Summary
Lokalisering og fordeling av proteiner gir viktig informasjon for å forstå deres cellulære funksjoner. Den overlegne romlig oppløsning av elektronmikroskopi (EM) kan brukes til å bestemme den subcellulære lokalisering av en gitt antigen etter immunhistokjemi. For vev i sentralnervesystemet (CNS), bevare strukturell integritet samtidig opprettholde antigenisitet har vært spesielt vanskelig i EM studier. Her har vi adoptert en prosedyre som har blitt brukt til å bevare strukturer og antigener i CNS å studere og karakterisere synaptiske proteiner i rotte hippocampus CA1 pyramidale nevroner.
Abstract
Immunoelectron mikroskopi er et kraftig verktøy for å studere biologiske molekyler på subcellulære nivå. Antistoffer koblet til elektron-tette markører som kolloidalt gull kan avsløre lokalisering og fordeling av spesifikke antigener i forskjellige vev 1. De to mest brukte teknikkene er pre-embedding og post-embedding teknikker. I pre-embedding immunogold-elektron mikroskopi (EM) teknikker, må vev permeabilized å tillate antistoff penetrasjon før det er innebygd. Disse teknikkene er ideelle for å bevare strukturer, men dårlig penetrasjon av antistoffet (ofte bare de første få mikrometer) er en betydelig ulempe 2. Post-innebygging merking metoder kan unngå dette problemet, fordi merking foregår på deler av faste vev der antigener er lettere tilgjengelig. Gjennom årene har en rekke modifikasjoner forbedret post-innebygging metoder for å forbedre immunoreaktivitet og for å bevare ultrastructure Tissue fiksering er en viktig del av EM studier. Fiksativer kjemisk tverrbinde de makromolekyler å låse vevsstrukturer på plass. Valget av bindemiddel påvirker ikke bare strukturelle bevaring, men også antigenisitet og kontrast. Osmiumtetroksyd (OSO 4), formaldehyd og glutaraldehyd har vært standard fiksativer i flere tiår, herunder for sentralnervesystemet (CNS) vev som er spesielt utsatt for strukturell skade under kjemiske og fysisk behandling. Dessverre er OSO 4 svært reaktiv og har vist seg å maskere antigener 6, som resulterer i dårlig og utilstrekkelig merking. Alternative tilnærminger for å unngå kjemisk fiksering inkluderer frysing av vev. Men disse teknikkene er vanskelig å utføre og krever kostbar instrumentering. Å ta opp noen av disse problemene og for å forbedre CNS vev merking, Phend et al. erstattet OSO 4 med uranyl acetate (UA) og tannic ACId (TA), og hell innført ytterligere modifikasjoner for å forbedre følsomheten av antigen deteksjon og strukturell bevaring i hjernen og ryggmargen vev 7. Vi har vedtatt dette osmium-free post-embedding metode for å rotte hjernevev og optimalisert immunogold merking teknikk for å oppdage og studere synaptiske proteiner. Vi presenterer her en metode for å bestemme lokalisering av ultrastructural synaptiske proteiner i rotte hippocampus CA1 pyramidale neuroner. Vi bruker organotypic hippocampus dyrkede skiver. Disse skivene opprettholde trisynaptic krets av hippocampus, og således er spesielt nyttige for å studere synaptisk plastisitet, en mekanisme allment antatt å underlie læring og hukommelse. Organotypic hippocampus stykker fra postnatal dag 5 og 6 mus / rotteunger kan fremstilles som beskrevet tidligere 8, og er spesielt nyttige til akutt knockdown eller overuttrykker eksogene proteiner. Vi har tidligere brukt denne protokollen til characterize neurogranin (Ng), en neuron-spesifikk protein med en avgjørende rolle i å regulere synaptic funksjon 8,9. Vi har også brukt den til å karakterisere ultrastructural lokalisering av calmodulin (CAM) og Ca 2 + / CAM-avhengig protein kinase II (CaMKII) 10. Som illustrert i resultatene, tillater denne protokollen god ultrastructural bevaring av dendrittiske spines og effektiv merking av Ng som hjelper karakterisere sin fordeling i ryggraden 8. Videre kan fremgangsmåten som er beskrevet her har bred anvendelighet i å studere mange andre proteiner involvert i nevronale funksjoner.
Protocol
1. Fiksering
Fiksativ er kreftfremkallende, hansker og håndtere fiksativ i en avtrekkshette. Ikke annet er angitt, er alle inkubasjoner gjort på is og alle løsninger bør filtreres før bruk. Bruk elektron mikroskopi-grade reagenser.
Dag 1
- Etter eksperimentelle betingelser (f.eks viral injeksjon, narkotikabehandling), plasserer membranen med organotypic hippocampus stykker i en 60 x 15 mm polystyren petriskål inneholdende iskald 0,1 M fosfat-buffer (Sørensens fosfatbuffer), pH 7,3. Tilsett 1 - 2 ml av 0,1 M fosfatbuffer direkte på toppen av skivene for å holde dem kaldt.
KRITISK STEP: Bruk alltid nylagde buffere og feste. Kontroller pH av buffer er innen ønsket område. En unnlatelse av å gjøre dette kan skade cellulære strukturer.
- Å isolere CA1 delfelt av stykket, bruker du endisponibel skalpell å forsiktig skjære over skive ved siden DG, parallelt CA1 cellelaget (Figur 1). Deretter kuttet de resterende stykke vertikalt for å fjerne CA3 delfelt og subiculum. Skjær et hjørne av stykket til å identifisere den øvre overflate av vevet.
MERK: I tilfelle ingen virus levering av protein av interesse er nødvendig, kan hele vev skive fastsettes etter at media er fjernet med en mild rens av iskald buffer. Dette blir så fulgt ved å kutte ut CA1.
KRITISK STEP: Hold styr på oversiden av vev for at riktig seksjonering av ristene senere.
- Forsiktig fjerne vevet fra membranen ved hjelp av baksiden av skalpellen. Bruk en Pasteur-pipette for å forsiktig overføre vevet til en 12-brønns plate som inneholder 0,1 M fosfatbuffer.
- Fjern buffer i brønnen fra platen og tilsett 500 & mu; l - 1 ml iskald fiksativ (pH 7,3) består av følgende: 0,1% Picric syre, 1% paraformaldehyd, og 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffer. Inkuber i 2 timer ved 4 ° C.
MERK: Picric syre kan være eksplosiv når den er tørr. Hold det fuktet med vann i en beholder tett lukket. Oppbevar på et tørt og godt ventilert sted.
- Fjern fiksativ fra brønnen og vask prøvene 3 ganger (20 min hver) i 0,1 M fosfatbuffer.
- Inkuber i 40 min i 1% garvesyre (w / v) i 0,1 M maleat buffer, pH 6,0.
- Skyll to ganger (20 minutter hver) i maleat buffer.
- Inkuber i 40 min i 1% uranyl acetat (w / v) i maleat buffer i mørket. Uranyl acetate er følsom for lys og er radioaktive. Dekk begerglasset med Parafilm når oppløsning og lagre ubrukt buffer i mørke ved 4 ° C.
- Skyll to ganger (20 minutter hver) i maleat buffer.
- Inkuber i 20 min i 0,5% platina kloride (w / v) i maleat buffer.
- Skyll to ganger (20 minutter hver) i maleat buffer. Oppbevar prøvene ved 4 ° C til de er klare for videre behandling.
2. Dehydrering og Embedding
Propylenoksyd er kreftfremkallende. Unngå damp ved å arbeide med det i et avtrekksskap. Bruke absolutte, 100% ren etanol som inneholder ingen spor av vann. Fortynne absolutt etanol for å produsere ulike konsentrasjoner for dehydrering.
Dag 2
- Inkuber i 5 min i 50% etanol og deretter i 5 min i 70% etanol.
- Inkuber i 15 min i nylagde 1% p-phenylenediamine (PPD) i 70% etanol.
- Skyll tre ganger i 70% etanol.
- Inkuber i 5 min i 80% etanol og deretter i 5 min i 95% etanol.
- Inkuber i 100% etanol to ganger 5 min hver.
- Forbered hetteglass med skrulokk og sørge for at de er rene og helt tørre. Overføre skiver til hetteglass ogmerke hvert hetteglass enkelt og tydelig.
- Inkuber i 5 min i 1:1 etanol: propylenoksyd.
- Inkuber i 100% propylenoksyd to ganger 5 min hver.
- Legg harpiks (Epon) til hver ampulle for å gjøre en 1:1 blanding med propylenoksyd. Bland forsiktig i 2 timer. Ikke rist hetteglasset for strengt for å hindre bobler som kan forstyrre innebygging.
- Legg harpiks å lage en 3:1 blanding med propylenoksyd, og bland i 2 timer.
- Overføring til 100% harpiks og inkuber O / N.
Dag 3
- Sandwich prøver mellom strimler av aclar plast og kur for 24 timer ved 60 ° C.
3. Seksjonering og Montering på Rister
Dag 4
- Skjær semi-tynne (0,5 mikrometer) seksjoner og flekken med 1% toluidinblått + 1% boraks å bestemme riktig retning av prøver.
- Skjær supertynn seksjoner (60 nm) og montere på nikkel rutenett, en seksjon per rutenettet.
4. Immunhistokjemi
Alle buffere og vann bør filtreres før bruk.
Dag 5
- Plasser en dråpe (~ 50 ul) av 1% Tween-20/phosphate buffer (T / PB), pH 7,5, på et stykke rent Parafilm på et flatt underlag. Forsiktig plukke opp rutenettet med rene pinsett av kanten og flyte den på bufferen, delen ned, og inkuber i 10 min ved RT.
- Drenere overflødig væske fra nettet ved å plassere delen siden opp på filterpapir og deretter flyte på 50 mM glycin i T / PB i 15 min ved RT.
KRITISK skritt: å unngå overdreven 'overhenget' av løsninger fra en løsning dråpe til den neste under inkubasjoner, drenere overflødig væske ved forsiktig berører kanten av risten på # 1 filterpapir mellom hver løsning endring. Også fjerne noen løsning fanget mellom armene til EM tang holder rutenettet ved forsiktig wicking med en snev av filter papir mellom tang armene mens ensuring delene ikke tørke helt ut.
- Tørk rutenettet med filterpapir og deretter flyte på blokkering oppløsning inneholdende 2,5% BSA og 2,5% serum fra dyr av sekundært antistoff i T / PB i 30 minutter ved RT.
- Inkuber med primære antistoff (i T / PB) ved RT eller O / N ved 4 ° C. Den optimale tid og temperatur av inkubasjon, samt antistoffkonsentrasjon, trenger å være eksperimentelt bestemt.
- Vask rutenettet tre ganger (2 min hver) med T / PB.
- Inkuber med sekundært antistoff (1:20 anti-kanin eller anti-mus koblet til 10 nm gull) i 1 time ved RT.
- Vask tre ganger (2 min hver) med T / PB.
- Postfix med 2% glutaraldehyd i T / PB i 5 min.
- Vask tre ganger (2 min hver) med T / PB og deretter tre ganger (2 min hver) med filtrert vann.
- Inkuber med 2% uranyl acetat i vann i 10 min.
Når rutenettet flekker, utarbeide en CO 2-fri kammer av placinga stykke Parafilm i sentrum av en glass petriskål. Deretter plasserer 4-6 pellets av NaOH i parabolen rundt Parafilm å absorbere CO 2 i luften. Hold toppen stengt i noen minutter. Bruk en Pasteur-pipette og raskt overføre et lite volum av Reynold ledende citrate løsning på Parafilm i glasset petriskål. Åpne toppen akkurat nok til å sette inn Pasteur pipette for å minimere gjeninnføring av CO 2 inn i kammeret.
MERK: For å gjøre Reynold ledende citrate løsning, koke 100 ml avionisert vann i en mikrobølgeovn og la avkjøle i en lufttett beholder. I en 50 ml målekolbe med stopper, blanding 1,33 g bly nitrat, 1,76 g natriumsitrat og 30 ml av kokt vann ved å riste kraftig i 1 min. Deretter riste midlertidig i 30 min. Til denne skyet løsningen, tilsett 8 ml av 1 M natriumhydroksyd og sakte invertere kolben et par ganger. Løsningen vil bli klart. Bring løsningen til 50 ml med den kokte water. Oppbevar løsningen tett tillukket. Hvis bunnfallet vises, kaste og lage en ny.
- I tre mindre kanner forberede varm, nykokt avionisert vann. Vask av uranyl acetate ved å dyppe rutenettet i første begerglass og forsiktig virvle det rundt i 30 sek. Gjenta dette trinnet i de andre to begerglassene.
- Åpne toppen av glasset petriskål akkurat nok til å plassere rutenettet på dråpe Reynold ledende citrate løsning. Hvis mulig, bære en maske mens de gjør dette for å unngå å puste på bly-citrat og å hindre dannelse av bunnfall. Inkuber i 10 min.
- Åpne toppen akkurat nok til å fjerne rutenettet. Unngå å puste på ledningen citrate. Vask rutenettet tre ganger ved å dyppe den sekvensielt i tre begerglass med varmt, nykokt destillert vann. La rutenettet tørke på et stykke filterpapir, seksjon opp. Prøven er nå klar for den elektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2b viser et eksempel på fordeling av endogene Ng molekyler i dendrittiske spines av CA1 hippocampus pyramidale nevroner. Nikkel gitrene supertynt (60 nm) vev inneholdende CA1 regionen av hippocampus (som sett i figur 2A) ble dekket i en% T / PB, 50 mM glycin, deretter blokkert med 2,5% BSA og 2,5% serum før inkubasjon med anti -Ng antistoff. Etter vasking med T / PB ble tavler deretter dekket i anti-kanin sekundært antistoff koplet til 10 nm gull. Til slutt ble rutenett vasket med T / PB og postfixed med 2% glutaraldehyd etterfulgt av 2% uranyl acetat og Reynold ledende citrate flekker å forbedre kontrasten. Venstre, representative elektron mikrografer viser asymmetriske synapser. Identifikasjon av den postsynaptiske kammeret lettes av elektron-tette PSD (arrow hode) og veldefinert plasmamembran. Rett, den korteste avstand mellom hvert Ng (piler) og plasmamembranen neirmalized til radius av ryggraden. Ng molekyler i ryggraden (men ikke på PSD) viser fortrinnsrett lokalisering til plasmamembranen. Dette histogrammet ble opprinnelig publisert i EMBO Journal 8.
Figur 1. Skjematisk av CA1 området disseksjon fra hippocampus skive kulturer. Etter eksperimentell behandling til stykket, f.eks legemiddelbehandling eller viral infeksjon, ble membranen inneholdende stykke plasseres i iskald fosfatbuffer. Stykket ble først kuttet horisontalt under dentate gyrus (DG), parallelt med CA1 cellelaget. CA1 delfelt ble så isolert ved å fjerne CA3 delfelt og subiculum (sub). Å bidra til å identifisere den øvre overflate av CA1, ble et hjørne skåret for å orientere vev (i dette tilfellet den øvrehøyre hjørne).
Figur 2. Immunogold merking av neurogranin på CA1 synapser i organotypic hippocampus skive kulturer. (A) transmisjonselektronmikroskop mikrografer som viser rotte hippocampus CA1 området og synapser. Dendritter (d) i CA1 pyramidale nevroner er lett skjelnes. Identifisering av asymmetriske synapser mellom aksonal terminal 9t) og dendrittiske spines (s) er tilrettelagt av tilstedeværelsen av postsynaptiske tettheten (PSD, pilspiss) og veldefinert plasmamembranen. (B) Fordeling av neurogranin (Ng) i dendrittiske spines. Venstre, transmisjonselektronmikroskop mikrografer viser immunogold-EM merking av nG (piler). For kvantifisering, avstanden av hver gull partikkel (eksklusiv de på PSD, pilhodet) fra plasma membrane er normalisere (x-aksen) til radius av ryggraden. Dermed tilsvarer 0 til en partikkel liggende på membranen og en til en partikkel liggende på midten av ryggraden. Høyre, en tilfeldig fordeling (rosa) genereres ved hjelp av et tilfeldig tall generator makro (Microsoft Excel) i en ryggrad-formet overflate. Ng (blå) viser den høyeste toppen fordelingen nær plasmamembranen. Skala bar, 200 nm. Dette histogrammet ble opprinnelig publisert i EMBO Journal 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen, har vi innført Phend og Weinberg metode for hjernen og ryggmargen vev for å studere dendrittiske spines i rotte hippocampus skive kulturer. Dendrittiske spines i hippocampus CA3-CA1 området er skjøre strukturer som inneholder et stort utvalg av proteiner som spiller viktige roller i å regulere nevrale funksjoner. Den presenterte fremgangsmåte gir et balansert tilnærming for å oppnå forbedret antigenisitet samtidig opprettholde god ultrastructural bevaring (figur 2A), som tillater rimelig merking effektivitet og god reproduserbarhet nyttige for å karakterisere fordelingen av spesifikke antigener innenfor ryggraden. Her merket vi Ng med 10 nm kolloidalt gull. Vi kvantifisert gullet til å generere merking mønster av Ng som bidro til å forstå sin rolle i synaptic funksjon (figur 2B) 8.
Kvantitativ analyse av immunogold kan gjøres på en rekke måter 11-13 14-17.
Utskifting av osmium av TA, UA, og p-fenylendiamin (PPD) i denne tilnærmingen kraftig forbedret følsomhet antigenpåvisning i neuronal vev sammenlignet med tidligere metoder 7. Bruken av formaldehyd og glutaraldehyd sikrer strukturell bevaring og retensjon av små løselige antigener som aminosyrer. Epoxy-baserte harpiks, i stedet akryl plast harpiks, gi bedre stabilitet for innebygging under elektronstrålen uten at antigenisitet 7. Sammenlignet med standard osmium protokollen, Phend et al. </ Em> hadde vist at TA, UA, og PPD også forbedret strukturell bevaring (se Figur 1 av den opprinnelige Phend papiret) 7, og at effektiv farging ble funnet for flere proteiner inkludert substans P, kalsitonin gen-relatert peptid (CGRP), AMPA reseptoren subenhet 1 (GluA1) og gamma-aminosmørsyre (GABA) 7. Disse funnene viser at evnen til denne fremgangsmåten for å studere forskjellige proteiner i neuronal vev. En annen fordel med denne metoden er at TA, UA og PPD er enkle å tilberede og håndtere, og utgjør mye mindre farlige risiko enn osmium, som er svært volatile og svært giftig ved innånding og hudkontakt.
En begrensning ved denne metoden er at selv om det bevarer og beholder små antigener som aminosyrer, det viser ikke forbedret immunolabeling for disse molekylene i forhold til konvensjonelle osmium behandling. Fordelen med den tunge metall platina klorid å bevare structure og for å forsterke immunreaktivitet også synes å være begrenset til ryggmargen, av grunner som ikke er helt forstått 7. Selv om osmium-fri metode forbedrer antigenisitet og vev kontrast, ser det ikke ut til å fungere godt for bevaring av andre strukturer som presynaptiske vesikler (se figur 2). I tillegg hadde Phend mfl.. Observert at fravær av osmium også resulterte i redusert myelin bevaring, som TA har begrenset penetrability inn i intracellulære komponentene å bevare membraner 7. Av disse grunner, kan frysing metoder for prøven forberedelse være bedre alternativer hvis ultrastructural bevaring er den viktigste bekymring. Ultrarapid frysing av prøven tillater bevaring av molekyler i en mer naturlig måte 18, uten potensielle artefakter som kan bli introdusert ved bruk av kjemiske fiksativer.
Før gjennomføring av den EM, tilstedeværelse avantigenet i prøven bør bekreftes gjennom måter eksempel Western flekkanalyse. Som med alle immunolabeling studier, avhengig korrekt tolkning av data om bruk av hensiktsmessige, spesifikke antistoffer. Høyt renset monoklonale antistoffer bør alltid brukes hvis tilgjengelig. Kontrollforsøk er avgjørende for å sikre at merkingen mønster generert skyldes spesifikk interaksjon mellom det primære antistoff og immunogen. Spesifisiteten til merking kan bli testet ved å utføre negative og positive kontroller. For eksempel, i en negativ kontroll, kan det primære antistoff erstattes av en ikke-relatert kontrollserum av ikke-immun IgG, uten å endre andre trinn i farging protokollen. Sekund, kan et protein som er tilstede i en celle kupé men ikke i andre brukes som en positiv kontroll. For eksempel i glutamatergic synapser er PSD-95 en postsynaptisk markør mens GAP-43 er primært tilstede i den presynaptiske terminalen 19-22.Hvis merking er sett når primære antistoff utelates eller i avdelinger hvor proteinet er kjent ikke å være til stede, deretter merking er ikke bestemt.
Når spesifisitet av primær antistoff grundig testet, bør man være oppmerksom på at prøver med god merking ikke skal fremvise mange klumper eller har overdreven gull partikler i bakgrunnen der ingen vev er til stede. Hvis mengden av gull er for høy eller for lav, justere nivået eller varighet av blokkering og konsentrasjonen av antistoff tilsvarende. Maunsbach og Afzelius gi noen gode eksempler og tips for immunolabeling 23.
God strukturell bevaring av prøver kan eliminere gjenstander som kan forstyrre morfologi og forvirre tolkningen av data. Derav, overlegne bevaring av strukturer illustrert ved denne metoden denne teknikken anvendes på en rekke av biologiske vev spesielt der ømfintlige strukturer kan værelett forvrengt eller ødelagt under utvalgets behandling. Derfor, i tillegg til organotypic hippocampus stykker, kan denne metoden også være enormt verdifullt for andre neuronale preparater inkludert akutt hjernen skiver og primære nevronale kulturer. Organotypic hippocampus stykker er lett amendable til legemiddelbehandling, og uttrykket av proteiner gjennom viral infeksjon, som kan være aktuelt for å studere hippocampus synaptisk plastisitet. Denne metoden er også nyttig å undersøke effektene av forskjellige eksperimentelle betingelser på antigen distribusjon eller lokalisering i cellen kroppen, dendritter eller dendrittiske spines. Videre kolloidale gullpartikler med størrelser på 6, 10, 15 eller 25 nm som er tilgjengelige, noe som gjør det mulig å utføre flere merking med ingen overlapping. Vi tror at fordelen av forbedret antigenisitet, fleksibilitet av prober og reproduserbarheten immunogold merking demonstrere makt denne teknikk for å studere en rekke antigener. Det er potensielt useful å karakterisere lokalisering og fordeling av reseptorer, reseptor-samhandlende proteiner, Transporter, ionekanaler og mange andre i ulike hjernevev inkludert cortex, thalamus, cerebellum og luktelappen.
Oppsummert er den nåværende protokollen av en osmium-fri, post-embedding immunogold merking av rotte hippocampus skive kulturer et verdifullt verktøy for å studere ulike antigener innen dendrittiske spines. Den potensielle anvendelse av denne metoden i andre delikate sentralnervesystem vev vil være svært nyttig å undersøke ultrastructural egenskapene til ulike viktige molekyler og for å hjelpe å forstå deres rolle i biologiske funksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Matthew Florence for utarbeidelse av hippocampus skive kulturer. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra US National Institute on Aging og Alzheimers Association til NZG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 x 15 mm polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Disposable scalpel | EXELINT | 29552 | |
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| 10 nm Goat-anti-rabbit gold | Electron Microscopy Sciences | 25108 | |
| Anti-Neurogranin antibody | Millipore | AB5620 | |
| 100% Picric acid | Electron Microscopy Sciences | 19550 | |
| 96% Paraformaldehyde | Acros Organics | AC41678-0030 | |
| 25% Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma | G5882 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
| p-Phenylenediamine | Sigma | P6001 | |
| Platinum (IV) chloride | Sigma | 379840 | |
| Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 |
References
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Stirling, J. W. Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques. J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).
- Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).
- Berryman, M. A. Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).
- Akagi, T., et al. Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses. J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).
- Stirling, J. W. Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution. J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).
- Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).
- Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. Embo J. 28, 3027-3039 (2009).
- Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
- Zhong, L., Gerges, N. Z. Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation. PloS one. 7, e41275 (2012).
- Horisberger, M., Vauthey, M. Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin. Histochemistry. 80, 13-18 (1984).
- Bendayan, M. A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology. Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).
- Racz, B., Weinberg, R. J. Spatial organization of coflin in dendritic spines. J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).
- Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections. J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).
- Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5'-nucleotidase in frozen thin sections. Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 Forthcoming.
- Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. [Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency]. Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).
- Kehle, T., Herzog, V. Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation. Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).
- Bozzola, J. R., Lonnie, Ch. 2. Electron Microscopy. 30, Second Edition, Jones and Bartlett Publishers. (1992).
- Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
- Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses. J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).
- Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism. Brain Research. 328, 381-385 (1985).
- Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity. Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).
- Maunsbach, A. A., Bjorn, Ch. 16. Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , Academic Press. 383-426 (1999).
