Summary
우리는 높은 처리량 로봇 형질과 집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석을 사용하여 전사 규제를 식별하기위한 신속하고 저렴한 검사 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 빠른 속도로 유전자의 수천을 위해 직접 나란히 기능 데이터를 생성하고, 관심의 유전자를 대상으로 쉽게 변경 가능합니다.
Abstract
우리는 α-시누 클레인 파킨슨 질환과 관련된 유전자의 전사 레귤레이터를 식별하기 위해 신속하고 저렴하게 높은 처리량 선별 프로토콜을 제시한다. 293T 세포는 일시적으로 한 유전자 당 잘 마이크로 포맷, 함께 루시퍼 라제 리포터 플라스미드로, 배열 ORF 식 라이브러리에서 플라스미드로 형질됩니다. 반딧불 루시 페라 제 활동은 내부 통제 구조 (레 닐라 루시퍼를 연출 HCMV 프로모터)의 표현에 표준화 된 알파 synuclein의 전사,시 각 라이브러리 유전자의 효과를 결정하기 위해 48 시간 후 정량된다. 이 프로토콜은 96 - 웰 형식으로 무균 액체 처리를 수행하는 생물 안전 캐비닛에 동봉 된 벤치 탑 로봇에 의해 촉진된다. 우리의 자동화 된 형질 전환 프로토콜은 높은 처리량 렌티 바이러스 라이브러리 생산 conju 고유 라이브러리 플라스미드 많은 수의 트리플 형질을 필요로하는 다른 기능 검사 프로토콜에 쉽게 적응할 수있다도우미 플라스미드의 일반적인 세트 nction. 우리는 또한 저렴하고 검증 된 대안을 제시 PTC124, EDTA, 사전 레 닐라 루시퍼의 측정에 반딧불 루시 페라 제의 활동을 억제하는 피로 인산을 사용 시판, 이중 루시퍼 라제 시약을합니다. 이러한 방법을 사용하여, 우리는 7,670 인간의 유전자를 검사 및 알파 synuclein의 68 레귤레이터을 확인했다. 이 프로토콜은 관심의 다른 유전자를 대상으로 쉽게 변경 가능합니다.
Introduction
키 유전자 규제 요소와 그들에 작용하는 요소를 식별 할 수있는 능력은 다양한 생물학적 과정의 탐사를 위해 필수적입니다. 그러나, 특정 신경 세포의 집단으로 희귀 한 종류의 세포에서 유전자의 발현을 조절 요소를 식별, 도전하실 수 있습니다. 여기서, 우리는 α-시누 클레인 (SNCA)의 신규 한 전사 레귤레이터를 식별하기위한 프로토콜을 제시, 파킨슨 질환과 연관 substantianigra에서 도파민 뉴런에서 발현 유전자의 중뇌 compacta 영역 모양체. 우리는 293T 세포에서 α-시누 클레인의 발현을 재조하기 위해 높은 처리량, 이중 - 루시퍼 라제, 시험 관내 리포터 스크린을 사용하여이를 달성. 알파 synuclein 촉진제 우선 개똥 벌레 루시퍼 라제 유전자를 포함하는 리포터 플라스미드로 클로닝된다. 구성 적으로 활성화 된 프로모터의 조절하에 레 닐라 루시퍼 라제를 함유하는 시판되는 플라스미드는 내부 제어로서 기능한다. 살전E 기자의 구조는 각이 잘 단일 라이브러리 플라스미드로 형질되도록, DNA 발현 라이브러리에서 플라스미드와 마이크로 플레이트에 293T 세포에 공동 형질 전환됩니다. 48 시간, 각 리포터 대해 루시퍼 라제 활성을 듀얼 글로우 분석을 사용하여 순차적으로 측정 한 결과. 플레이트 기반 정상화 : (R 비율 F) 각 잘 레 닐라 루시퍼 활동 : 각 라이브러리 유전자에 대한 응답으로 알파 synuclein의 상대적 발현 반딧불의 비율로 유추됩니다.
이 프로토콜은 최소한의 인력 (1-2 명) 및 최소 비용 (마이크로 분석 당 약 3달러 시약 비용)를 사용하여 리포터 유전자를 전사 할 수있는 능력에 대한 유전자의 다수 (~ 주당 2,500)를 선별하는 기능을 제공한다. 유전자 조작에 불응 배양 신경 세포에서 공부하기 어려운 신경 세포의 유전자의 전사 규제 (예를 들어, 알파 - 시누 클레인)은,이 직접 기능 분석에서 나란히 비교 될 수있다. 우리는 우리에 포함프로토콜 우리가 통상적 인 방법 (토론 참조) 재배 할 때이 영역을 포함하는 플라스미드가 불안정한 것을 발견 이후 복제 및 α-synuclein의 프로모터를 포함하는 플라스미드의 성장을위한 자세한 방법. 우리는 또한 높은 처리량 분석을위한 상용 듀얼 루시퍼 라제 시약에 대한 저렴한 대안이 (가) 있습니다. 이 프로토콜은 쉽게 관심의 다른 규정 요소를, 또는 높은 처리량 과도 형질을 필요로하는 프로세스에 대상으로 적용 할 수 있습니다.
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Protocol
실험 개요는 그림 1을 참조하십시오.
1. 알파 synuclein 발기인을 포함하는 리포터 플라스미드를 준비
알파 synuclein 유전자 (그림 2)의 규정 요소는 인트론 2 ~ 3 상류 NACP (아밀로이드 펩티드의 비 베타 구성 요소) 디 뉴클레오티드 반복 서열 1,2에서 대략 10 킬로바이트, 스팬. 우리는이 지역의 일부를 포함 우리 기자의 구조. 우리는 성장이 필요한 특별한 절차 인트론 포함하는 플라스미드는, 아래에 설명 된대로 나타났습니다. 루시퍼 라제 플라스미드, pGL4.10 및 pGL4.75 (도 3), Promega 사에서 시판하고 종래의 분자 생물학 프로토콜을 사용하여 전달 될 수있다.
- 표 1의 제조법과 표 2의 프라이머를 사용한 PCR을 별도의 알파 synuclein 촉진제의 2 성분을 증폭한다.
- VERI기 PCR의 TE (트리스-EDTA)의 50 μL의 용출, 제품, QIAquick PCR 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 아가 로스 젤 및 청소에 제품. 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 용출 0.9 KB 조각을 저장합니다.
- 를 SacI 및 XhoI에, 전체 3.4 킬로바이트 PCR 단편의 양뿐만 아니라 pGL4.10 5 μg 다이제스트. 송아지 소장 알칼리 포스 파타 아제 (로슈)와 벡터를 처리하고 젤 PureLink의 빠른 젤 추출 키트 (Invitrogen 사)를 사용하여 정제.
- T4의 DNA 리가 제 (NEB)을 사용하여 단편 및 벡터를 결찰. 10 ㎕의 TE 버퍼에 용출 PureLink의 PCR 마이크로 키트 (Invitrogen 사)를 사용하여 완성 된 반응을 청소합니다.
- ElectroMAX Stbl4 능력 세포 (Invitrogen 사) 20 ㎕로 청소 연결 반응의 2 μl를 변환하고, 제조업체의 지침에 따라 electroporate. 90 분 동안 225 rpm에서 30 ° C의 배양기에서 흔들어. 100 ㎎ / ㎖의 암피실린을 포함하는 LB 플레이트에 2 볼륨을 확산하고 2 일 동안 30 ° C에서 알을 품다.
- 이쑤시개를 사용하여, TB 2 ㎖ (좋아요 국물)에 접종 4-6 작은 식민지를 선택합니다. 30 ° C의 셰이커 O / N. 이러한 미니 프렙 문화를 성장
- PureLink의 HiPure 플라스미드 미니 프렙 키트 (Invitrogen 사)를 이용하여 각각의 미니 프렙 배양 1.5 밀리리터부터 플라스미드 DNA를 정제 하였다.
- 을 BamHI과 minipreps을 소화하고 아가 로스 젤에 electrophorese. 올바른 클론 2.8 KB 4.9 KB의 조각을 생성한다.
- 신선한 LB (루리아 국물) 판의 정확한 복제에 남아있는 미니 프렙 문화를 Restreak 2 일 동안 30 ° C에서 성장한다.
- 작은 식민지를 선택하고 1.5 ML의 TB 스타터 문화를 접종. 30 ° C에서 O / N을 흔들어 스타터 문화가 포화 성장하게하지 마십시오.
- 데워진 TB 150 ㎖로 전체 스타터 문화를 희석하고 2 일 동안 30 ° C에서 흔들. 다음 단계로 진행하기 전에 복제가 replicati 중에 변형되지 않았 음을 확인하기 위해 추가로 미니 프렙 소화이 문화의 1.5 ML를 사용 에.
- PureLink의 HiPure 플라스미드 Maxiprep 키트 (Invitrogen 사)를 이용하여 나머지 배양 물로부터 플라스미드 DNA를 정제 하였다. 이 중간 플라스미드의 예상 수익률은 문화 150 ㎖ 당 50 ~ 150 μg이다.
- 단계 1.2에 얼어 0.9 KB 조각을 해동. 1.3 1.12에이를 KpnI 및 SacI로와 대신 소화, 중간 플라스미드에 0.9 KB 조각을 복제하는 단계를 반복합니다. 결찰, 선택, 변환, 상기와 같이 maxipreps에 성장. 을 BamHI로 소화 5.8 킬로바이트 및 2.8 킬로바이트의 조각을 얻을 수 있어야합니다. 이는 화면에 사용될 플라스미드이다.
2. 심사 293T 세포, 리포터 플라스미드 및 라이브러리 DNA를 준비
293T 세포는 처음 96 - 웰 플레이트에 접종하고 다음 날 형질 전환됩니다. 리포터 플라스미드 및 라이브러리 DNA를 96 - 웰 플레이트에 희석된다. 우리는 매사추세츠 종합 병원 (Massachusetts General Hospital에서 DNA 코어에서 형질 급 라이브러리 DNA의 판을 얻을= "_blank"를 얻을> dnacore.mgh.harvard.edu). 이 프로토콜은 293T 세포의 동일한 2 판 (그림 1)에 하나의 라이브러리 판을 transfects, 세포 따라서 2 판을 상영하는 각 라이브러리 플레이트에 접종해야한다.
참고 :이 루시 페라 제 분석에 방해가 각각 형질 동안 독성을 증가로, 빨간색 또는 항생제 페놀없이 미디어의 세포를 성장.
- 각 라이브러리 플레이트를 14 % FBS를 함유하는 DMEM에 1.5 × 105 세포 / ml의 농도로 재현 탁 트립신 293T 세포를 상영하는. 멸균 저수지 (Axygen)에 붓는다.
- 로봇 갑판에 저장, 2 명확한 바닥, 96 - 웰 플레이트 (코닝), 및 필터 피펫 팁의 상자 (애질런트)를 놓습니다. 물론 당 1.5 × 10 4 세포의 밀도, 두 플레이트의 각 웰에 세포를 100 μl를 분배.
- 동등한 있도록 낮은 램프 속도를 사용하여, 2 분간 50 XG에서 셀 플레이트를 원심 분리기각 웰에 걸쳐 세포 밀도. 37 품어 ° C와 10 %의 CO 2 O / N.
- 혈청이없는 배지에서 5 NG / μL로 개똥 벌레와 레 닐라 기자 플라스미드를 희석. 15 ML 원뿔 튜브 (부피 기준) 반딧불 레 닐라 플라스미드에 5:3 비율로 희석을 결합합니다.
- 각 웰에, 도서관 접시 당 17 μL, 플러스 2-10 μL 과잉 분배 96 - 웰 플레이트의 각 웰에 피펫은 결합 플라스미드.
- 위와 같이 형질 등급 DNA 라이브러리 판을 확보하고 독소가없는 물 33.9 NG / μL로 희석. 물론 당 최소 부피는 28 ㎕를해야한다.
3. 형질을 수행
화면의 2 일에서 기자 플라스미드 및 라이브러리 DNA를 293T 세포에 형질 전환됩니다.
- 각 라이브러리 플레이트를 들어, 폴리스티렌 튜브에 4.3 ㎖의 혈청이없는 미디어 (1시 40분 희석)와 RT Optifect (인비 트 로젠)의 107.5 μl를 섞는다. 5 RT에서 분, 그리고 알을 품다N 96 - 웰, 폴리스티렌 V-바닥 플레이트 (그레이 너)의 각 웰에 (라이브러리 판 기준) 44 μl를 분배.
- 희석 Optifect의 플레이트, 기자 플라스미드 (단계 2.5), 라이브러리의 DNA (단계 2.6), 로봇 갑판에 피펫 팁 상자를 놓습니다.
- 각각의 열망 사이의 5 μL의 에어 갭을 삽입 기자 플라스미드, 희석 Optifect 43 μL, 도서관 DNA의 26 μL의 17 μL를 대기음. 라이브러리 DNA 교차 오염을 방지하기 위해 마지막으로 발음해야한다. 새로운 폴리스티렌 V 바닥 판에 팁의 내용을 분배, 커버를 혼합, 지질 / DNA 복합체를 형성 할 수 있도록 20 분 동안 방치. 여러 라이브러리 판을 형질 경우, 피펫 팁 및 라이브러리 판을 교체하고 반복합니다.
- Optifect / DNA 혼합물 판을 발견하고 293T 세포의 2 판에 로봇 갑판에 놓습니다. 피펫 팁의 하나의 상자, 대기음 Optifect의 80 μl를 사용 : DNA 혼합물을 천천히 세포의 각 판에 40 μl를 분배. 트랜스 경우여러 라이브러리 판을 fecting, 모든 Optifect를 반복 : DNA 플레이트. 세포를 커버.
- 30 분 동안 1,200 XG에서 셀 플레이트를 원심 분리기. 커버 및 인큐베이터로 돌아갑니다.
- 4-6 시간 동안 세포를 품어. 이 부화하는 동안, 각 형질 라이브러리 판에 10 % FBS 및 10 ㎍ / ㎖의 시프로플록사신 (CellGro)를 포함하는 12 ML의 DMEM을 혼합하여 새로운 미디어를 준비합니다. 멸균 저수지에 신선한 미디어를 붓는다.
- 로봇 팁이 상자를 놓고 세포의 단판, 로봇 데크로 신선한 미디어, 폐기물 저장조를 포함하는 저장조. 대기음 100 세포에서 미디어 μL와 부분적으로 70 % 에탄올로 가득 폐기물 저장소에 분배. 신선한 팁, 새로운 미디어의 대기음 100 μl를 사용하여 천천히 세포에 분배. 세포의 모든 판에 대해 반복합니다.
- 48 시간 동안 인큐베이터에 번호판을 반환합니다.
4. 듀얼 루시 페라 제 분석 실험을 수행
화면의 4 일에,개똥 벌레와 레 닐라 루시퍼 라제 분석이 수행된다.
주 :. 표 3에 설명 된 것처럼 이중 루시퍼 라제 분석은 개똥 벌레 및 레 닐라 luciferases은 따라서 세포가 이전에 루시페라아제 활성을 측정에 용해되어야 분비되지 않으며,이 분석 완충제, 3X 반디 분석 완충액 및 3X 레 닐라 분석 완충액의 순차 첨가를 필요 . 반딧불 분석 버퍼 세포를 lyses과 반딧불 루시 페라 제를위한 기판을 제공 레 닐라 분석 버퍼는 반딧불 신호를 꺼 버리는와 레 닐라 루시퍼를위한 기판을 제공한다.
- 표 3에 설명 된대로 각 라이브러리 판의 경우, 원액의 3 배 개똥 벌레 분석 버퍼 8 ㎖를 준비하고, 96 - 웰 V-바닥 플레이트의 각 웰에 82 μl를 분배.
- 각 라이브러리 판의 경우에도 3 배 레 닐라 분석 버퍼의 12 ML을 준비하고 96 - 웰 V-바닥 플레이트의 각 웰에 122 μl를 분배. 양 옆으로 설정개똥 벌레와 레 닐라 분석 버퍼.
- 로봇 갑판에 (같은 라이브러리 판에서 형질) 피펫 팁 상자, 폐기물 저장 및 셀의 2 판을 놓습니다.
- 대기음 60 각 판의 용지 μL와 부분적으로 70 % 에탄올로 가득 폐기물 저장소에 버린다. 옆 커버 플레이트 및 설정합니다. 여러 라이브러리 판을 형질 경우, 플레이트의 모든 세트를 반복합니다.
- 2 피펫 팁 상자, 배 개똥 벌레 분석 버퍼의 판, 로봇 갑판에 셀 플레이트 세트를 놓습니다.
- 대기음 40 배 개똥 벌레 분석 버퍼의 μL하고 철저하게 혼합, 세포의 제 1 판에 추가합니다. 새로운 피펫 팁으로 전환, 두 번째 셀 플레이트를 반복합니다. 용해를 완료하는 데 10 분 동안 실온에서 세포를 놓습니다. 여러 라이브러리 판을 형질 경우, 팁, 세포 판의 상자를 교체하고 반복합니다.
- 각 셀의 1 초 동안 기록 루미 접시, 당 우물의 각 우물에서 기록 발광. 로봇에 번호판을 반환갑판.
- 2 피펫 팁 상자, 배 레 닐라 분석 버퍼의 판, 로봇 갑판에 셀 플레이트 세트를 놓습니다.
- 대기음 60 3X 레 닐라 분석 완충액의 μL, 철저히 혼합, 세포의 제 1 플레이트에 추가한다. 피펫 팁의 새로운 상자로 전환, 두 번째 셀 플레이트를 반복합니다. 여러 라이브러리 판을 형질 경우, 전지 판의 모든 세트를 반복합니다.
- 위와 같이 1 초 동안 각 웰을 기록 루미의 모든 플레이트에서 기록 발광. 번호판을 폐기하십시오.
5. 데이터 분석
- 개똥 벌레를 계산 레 닐라 발광 비율 ( "F : R 비율") 레 닐라 신호의 개수에 의해 반딧불 신호의 수를 분할하여 각 웰에 대한.
- F 나누어 유도 값을 계산 : 잘 평균 F로 각각의 R 비율 : 판의 R 비율, 우물의 최고 및 최저 25 %를 제외합니다.
- 반복 실험을 통해 유도 값을 평균하나의 형질 라이브러리 플레이트. 세 겹 이상의 알파 synuclein 더 유도하거나 억압 유전자는이 화면에서 "히트"으로 간주하고, 검증 및 보조 화면에 근거합니다.
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Representative Results
일반 루시퍼 값, F : R의 비율과 하나의 하프 플레이트 유도 값을 그림 4에 나타내었다 아니라 H2, 32 배 유도에 타격을합니다.. 과도한 독성 (예를 들어, 잘 E3), 또는 가난하게 형질 전환 된 우물을 일으키는 유전자는 모두 개똥 벌레와 레 닐라 luciferases 낮은 값을 생성하지만, 평균 유도 값이됩니다. pGL4 백본과의 상호 작용을 통해, 아마도 루시퍼 라제 활성의 비특이적 유도를 일으키는 유전자는 보통 유도 값의 결과와 동등 반디 레 닐라 luciferases 유도 할 것이다. 반복 실험 사이의 유도 값에 큰 차이는 실행 오류에 대한 의혹을 제기해야합니다. 그것은 발현이 증가의 원인이 클론이 증가 루시 페라 제 활동으로 측정 할 수 있도록 화면이 기자의 분석의 선형 범위 내에서 수행되고 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 우리는 선형성을 검증하기 위해 각 리포터 유전자의 양이 증가 형질우리의 실험 조건에서 기자 분석의 (그림 5). 이 배양 공정 인해 기판 고갈 비선형을 피하기 위해 후에 즉시 분석을 실시하는 것도 중요하다. 우리는 시약을 첨가 한 (그림 6) 후 1 시간에 중요한 반딧불 루시 페라 제 활동을 관찰했다.
그림 1. 실험 개요가. 라이브러리 DNA의 각 하나의 판은 2 기자의 구조와 결합하고 세포의 중복 플레이트 형질하는 데 사용됩니다. 48 시간 후, 각각의 루시퍼 라제 리포터의 활성을 순차적으로 측정한다. 각 라이브러리 플라스미드로 SNCA 프로모터 플라스미드의 특정 유도는 플레이트 기반 normalizatio 후 레 닐라 루시퍼에 반딧불의 비율로 계산됩니다N.
그림 2. 반딧불 기자 플라스미드에 사용되는 4 번 염색체에있는 알파 synuclein의 5 '영역 (SNCA)의 개략도. 뇌관 이름은 표 2의 시퀀스에 해당합니다. 해치 마크를 나타내는 그림에서 제거 대략 8 킬로바이트 세그먼트 그렇지 않으면 확장합니다. SNCA의 ATG 시작 코돈은 엑손 3에 있습니다.
이 검사 프로토콜에 사용되는 그림 3. 루시 페라 제 리포터 플라스미드. SNCA 게놈 영역은 PG의 여러 복제 사이트에 복제됩니다반딧불 루시 페라 제의 바로 상류 L4.10. HCMV-IE1 레 닐라 루시퍼의 (인간 사이토 메갈로 바이러스 즉시 초기 1) 발기인 지시 식 플라스미드는 내부 대조군으로 사용 하였다. 두 플라스미드 프로 메가에서 상업적으로 사용할 수 있습니다.
그림 4. 단일 96 - 웰 플레이트의 절반 대표 결과. A. 원재료 반딧불 루시퍼 카운트 B. 원재료 레 닐라 루시퍼 카운트 C. F :.. 각 F를 나눔으로써 각 웰에, 계산을위한 B. D. 유도 값의 값에서 값을 나누어 계산 R 비율 : R 비율 평균 F 기준 :. 우물의 상단과 하단 25 %를 제외한 판의 R 비율, E. 그래픽 유도 값의 표현을위한 잘 H2, 긍정적 인 히트, 단일 판은 강조했다. H2는 이전에 SNCA 발현과 관련이없는 신경 세포의 전사 인자이다 누르십시오. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
도 5. 선형성 분석법. 세포 강한 HCMV-IE1 프로모터의 제어하에 개똥 벌레 및 레 닐라 루시퍼 라제 플라스미드의 양의 증가로 형질 이상 프로토콜로 분석 하였다. (형질 전환 DNA의 총 금액은 중립 분산 플라스미드를 사용하여 일정하게 유지되었다). A. 반딧불 선형성 분석. 반딧불 활동 값. B. 레 닐라 선형성 분석의 넓은 범위를 통해 선형 유지됩니다. 15 NG / 물론 위의 곡선의 평탄화를합니다.
.. 그림 6은 반딧불 루시 페라 제 분석 부패 신호의 시간 코스는 루시퍼 라제 시약은 CMV-루시 페라 제 시간 0에서 구성 형질 전환 된 하나의 플레이트에 추가되었습니다; 직렬 측정은 상기 시약의 첨가없이 이루어졌다.
| 구성 요소 | 음량 | 최종 농도 |
| 5 NG / μL에서 BAC 2002-D6 | 4 μL | - |
| 배 Phusion GC 버퍼 | 20 μL | 1X |
| DMSO | 6 μL | 6 % |
| 의 dNTPs (10mm) | 2 μL | 200 μM |
| 포워드 프라이머 (100 μM) | 1 μL | 10 μM |
| Reverse 프라이머 (100 μM) | 1 μL | 10 μM |
| DDH 2 O | 65 μL | - |
| Phusion DNA 중합 효소 | 1 μL | - |
| 총 : 100 μL |
표 1. PCR은 α-synuclein의 프로모터를 증폭 업을 설정합니다.
| 이름 | 순서 | 제한 사이트 |
| SNCA7 | 5'-GTC ggtacc tgaagttaacctcccctcaatacc-3 ' | KpnI으로 |
| SNCA8 | 5'-TGC gagctc aagaagacagccatctgcaagcc-3 ' | 를 SacI |
| SNCA1 | 5'-TCT gagctc tctgagcatttccctaggtg-3 ' | 를 SacI |
| SNCA2 | 5'-태그 CTCGAG ggctaatgaattcctttaca-3 ' | XhoI에 |
.. 표 2 알파 synuclein의 프로모터를 증폭하기위한 프라이머 NACP 반복의 증폭은 0.9 KB 조각을 생성한다; 다른 amplicon의 길이는 3.4 KB입니다. 프라이머의 위치에 대해서는 그림 2를 참조하십시오.
| A : 배 개똥 벌레 분석 버퍼 | ||
| 주식 솔루션 (-80 ° C에서 보관) | 100 ㎖의 3 배 개똥 벌레 분석 버퍼 당 볼륨 | 최종 농도 (배) |
| 500 mM의 DTT | 3.0 ML | 15 mM의 |
| 10 mM의 코엔자임 | 6.0 ML | 0.6 ㎜ |
| 100 mM의 ATP | 0.45 ML | 0.45 밀리미터 |
| 80 ㎎ / mlluciferin | 0.525 ML </ TD> | 4.2 ㎎ / ㎖ |
| 트리톤 용해 완충액 | 90.025 ML | - |
| B. 트리톤 용해 버퍼 | ||
| 구성 요소 (RT에 저장) | 100 ㎖의 트리톤 용해 버퍼 당 볼륨 | 최종 농도 |
| 트리스 - 염산 분말 | 1.705 g | 0.1082 M |
| 트리스 - 염기 분말 | 0.508 g | 0.0419 M |
| 5 M NaCl을 | 1,650 ml의 | 75 mM의 |
| 1 M MgCl2를 | 0.30 ML | 3 밀리미터 |
| 트리톤 (Triton) X-100 순수한 액체 | 825 ㎖의 | 0.25 % |
| 물 | 100 ml의 총 부피에 | - |
| C. 배 레 닐라 분석 버퍼 | ||
| ~ 100 ㎖의 3 배 레 닐라 분석 버퍼 당 볼륨 | 최종 농도 (배) | |
| DMSO에 10 mM의 PTC124 | 0.6 ML | 0.06 밀리미터 |
| 에탄올에 2 ㎜ H-CTZ | 0.5 ㎖ | 0.01 밀리미터 |
| 레 닐라 염 | 100 ML | - |
| D. 레 닐라 염 | ||
| 구성 요소 (RT에 저장) | 100 ㎖의 레 닐라 소금 당 볼륨 | 최종 농도 |
| 0.5 M 나 2 EDTA | 9.0 ML | 45 mM의 |
| 나 피로 인산 | 1.34 g | 30 ㎜ |
| 염화나트륨 | 8.33 g | 1.425 M |
| 물 100 ml의 총 부피에 | - | |
표 3. 주식 솔루션과 개똥 벌레와 레 닐라 루시퍼 라제 분석을위한 분석 버퍼. A. 배 개똥 벌레 분석 버퍼 레시피. DTT, 디티 오 트레이 톨. 언급하지 않는 한, 모든 구성 요소는 물에 용해된다. B. 트리톤. C. 배 레 닐라 분석 완충액 레시피 버퍼 조리법을 용해. H-CTZ, H-엘렌 테라. 100 %의 EtOH 12.2 ㎖ 및 진한 염산 120 μL에 10 ㎎ H-CTZ를 추가하여 2 ㎜ H-CTZ를 확인합니다. PTC124는 DMSO. D. 레 닐라 소금 제조법에 용해된다. 트리톤은 버퍼를 용해와 레 닐라 염은 각각 4 ° C와 실온에서 몇 주 동안 안정되어있다. 3X 반디 분석 완충액 및 3X 레 닐라 분석 완충액은 루시퍼 라제 분석을 수행 3-4 시간 내에 혼합되어야한다.
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Discussion
알파 - 시누 클레인은 루이 기관 4, 질병에 대한 pathognomonic 고려 세포 흠의 구성 요소로 파킨슨 병 (PD)에 연루되어있다. 수많은 게놈 넓은 협회 연구는 산발적 PD 5,6,7에 대한 위험 증가와 알파 synuclein의 단일 염기 다형성을 연결했다. 산발적 PD보다 일반적인 있지만, 가족 PD는 또한뿐만 아니라 복제 및 α-synuclein의 궤적 9,10,11의 삼배로, 알파 synuclein 8 돌연변이에 의해 발생할 수 있습니다, 현상은 산발적 PD (12)의 본. 이와 함께,이 연구는 PD의 병인에 알파 synuclein의 중심성을 강화. 이 화면의 목적은 α-시누 클레인 조절 유전자를 확인하고, 따라서 파킨슨 병의 병인에서 역할을 할 수 있었다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 7,670 인간의 유전자를 선별하고 140을 대표하는, 154 예비 안타 (이상 유도를 3 배) 확인고유 한 유전자. 이러한 히트 히트 재현성을 결정하는 새로운 DNA의 준비를하여 차 분석 대상이었다. 3 배 범위에서 히트 이후 루시 페라 제 분석의 28 %에 재현. 각각, 5 배 유도 -, 5 - 재현성 4에 59 %, 69 %, 78 %로 증가했다. 7 배 이상 입회식 안타는 시간의 100 %를 재생. 우리는 궁극적으로 알파 synuclein의 전사 68 새로운 규제를 확인했다.
몇몇 증거는 우리가 얻은 68 안타 알파 synuclein의 실제 레귤레이터이다하는 것이 좋습니다. 확인 안타의 우리의 목록 GATA3, 이전에 SNCA 식 3을 조절하는 것으로 전사 인자의 GATA 가족의 일원을 포함한다. 몇 가지 알려진 SNCA 규제 중 하나를 채점하는 것은 우리의 화면의 신뢰성에 큰 자신감을 준다. 또한, 우리는 독립적으로 신경 세포 전사 인자의 같은 가족의 여러 구성원 안타, 득점 화면을 재현하고 유전자를 식별되지 않는 것을 제안무작위로. 가장 중요한 것은, 추가적인 후속 분석에서, 우리의 최고의 능력이 과발현 최저 분석에서 확인 된 신경 세포의 내생 SNCA 발현을 조절하는 안타. 우리는 BacMamvectors에게 SY5Y의 도파민 세포 3를 사용하여 히트 상단의 몇 가지를 과발현 이러한 히트 shRNA를 녹다운이 감소 SNCA mRNA 수준의 결과 동안, 내생 SNCA 레벨 2-8 배 증가 할 수 있었다. 이러한 연구는 결정적으로 우리의 최고 히트 내생 SNCA 수준의 규제하고 해체 루시퍼 시스템 단순히 유물 아니라는 것을 보여줍니다. 다른 히트 곡에 대한 추가 후속 연구는 우리의 화면에서 히트의 전체 목록은 참 거짓 긍정과 거짓 부정적인 요금을 결정해야합니다. 안타와 파킨슨 병의 관계에 대한 자세한 설명은 준비 14입니다.
그것은 우리의 검사 방법의 한계를 고려하는 것이 중요합니다. 그것은 OBV해야화면이 어떤 규칙을 식별 할 것이다 빚을내는이 검사 라이브러리에 존재하지. 우리의 스크리닝 라이브러리는 인간 게놈의 약 1 제를 포함하는 실질적인 동안, 그것은 포괄적이었다. 우리의 분석의 단순성을 감안할 때, 추가 라이브러리는 쉽게 검사 할 수있다. 우리는 우리의 차 분석에서, 히트 paralogs 사용할 포함하여 타겟 방식으로 상영하는 유전자의 수를 증가했다. 우리는 또한 우리의 기자 구조에 포함 된 외부 게놈 영역에 바인딩 된 히트 점수를하지 않을 것입니다. 적절한 지역을 포함의 기회를 극대화하기 위해, 우리의 기자는 SNCA 프로모터에서 발견 된 다수의 전사 시작 사이트에 대한 즉각적인 측면에서는 순서를 포함. 그것은 추가 요인이 SNCA 발현을 조절하는 것이 훨씬 즉시 프로모터 영역의 외부 영역에 결합 가능성이 높습니다. 원하는 경우, 이러한 추가적인 상류 및 하류 영역으로 화면을 수행함으로써 검출 될 수있다, 한번에 10 ~ 킬로바이트 될 수 있지만인한 효율 플라스미드 벡터로 클로닝하고 높은 카피 수 pGL4 벡터의 안정성에 대한 제한이 방식 ssessed. 대안 적으로, 루시페라아제 구조체는 SNCA 유전자좌를 함유 BAC DNA를로 개조 될 수있다. 후자의 방법을 한 가지 단점에도 최적의 조건에서 세기관지의 형질이 다음> 100 배 덜 효율적이다 15 플라스미드 것입니다. 또 다른 방법은 "노크에서"로 루시 페라 제 기자 내생 SNCA 궤적에, 그 후에 우리의 접근 방식 훨씬 더 힘든하는 방법이 될 것입니다. 우리는 이미 과잉 발현이 증가 루시 페라 제 활동을 초래하지 않도록 수준을 포화에 표현되는 모든 히트 점수를하지 않을 것입니다. 이러한 이유로 우리는 SNCA을 조절 신경 요인이 부족 수, 실제로 우리가 신경 세포 전사 인자의 수를 점수 않은 비 신경 293T 세포를 사용하기로 결정했습니다. 293T 세포의 하나의 잠재적 인 단점은, 그러나, 필요한 경우에 히트로서 어떠한 유전자의 점수로하지 않을 수도 있다는 것이다dditional의 연결 요소가 제대로 작동합니다. 따라서, 모든 화면처럼, 우리의 연구는 잠재적 인 SNCA 규제의 숫자를 놓칠 수 있습니다. 그러나, 실제적인 측면에서, 68 안타, 우리는 증가 더 10 배에 의해 SNCA의 알려진 규제의 수를 획득하고, 후속 조치 때문에 추가 안타 우리의 경우 필요하지 않을 수 년의 작업이 필요합니다.
그것은이 방법론을 사용하여 발생할 수있는 잠재적 인 아티팩트를 실현하는 것이 중요하다. 화학 화면에서, 루시 페라 오히려 전사 유도하는 것보다 루시퍼 라제 단백질의 안정화 artifactually 득점 화합물에 대한 악명이 높다. 단백질 안정화 유물을 배제하기 위해, 우리는 여러 가지 다른 프로모터 루시퍼 구조에 대한 우리의 안타를 선별하고 구성 적 프로모터에서 식을 올려서 포스트 전사적으로 역할을 한 것으로 보이는 안타를 찾을 수 없습니다. 또 다른 잠재적 인 이슈는 pGL4 벡터 골격에 결합보다는 transactivating 요인이 될 수있다SNCA 프로모터. 우리는 광범위이 문제를 방지하기 위해 결합 부위 전사 인자를 제거하는 돌연변이 된 pGL4 벡터를 이용. 우리의 히트 곡 중 하나가 유도를위한 벡터 백본 필요 여부를 평가하기 위해, 우리는 어떤 백본없는 SNCA-루시퍼 벡터 영역을 증폭하는 PCR을 사용하고 차 분석을위한 기자로이 선형 조각을 사용했다. 우리는 우리의 완전한 플라스미드 기자와 한 가지 예외 선형 백본없는 구조 사이의 유도 값에 큰 차이가 없습니다. GATA2 플라스미드 기자와 함께 ~ 15 배 유도를 보였으 GATA2 유도 몇몇은 백본에 바인딩, 구성 요소가 될 수 있다는 것을 제안 선형 기자 만 ~ 2.7 배.
전사 레귤레이터를 식별하기위한 다른 방법의 수는 설명되었다. 거의 30 년 전, 형질 리포터 유전자 발현을 통해 강한 바이러스 성 프로모터의 시스 - 작용하는 전사 제어 요소의 매핑은 동부 표준시했다16 ablished. 이 방법은 때로는 적절한 일차 전지 라인을 얻어 형질 어렵 기 때문에 "발기인 강타는"세포 형 특이 적 프로모터의 매핑을위한 호의에서 떨어졌다라고하고, 같은 라인은 정확하게 원래의 자신의 조직을 대표하지 않을 수 있습니다. 융합 유전자의 라이브러리와 관련 시스 - 작용 요소 사이의 상호 작용을 검출하기 위해 해체 된 리포터 시스템을 제공함으로써 효모 한 하이브리드 시스템 (17)이 문제를 우회. 우리의 접근 방식은 해체 된 디자인 효모 한 하이브리드 시스템과 유사하지만, 우리의 시스템에서 우리는 우리가 아니라 효모보다 포유 동물 세포를 사용, 일반 식 클론보다는 유전자 융합을 사용, 우리는 나란히 정량 할 수 로봇을 사용 각 테스트 유전자 기능 판독. 유망한 방법은 특정 게놈 영역에 결합 단백질의 식별이 18에 설명 된 수 고립 된 염색질 세그먼트 (롯트)의 단백질 체학이라고하지만,이 아직성공적으로 단일 복사본 인간 유전자에 적용되었습니다. 게놈 전체의 크로 마틴 면역 침전 (칩 - 서열 및 칩 - 칩)의 연구는 대규모 19 시스 - 작용하는 영역을 식별하는 데 사용되었다. 이 방법은 잠재적으로 강력하지만, 롯트와 같이, 같은 쉽게 동질적인 문화를 얻지 특정 신경 세포의 집단으로 세포 유형 덜 유용 할 수 있습니다. 우리는 우리의 검증 안타 칩 데이터베이스를 선택했을 때 또한, 그들은 SNCA 프로모터 이러한 히트 바인딩 표시하지 않았습니다. 우리는 기존의 칩 (14)에 의해 SNCA 프로모터에 이러한 요소의 결합을 설명 할 수 있었다 때문에 이것에 대한 이유는 명확하지 않다; 그러나 마이크로 어레이의 판독 (칩 - 칩)을 사용하여 칩 연구에 사용되는 전체 SNCA 프로모터 영역의 부족으로 인해 수 있습니다. 우리의 방법은 생성하는 직접적인 기능 판독에 결합 할 때 롯트, 칩 - 서열 및 기타 단백질 체학 접근 그러므로 가장 유용 할 수 있습니다.
이중 루시퍼분석 반딧불 채용 및 레 닐라 luciferases는 높은 처리량의 형식 (20)에 다수의 세포 내 프로세스를 연구하기위한 중요한 방법을 제공합니다. 반딧불 루시 페라 제에 대상 발기인의 융합은 알파 - 시누 클레인 1,2 등의 체외에서 다수의 대상의 전사 조절 및 발기인 구조를 연구하는 데 사용되었습니다. 우리는 저렴한 대안을 개발 강력한 신호를 제공하고 우리의 분석의 범위 (그림 6) 선형했다 상업적으로 이용 가능한 이중 루시퍼 라제 시약. 우리의 방법은 넉넉한 NIH와 이전에 설명 비상업적 듀얼 루시 페라 제 분석 21에 론 존슨 (Ron Johnson)에 의해 제공되는 프로토콜에서 구성된다. 반디 분석 완충액은 세포 lyses 및 ATP와 루시페린을 제공 반딧불 루시퍼 라제의 기질. 이 분석은 약 1 시간의 반감기 (그림 7)과 빛 반응을 얻을 수 있습니다. 레 닐라 분석 완충액은 firefl를 꺼 버리는Y는 신호를 적절한 기판 (엘렌 테라)를 제공합니다. 레 닐라 분석 완충액 자체가 세포를 용해하지 않으며 트리톤 용해 완충액 또는 반디 분석 완충액 중 하나와 함께 사용되어야함에 유의. 우리는 좀처럼 RT에서 석출 전술 레 닐라 분석 버퍼, 따라서 우리는 황산나트륨을 제거하고 60 % 피로 인산 나트륨의 양을 감소 것을 발견했다. 우리의 분석은 또한 PTC124, 분석에 추가 담금질에 기여 반딧불 루시 페라 제 (22)의 강력한 억제제가 포함되어 있습니다. 담금질 활동도 EDTA, 염화나트륨, 및 레 닐라 피로 인산 버퍼에 의해 제공된다. 이러한 새로운 제제로, 반딧불 활성의 약 99.5 %가 레 닐라 버퍼에 의해 급냉된다. 두 반딧불 및 레 닐라 루시퍼 신호 강도 및 재현성은 다소 (4.6 및 4.10 단) 버퍼의 첨가 후 혼합함으로써 개선되었다.
우리의 경험, 전체의pGL4.10에 lpha-synuclein의 프로모터는 아마도 때문에 인트론 2 GC가 풍부한 지역과 복잡한 이차 구조의 증폭 및 복제하는 고유 어렵다. 우리는 불안정 삽입의 복제에 최적화 된 STBL4 능력 세포, 가장 성공적이었다. 심지어이주의 사항 다음, 우리는 자주 돌연변이를 복구하는 E. 대장균 게놈 DNA는 구문의 3 '말단에 삽입 하였다. 이 돌연변이의 BamHI (정확한 복제 5.8 KB 2.8 KB 대)으로 분해 할 때 약 5.8 KB, 4 KB를 밴드를 만들고 선택적 접시에 큰 식민지로 나타납니다. 30 ° C과에서 관할 세포의주의 성장 포화 감소에 도달하는 문화를 방지하지만, 돌연변이를 복구의 가능성을 제거하지 않습니다. 우리는 모든 제한 다이제스트에 의해 DNA의 준비 및 사전 형질에 겔 전기 영동의 순도를 확인하는 것이 좋습니다.
이 선별 프로토콜은 쉽게 다른 프로모터에 적응D는 이미 대상 프로모터를 조절하는 것으로 알려져 아니라 양성 및 음성 대조군 유전자를 사용하여, 그에 따라 최적화되어야한다. 몇 가지 고려 사항은 리포터 플라스미드의 복제 및 형질에 적용됩니다. 개똥 벌레 루시퍼 라제 리포터 플라스미드로 표적 프로모터를 클로닝 할 때, 루시퍼 라제의 시작 위치는 표적 유전자의 번역 개시 사이트를 근사화한다. 이중 루시페라아제 스크린은 일반적으로 플라스미드 백본의 영향을 최소화하기 위해, 그러한 HSV-TK 프로모터로서, 최소 프로모터의 조절하에 레 닐라 플라스미드를 배치. 그러나, 우리는이 프로모터를 유도 긍정적 컨트롤 중 하나는, 따라서 우리는 CMV 프로모터를 선택했다 것으로 나타났습니다. 각 리포터 플라스미드의 상대적인 양은 경험적으로 결정되어야하며, 각 구성 적 프로모터의 활성에 의해 영향을 받는다. 이상적인 기준 (형질하지만 uninduced) 루시퍼 수는 librar를 탐지하기 위해, 적어도 10 배 5 ~ 형질 감염되지 않은 세포에서 배경 위에 있어야한다Y 억제 유전자 또는 낮은 신호가 발생합니다 그 원인 독성. 사전 심사에 luminometers 사이에 차이가있을 수있는 것으로 루시퍼 카운트 각 분석의 선형 범위 내에 있는지 확인합니다. (우리의 레 닐라는 우리의 분석의 선형 범위의 상단에 일반적으로 가을을 계산합니다.) 따라서 우리는 우리가이 기자의 최소한의 양을 사용, 반딧불 기자 플라스미드 라이브러리 DNA의 비율을 증가하는 높은 유도의 결과 것으로 나타났습니다.
형질 전환 프로토콜뿐만 아니라 최적화되어야한다. 우리는 형질의 상대적인 용이성 293T 세포를 선택의 효율은 원심 분리 단계 (단계 3.5)를 첨가하여 50 배 증가했다. 도파민 라인 SY5Y는에 우리의 손에 작은 형질을 100 배, 그리고, 전술 한 바와 같이, 과다 발현 검사를 수행하기위한 최적되지 않을 수 있습니다. 우리의 최적의 분석 시간이 경험적으로 48 시간으로 결정했다, 따라서 우리의 세포는 초기에 낮은 밀도로 도금했다, 10-70 % 가용성 커피의 포화 상태에서 세포를 형질하도록 설계 Optifect의 사용을 필요로. 다른 세포주 다른 시작의 밀도와 다른 형질 전환 시약을 필요로 할 수있다. 우리는 (있는 경우 형질 동안 독성을 일으킬 수) 항생제를 추가하는 형질 전환 후 세포 미디어를 변경하기로 결정했습니다. 이 세균 오염의 가능성을 감소하지만, 다른 시스템에이 프로토콜을 채택 할 때, 따라서이 단계의 필요성을 평가해야한다, 재료 (특히 로봇 피펫 팁)에 비용을 증가시킨다. 루시 페라 제 분석은 최소한의 최적화를 사용하지만, 다른 세포 유형과 높은 처리량이 분석을 수행하기 전에, 세포가 적절하게 트리톤 용해 버퍼에 의해 용해되어 있는지 확인 할 수있다. 트리톤 (Triton) X-100 엘렌 테라의 형광도 발생합니다. 우리의 분석 레 닐라 신호는이 효과를 하찮게 할 정도로 강한 이었지만, 다른 세포 유형이 분석을 최적화 할 때, 미시간에 트리톤 X-100 볼륨을 제한세포 용해에 필요한 nimal 금액.
우리는 일시적으로 듀얼 루시퍼 라제 리포터 시스템과 형질 전환 세포를 사용하여 알파 synuclein의 새로운 전사 조절기를 식별하기위한 신속하고 상대적으로 저렴한 검사 방법을 제시 하였다. 이 프로토콜은 관심의 다른 유전자를 대상으로 쉽게 수정하고 또한 렌티 바이러스 생산 (23) 높은 처리량의 형질을 필요로하는 응용 프로그램에 적용 할 수있다.
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Disclosures
이 작품은 라이선스 BacMamreagents (미국 특허 5,731,182)에 의해 얻어진 로열티에 의해 지원되었다.
Acknowledgments
우리는 DNA 검사 라이브러리의 준비를 위해 MGH DNA 코어의 존 Darga 감사합니다. 퍼킨 엘머의 크리스토퍼 Chigas 우리 월락 1420 루미 매우 귀중한 지원을 제공했습니다. 스티븐 Ciacco 및 애질런트의 마틴 Thomae은 브라보 로봇에 대한 지원을 제공했다. 우리는 아낌없이 자신의 이중 글로 루시 페라 제 분석 프로토콜을 제공하기위한 NIH에 론 존슨 (Ron Johnson)과 스티브 디도 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K2100-12 | |
| PureLink PCR Micro Kit | Invitrogen | K310250 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K2100-03 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K2100-07 | |
| Bravo Robot | Agilent | - | |
| Robot Pipet Tips with Filter | Agilent | 19477-022 | |
| Robot Pipet Tips without Filter | Agilent | 19477-002 | |
| Clear-bottomed 96-well Plates | Corning | 3610 | |
| Reservoirs | Axygen | RES-SW96-HP-SI | |
| Polystyrene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651101 | |
| Polypropylene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651201 | |
| Adhesive Plate Covers | CryoStuff | #FS100 | |
| Reagent | |||
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| BAC 2002-D6 | Invitrogen | 2002-D6 | |
| Calf Intestine Alkaline Phosphatase | Roche | 10713023001 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| pGL4.74 | Promega | E6931 | |
| ElectroMAX Stbl4 Competent Cells | Invitrogen | 11635-018 | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| DMEM without Phenol Red | Invitrogen | 31053-028 | |
| Optifect | Invitrogen | 12579017 | |
| Ciprofloxacin | CellGro | 61-277-RF | |
| Tris-Hydrochloride Powder | Sigma | 93287 | |
| Tris-Base Powder | Sigma | 93286 | |
| Triton X-100 Pure Liquid | Fisher | BP151-100 | |
| DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
| C–nzyme A | Nanolight | 309 | |
| ATP | Sigma | A6419 | |
| Luciferin | Invitrogen | L2912 | |
| h-CTZ | Nanolight | 301 | |
| PTC124 | SelleckBiochemicals | S6003 | |
References
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