De superieure ruimtelijke resolutie van elektronenmicroscopie (EM) kan worden gebruikt om de subcellulaire lokalisatie van een bepaald antigeen na immunohistochemie bepalen. Voor weefsels van het centrale zenuwstelsel (CNS), behouden de structurele integriteit behoud antigeniciteit is vooral moeilijk EM studies. Hier nemen we een procedure die is gebruikt om structuren en antigenen behouden in het CZS te bestuderen en synaptische eiwitten karakteriseren rat hippocampale CA1 pyramidale neuronen.
Abstract
Immuno microscopie is een krachtig hulpmiddel om biologische moleculen te bestuderen op het subcellulaire niveau. Antilichamen gekoppeld aan elektron-dichte markers zoals colloïdaal goud kan onthullen de lokalisatie en distributie van specifieke antigenen in verschillende weefsels 1. De twee meest gebruikte technieken zijn pre-embedding en na inbedding technieken. In pre-embedding immunogoud-elektronenmicroscopie (EM) techniek, moet het weefsel worden gepermeabiliseerd om antilichaam kan binnendringen voordat het wordt ingebed. Deze technieken zijn ideaal voor het bewaren van organen, maar slechte penetratie van het antilichaam (vaak alleen de eerste paar micrometer) een aanzienlijk nadeel 2. De post-embedding labeling methoden kunnen voorkomen dat dit probleem, omdat de etikettering vindt plaats op delen van vaste weefsels waar antigenen zijn gemakkelijker toegankelijk. Over de jaren zijn een aantal wijzigingen verbeterde de post-embedding methoden immunoreactiviteit verbeteren en ultrastructuur behouden Tissue fixatie is een cruciaal onderdeel van EM studies. Fixatieven chemisch verknopen de macromoleculen om het weefsel structuren te vergrendelen. De keuze van fixatief beïnvloedt niet alleen structurele conservering maar ook antigeniciteit en contrast. Osmiumtetroxide (OSO 4), formaldehyde en glutaaraldehyde zijn de standaard fixatieven decennia, met inbegrip van het centrale zenuwstelsel (CNS) weefsels die vooral gevoelig voor structurele schade tijdens chemische of fysische bewerkingen. Helaas OSO 4 is zeer reactief en is aangetoond dat maskeren antigenen 6, resulterend in slechte en onvoldoende labeling. Alternatieve benaderingen van chemische fixatie te vermijden onder meer het bevriezen van de weefsels. Maar deze technieken zijn moeilijk en vereisen dure apparatuur. Om sommige van deze problemen aan te pakken en CZS etikettering Phend et al. verbeteren. vervangen OSO 4 met uranylacetaat (UA) en tannine acid (TA), en met succes bijkomende wijzigingen van de gevoeligheid van antigeen en structurele conservering hersenen en ruggenmerg weefsels 7 verbeteren. We hebben deze osmium-vrij na inbedding methode om ratten hersenweefsel en geoptimaliseerd de immunogoud etikettering techniek voor het opsporen en bestuderen synaptische eiwitten. We presenteren hier een methode om de ultrastructurele lokalisatie van synaptische eiwitten in rat hippocampale CA1 pyramidale neuronen te bepalen. We maken gebruik van organotypische hippocampus gekweekte plakjes. Deze schijfjes handhaven van de trisynaptic circuit van de hippocampus, en zijn dus vooral handig voor het bestuderen van synaptische plasticiteit, een mechanisme in brede kring te leren en geheugen ten grondslag liggen. Organotypische hippocampale plakken van postnatale dag 5 en 6 muizen / ratten worden bereid zoals eerder beschreven 8 en zijn bijzonder nuttig om acute knockdown of overexpressie exogene eiwitten. We hebben eerder gebruikt dit protocol om characterize neurogranin (Ng), een neuron-specifiek eiwit een kritische rol in het reguleren synaptische functie 8,9. We hebben ook gebruikt om de lokalisatie van ultrastructurele calmoduline (CaM) en Ca 2 + / CaM-afhankelijke proteïne kinase II (CaMKII) 10 karakteriseren. Zoals weergegeven in de resultaten, dit protocol zorgt voor een goede ultrastructurele behoud van dendritische spines en efficiëntie-etikettering van Ng te helpen karakteriseren te verspreiden over de rug 8. Bovendien is de hier beschreven procedure kan brede toepasbaarheid hebben bij het bestuderen van vele andere eiwitten betrokken bij neuronale functies.
Protocol
1. Bevestiging
Fixatieven zijn kankerverwekkend, draag handschoenen en omgaan met de fixeermiddelen in een zuurkast. Tenzij anders vermeld, zijn alle incubaties uitgevoerd op ijs en alle oplossingen worden gefiltreerd voor gebruik. Gebruik elektronenmicroscopie-grade reagentia.
Dag 1
- Na experimentele omstandigheden (bijv. virale injectie, drugsbehandeling) moet het membraan met organotypische hippocampus plakken in een 60 x 15 mm polystyreen petrischaal met ijskoude 0,1 M fosfaatbuffer (Sorensen's fosfaatbuffer), pH 7,3. Voeg 1 - 2 ml 0,1 M fosfaatbuffer direct op de plakken te houden koud.
Cruciale stap: Gebruik altijd vers bereid buffers en fixatieven. Controleer of de pH van de buffer binnen gewenste bereik. Een niet te doen zou kunnen beschadigen cellulaire structuren.
- Om de CA1 deelgebied van de slice te isoleren, gebruik dan eenwegwerpbistouri voorzichtig dwars het segment naast de DG, evenwijdig aan de CA1 cellaag (Figuur 1). Snijd vervolgens de resterende segment verticaal om de CA3 deelgebied en de subiculum verwijderen. Snij een hoek van het segment helpen om het bovenvlak van het weefsel.
OPMERKING: Bij geen virale afgifte van eiwit van belang wordt vereist, het gehele weefsel slice kan worden vastgezet nadat de media verwijderd met een zachte spoelen ijskoude buffer. Dit wordt dan gevolgd door het uitsnijden van de CA1.
Kritische stap: Houd de bovenzijde van het weefsel zodat goede snijden van de roosters later.
- Verwijder het weefsel van het membraan met de achterkant van de scalpel. Gebruik een Pasteur pipet om het weefsel voorzichtig naar een 12-well plaat die 0,1 M fosfaatbuffer.
- Verwijder de buffer in de put van de plaat en voeg 500 & mu; l - 1 ml ijskoude fixatief (pH 7,3) bestaande uit: 0,1% picrinezuur, 1% paraformaldehyde en 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer. Incubeer gedurende 2 uur bij 4 ° C.
OPMERKING: Picrinezuur kunnen explosief zijn als het droog. Houd het bevochtigd met water in een goed gesloten verpakking bewaren. Bewaar op een droge en goed geventileerde plaats bewaren.
- Verwijder het fixeermiddel uit de put en spoelmonsters 3 keer (20 min elk) in 0,1 M fosfaatbuffer.
- Incubeer gedurende 40 min in 1% looizuur (w / v) in 0,1 M maleaat buffer, pH 6,0.
- Twee keer spoelen (20 min elk) in maleaat buffer.
- Incubeer gedurende 40 min in 1% uranylacetaat (w / v) in maleaat buffer in het donker. Uranylacetaat is gevoelig voor licht en is radioactief. Dek het bekerglas af met Parafilm bij het oplossen en Bewaar ongebruikte buffer in het donker bij 4 ° C.
- Twee keer spoelen (20 min elk) in maleaat buffer.
- Incubeer gedurende 20 min in 0,5% platina chlooride (w / v) in maleaat buffer.
- Twee keer spoelen (20 min elk) in maleaat buffer. Bewaar de monsters bij 4 ° C tot ze klaar voor verdere verwerking.
2. Uitdroging en Embedding
Propyleenoxide is kankerverwekkend. Vermijd dampen door te werken met het in een zuurkast. Gebruik absoluut, 100% pure ethanol, dat geen spoor van water bevat. Verdun deze absolute ethanol bij verschillende concentraties produceren voor uitdroging.
Dag 2
- Incubeer gedurende 5 min in 50% ethanol en gedurende 5 min in 70% ethanol.
- Incubeer gedurende 15 min in vers bereide 1% p-fenyleendiamine (PPD) in 70% ethanol.
- Driemaal spoelen in 70% ethanol.
- Incubeer gedurende 5 min in 80% ethanol en gedurende 5 min in 95% ethanol.
- Incubeer in 100% ethanol tweemaal 5 min elk.
- Bereid glazen flacons met schroefdop en zorg ervoor dat ze schoon en helemaal droog zijn. Overdracht plakjes om glazen flesjes enbenoem elke flacon eenvoudig en duidelijk.
- Incubeer gedurende 5 min in 1:1 ethanol: propyleenoxide.
- Incubeer in 100% propyleenoxide tweemaal 5 min elk.
- Voeg hars (Epon) aan elk flesje een 1:1 mengsel met propyleenoxide maken. Meng gedurende 2 uur. Schud de flacons te rigoureus om te bellen die kunnen interfereren met inbedding te voorkomen.
- Voeg hars een 3:1 mengsel met propyleenoxide, en meng gedurende 2 uur maken.
- Overdracht naar 100% hars en incubeer O / N.
Dag 3
- Sandwich monsters tussen stroken ACLAR plastic en genezing gedurende 24 uur bij 60 ° C.
3. Snijden en montage op grids
Dag 4
- Snij semi-dunne (0,5 um) secties en vlek met 1% toluidineblauw + 1% borax de juiste oriëntatie van monsters te bepalen.
- Snijd ultradunne secties (60 nm) en op nikkel roosters, een sectie per grid.
4. Immunohistochemie
Alle buffers en water worden gefilterd voor gebruik.
Dag 5
- Breng een druppel (~ 50 pi) van 1% Tween-20/phosphate buffer (T / PB), pH 7,5, op een schoon stuk Parafilm op een vlakke ondergrond. Voorzichtig ophalen rooster met schone pincet door de rand en drijven op de buffer, gedeelte neer en incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
- Afvoer overtollige vloeistof uit het net door het plaatsen gedeelte boven op papierfilter en drijven op 50 mM glycine in T / PB 15 minuten bij RT.
Cruciale stap: Om te voorkomen dat overmatig 'carry-over' van oplossingen van de ene oplossing druppel naar het volgende tijdens de incubaties, overtollige vloeistof weglopen door voorzichtig tegen de rand van het rooster op # 1 filtreerpapier tussen elke oplossing verandering. Verwijder ook een oplossing gevangen tussen de armen van de EM pincet houdt het net door zachtjes wicking met een langgerekte strook filtreerpapier tussen de tang armen terwijl ensuring de secties hoeven niet volledig uitdrogen.
- Droog het rooster met filtreerpapier en drijven op blokkeeroplossing die 2,5% BSA en 2,5% serum van het dier van het secundaire antilichaam in T / PB gedurende 30 min bij RT.
- Incuberen met primair antilichaam (in T / PB) bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C. De optimale tijd en temperatuur van incubatie en antilichaamconcentratie, moet experimenteel bepaald.
- Was het net drie keer (2 min elk) met T / PB.
- Incuberen met secundair antilichaam (1:20 anti-konijn of anti-muis gekoppeld aan 10 nm goud) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was het residu driemaal (2 min elk) met T / PB.
- Postfix met 2% glutaaraldehyde in T / PB gedurende 5 minuten.
- Was driemaal (2 min elk) T / PB en vervolgens driemaal (2 min elk) met gefilterd water.
- Incuberen met 2% uranylacetaat in water gedurende 10 minuten.
Terwijl het net vlekken, bereiden een CO 2-vrije kamer door placinga stuk Parafilm in het midden van een glazen petrischaal. Leg 4-6 pellets van NaOH in de schaal rond de Parafilm om CO2 te absorberen in de lucht. Houd de top gesloten enkele minuten. Gebruik een Pasteur pipet en zo snel mogelijk een kleine hoeveelheid lood citraatoplossing Reynolds de Parafilm in de glazen petrischaal. Open de bovenste net genoeg om het Pasteur pipet te voegen aan de herintroductie van CO 2 te beperken in de kamer.
OPMERKING: Om loodcitraat Reynold's oplossing te maken, 100 ml gedeïoniseerd water te koken in een magnetron en koel in een luchtdichte container te laten. In een 50 ml maatkolf met stop, mix 1,33 g loodnitraat, 1,76 g natriumcitraat en 30 ml water gekookt door schudden gedurende 1 minuut. Dan tussenpozen schudden gedurende 30 minuten. Deze troebele oplossing, voeg 8 ml 1 M natriumhydroxide en langzaam draaien de kolf enkele keren. Oplossing zal duidelijk worden. Breng de oplossing tot 50 ml met het verhitte water. Bewaar de oplossing goed afgesloten. Als neerslag ontstaat weg te gooien en een nieuwe maken.
- In drie kleinere bekers te bereiden warme, vers gekookt gedeïoniseerd water. Was de uranylacetaat door dompelen het net in de eerste beker en voorzichtig draai hem rond voor 30 sec. Herhaal deze stap in de andere twee bekers.
- Open de bovenkant van de glazen petrischaal net genoeg om het raster te plaatsen op de druppel loodcitraat oplossing Reynolds. Indien mogelijk, draag een masker terwijl je dit doet om de ademhaling op loodcitraat te voorkomen en om de vorming van neerslag te voorkomen. Incubeer gedurende 10 minuten.
- Open de bovenste net genoeg om het rooster te verwijderen. Vermijd inademen van de loodcitraat. Was het net drie keer door dompelen achtereenvolgens in drie bekers met warme, vers gekookt gedestilleerd water. Laat het rooster drogen op een stukje filtreerpapier, sectie omhoog. Het monster kan nu de elektronenmicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2B toont een voorbeeld van de verdeling van de endogene moleculen in Ng dendritische uitsteeksels van hippocampale CA1 pyramidale neuronen. Nikkel roosters met ultradunne (60 nm) weefsels die CA1 gebied van de hippocampus (zoals weergegeven in figuur 2A) werden bedekt met 1% T / PB, 50 mM glycine, vervolgens geblokkeerd met 2,5% BSA en 2,5% serum voorafgaand aan incubatie met anti Ng-antilichaam. Na wassen met T / PB werden grids vervolgens bedekt met anti-konijn secundair antilichaam gekoppeld aan 10 nm goud. Tenslotte werden gewassen met roosters T / PB en fixeerd met 2% glutaraldehyde gevolgd door 2% uranylacetaat en loodcitraat Reynolds kleuring beter contrast. LV representatieve electronenmicroscoop met asymmetrische synapsen. Identificatie van de postsynaptische compartiment wordt vergemakkelijkt door de elektron-dichte PSD (pijlpunt) en goed gedefinieerde plasmamembraan. Rechts, de kortste afstand tussen elke Ng (pijlen) en de plasmamembraan geenrmalized de radius van de wervelkolom. Ng moleculen binnen de wervelkolom (maar niet de PSD) vertonen preferentiële lokalisatie naar de plasmamembraan. Dit histogram werd oorspronkelijk gepubliceerd in het EMBO Journal 8.
Figuur 1. Schema van CA1 gebied dissectie van de hippocampus slice culturen. Experimentele behandeling Na het segment, zoals medicatie of virale infectie, het membraan dat het segment werd in ijskoude fosfaatbuffer. De plak werd eerst horizontaal gesneden onder de dentate gyrus (DG), evenwijdig aan de CA1 cellaag. De CA1 subveld werd vervolgens geïsoleerd door de CA3 subveld en subiculum (sub). Te helpen om het bovenoppervlak van de CA1, werd een hoek gesneden oriënteren het weefsel (in dit geval de bovensterechterbovenhoek).
Figuur 2. Immunogold etikettering van neurogranin op CA1 synapsen in organotypische hippocampus slice culturen. (A) Transmissie electronenmicroscoop tonen rat hippocampale CA1 gebied en synapsen. Dendrieten (d) van CA1 pyramidale neuronen gemakkelijk te onderscheiden. Identificatie van asymmetrische synapsen tussen axonale terminal 9t) en dendritische uitsteeksels (s) wordt vergemakkelijkt door de aanwezigheid van post-synaptische dichtheid (PSD, pijlpunt) en goed gedefinieerde plasmamembraan. (B) Verdeling van neurogranin (Ng) in dendritische uitsteeksels. Links, transmissie-electronenmicroscoop tonen immunogold-EM etikettering van nG (pijlen). Voor kwantificering, de afstand van elke gouddeeltje (met uitzondering van deze te PSD, pijlpunt) van de plasma Membrane is normaliseren (x-as) met de straal van de wervelkolom. Vandaar 0 komt overeen met een deeltje dat op het membraan en 1 tot deeltjes ligt in het midden van de ruggengraat Right. Wordt een willekeurige verdeling (roze) gegenereerd met behulp van random number generator macro (Microsoft Excel) in een spine-vormig oppervlak. Ng (blauw) geeft de hoogste piek verdeling dichtbij de plasmamembraan. Scale bar, 200 nm. Dit histogram werd oorspronkelijk gepubliceerd in het EMBO Journal 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol hebben we aangenomen Phend en Weinberg methode voor de hersenen en het ruggenmerg weefsels om dendritische spines in rat hippocampale slice culturen te bestuderen. Dendritische spines in de hippocampus CA3-CA1 gebied zijn delicate structuren met een grote verscheidenheid aan eiwitten die een belangrijke rol spelen bij het reguleren van neuronale functies. De onderhavige methode biedt een evenwicht te bereiken verbeterde antigeniciteit met behoud van goede conservering ultrastructurele (Figuur 2A), waardoor redelijke labelingsefficiëntie en goede reproduceerbaarheid nuttig voor het karakteriseren van de verdeling van specifieke antigenen in de wervelkolom. Hier wordt gelabeld met Ng 10 nm colloïdaal goud. We gekwantificeerd het goud etikettering patroon van Ng die bijgedragen tot de rol te begrijpen in synaptische functie (figuur 2B) 8 genereren.
Kwantitatieve analyse van immunogold kan op verschillende manieren 11-13 14-17.
De vervanging van osmium door TA, UA, en p-fenyleendiamine (PPD) in deze benadering sterk verbeterd de gevoeligheid van antigeen in neuronale weefsels ten opzichte van eerdere methoden 7. Het gebruik van formaldehyde en glutaaraldehyde verzekert structurele conservering en behoud van kleine oplosbare antigenen zoals aminozuren. Epoxy gebaseerde harsen, dan acrylaat harsen, betere stabiliteit voor het inbedden in de elektronenbundel zonder antigeniciteit 7. In vergelijking met standaard protocol osmium, Phend et al.. </ Em> had aangetoond dat TA, UA en PPD ook structurele conservering (zie figuur 1 van de oorspronkelijke Phend paper) 7 verbeterd en dat efficiënte immunokleuring gevonden voor verschillende eiwitten waaronder substantie P, calcitoninegen-gerelateerde peptide (CGRP), AMPA receptor subunit 1 (GluA1) en gamma-aminoboterzuur (GABA) 7. Deze bevindingen tonen het vermogen van deze procedure verschillende eiwitten te bestuderen in neuronale weefsels. Een ander voordeel van deze methode is dat TA, UA en PPD zijn gemakkelijk te bereiden en te behandelen, en vormen veel kleiner gevaarlijke risico's dan osmium, die zeer vluchtig en zeer vergiftig bij inademing en contact met de huid.
Een beperking van deze methode is dat hoewel het behouden en behoudt kleine antigenen zoals aminozuren, niet vertoont verbeterde immunokleuring voor deze moleculen in vergelijking met conventionele osmium behandeling. Het voordeel van de zware metalen platina-chloride in stru behoudencture en immunoreactiviteit verbeteren lijkt ook beperkt tot het ruggenmerg, om redenen die niet volledig begrepen 7. Hoewel de osmium-vrije methode verbetert antigeniciteit en delen contrast, lijkt het niet goed te werken voor het behoud van andere structuren zoals presynaptische blaasjes (zie figuur 2). Bovendien had Phend et al.. Opgemerkt dat het ontbreken van osmium ook tot verminderde myeline conservering, TA heeft beperkte doorlaatbaarheid in de intracellulaire componenten te behouden membranen 7. Om deze redenen kan bevriezen werkwijzen voor prepareren beter alternatieven als ultrastructurele behoud van de belangrijkste zorg. Ultrarapid bevriezing van specimen kan het behoud van moleculen in een meer natuurlijke wijze 18 zonder potentiële artefacten die kunnen worden ingevoerd door het gebruik van chemische fixeermiddelen.
Voorafgaand aan het uitvoeren van de EM, de aanwezigheid vanhet antigeen in het monster worden bevestigd door manieren, zoals Western blot analyse. Zoals met alle immunokleuring studies, correcte interpretatie van de gegevens gebaseerd op het gebruik van geschikte, specifieke antilichamen. Sterk gezuiverde monoklonale antilichamen moeten altijd worden gebruikt indien beschikbaar. Controle-experimenten zijn essentieel om de gegenereerde patroon labeling door de specifieke interactie tussen het primaire antilichaam en het immunogeen. De specificiteit van de etikettering kan worden getest door het uitvoeren van negatieve en positieve controles. Bijvoorbeeld, in een negatieve controle kan het primaire antilichaam worden vervangen door een onafhankelijke controle serum van niet-immune IgG, zonder andere stappen in de kleuringsprotocol. Ten tweede kan een eiwit dat aanwezig is in een cel compartiment in andere niet worden gebruikt als een positieve controle. Bijvoorbeeld bij de glutamaterge synapsen, PSD-95 is een postsynaptische marker, terwijl GAP-43 is vooral aanwezig in de presynaptische terminal 19-22.Indien voor de etikettering wordt gezien als primair antilichaam wordt weggelaten of in compartimenten waar het eiwit wordt bekend, niet aanwezig te zijn, dan is de etikettering is niet specifiek.
Zodra de specificiteit van primaire antilichaam wordt uitvoerig getest, moet men zich ervan bewust dat de monsters met een goede etikettering niet moet veel samenklontering vertonen of overmatige gouddeeltjes hebben op de achtergrond, waar geen weefsel aanwezig is. Als de hoeveelheid goud te hoog of te laag is, het niveau of de duur van blokkering en de concentratie van antilichaam daarvan. Maunsbach en Afzelius bieden een aantal uitstekende voorbeelden en tips voor immunokleuring 23.
Goede structurele bewaren van de monsters kan elimineren artefacten die kunnen interfereren met morfologie en verwarren de interpretatie van de gegevens. Vandaar de superieure bescherming van structuren geïllustreerd door deze methode maakt deze techniek voor een aantal biologische weefsels name wanneer delicate structuren kunnengemakkelijk vervormd of vernietigd tijdens monster verwerking. Dus naast organotypische hippocampale plakken, kan deze methode ook enorm waardevol voor andere neuronale preparaten waaronder acute hersencoupes en primaire neuronale kweken. Organotypische hippocampale plakken gemakkelijk wijzigbaar behandelcentra en expressie van eiwitten door virale infectie, die kan worden toegepast voor het bestuderen van hippocampale synaptische plasticiteit. Deze werkwijze is ook nuttig om de effecten van verschillende experimentele condities op antigeen distributie of lokalisatie in het cellichaam, dendrieten of dendritische uitsteeksels onderzoeken. Bovendien colloïdaal goud met grootten van 6, 10, 15 of 25 nm zijn, waardoor mogelijk om meerdere labeling zonder overlap. Wij geloven dat het voordeel van verbeterde antigeniciteit flexibiliteit van probes en reproduceerbaarheid van immunogoud labeling het vermogen van deze techniek verschillende antigenen onderzoek tonen. Het is mogelijk useful de lokalisatie en distributie van receptoren, receptor-interagerende proteïnen, transporter, ionenkanalen en vele anderen in verschillende hersenweefsel zoals de cortex, thalamus, cerebellum en bulbus olfactorius karakteriseren.
Kortom, het huidige protocol van een osmium-vrij, na inbedding immunogold etikettering van rat hippocampale slice culturen is een waardevol instrument om de verschillende antigenen te bestuderen binnen dendritische spines. De potentiële toepasbaarheid van deze methode in andere delicate centrale zenuwstelsel weefsels zal zeer nuttig zijn om de ultrastructurele kenmerken van verschillende belangrijke moleculen te onderzoeken en te helpen begrijpen van hun rol in de biologische functies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Matthew Florence bedanken voor de voorbereiding van de hippocampus slice culturen. Dit werk werd ondersteund door subsidies van US National Institute on Aging en Alzheimer's Association te NZG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 x 15 mm polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Disposable scalpel | EXELINT | 29552 | |
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| 10 nm Goat-anti-rabbit gold | Electron Microscopy Sciences | 25108 | |
| Anti-Neurogranin antibody | Millipore | AB5620 | |
| 100% Picric acid | Electron Microscopy Sciences | 19550 | |
| 96% Paraformaldehyde | Acros Organics | AC41678-0030 | |
| 25% Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma | G5882 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
| p-Phenylenediamine | Sigma | P6001 | |
| Platinum (IV) chloride | Sigma | 379840 | |
| Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 |
References
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Stirling, J. W. Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques. J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).
- Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).
- Berryman, M. A. Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).
- Akagi, T., et al. Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses. J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).
- Stirling, J. W. Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution. J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).
- Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).
- Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. Embo J. 28, 3027-3039 (2009).
- Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
- Zhong, L., Gerges, N. Z. Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation. PloS one. 7, e41275 (2012).
- Horisberger, M., Vauthey, M. Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin. Histochemistry. 80, 13-18 (1984).
- Bendayan, M. A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology. Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).
- Racz, B., Weinberg, R. J. Spatial organization of coflin in dendritic spines. J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).
- Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections. J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).
- Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5'-nucleotidase in frozen thin sections. Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 Forthcoming.
- Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. [Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency]. Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).
- Kehle, T., Herzog, V. Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation. Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).
- Bozzola, J. R., Lonnie, Ch. 2. Electron Microscopy. 30, Second Edition, Jones and Bartlett Publishers. (1992).
- Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
- Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses. J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).
- Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism. Brain Research. 328, 381-385 (1985).
- Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity. Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).
- Maunsbach, A. A., Bjorn, Ch. 16. Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , Academic Press. 383-426 (1999).
