Summary
我々は、高スループットのロボットのトランスフェクションと自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを使用して転写調節因子を同定するための迅速で安価なスクリーニング法を提示する。このプロトコルは、急速に数千の遺伝子のための直接のサイド·バイ·サイド機能データを生成し、目的の任意の遺伝子をターゲットに簡単に変更可能です。
Abstract
我々は、α-シヌクレイン、パーキンソン病に関連する遺伝子の転写調節因子を同定するための迅速かつ安価なハイスループットスクリーニングプロトコルを提示する。 293T細胞を一過一遺伝子あたりウェルマイクロプレートフォーマットで、一緒にルシフェラーゼレポータープラスミドを用いて、配列されたORFの発現ライブラリー由来のプラスミドでトランスフェクトされる。ホタルルシフェラーゼ活性は、内部コントロール構築物（ ウミシイタケルシフェラーゼを導くhCMVプロモーター）から発現に対して正規化し、α-シヌクレインの転写時に各ライブラリー遺伝子の効果を決定するために48時間後にアッセイされる。このプロトコルは、96ウェルフォーマットで無菌の液体処理を行うバイオセーフティキャビネット内に封入卓上型ロボットによって促進される。我々の自動化されたトランスフェクションプロトコールは、ハイスループットレンチウイルスライブラリーの産生又はコンジュユニークなライブラリープラスミドの多数の三重トランスフェクションを必要とする他の機能的スクリーニングプロトコルに容易に適用可能でヘルパープラスミドの共通セットでnction。また、市販の、デュアルルシフェラーゼPTC124を採用している試薬、EDTA、および以前のウミシイタケルシフェラーゼを測定し、ホタルルシフェラーゼ活性を抑制するために、ピロリン酸への安価で検証済みの代替を提示する。これらの方法を用いて、7,670のヒト遺伝子をスクリーニングし、α-シヌクレインの68調節因子を同定した。このプロトコルは、関心のある他の遺伝子を対象とする、容易に変更可能です。
Introduction
キー遺伝子調節要素とそれらに作用する因子を同定する能力は、非常に多くの生物学的プロセスの探査のための基本である。しかしながら、このような特定のニューロン集団のような希少細胞タイプにおいて遺伝子の発現を調節する因子を同定する、挑戦的であることができる。ここでは、α-シヌクレイン（SNCA）の新規な転写調節因子を同定するためのプロトコルを提示し、パーキンソン病に関連し、substantianigraでドーパミン作動性ニューロンに発現している遺伝子は、中脳の緻密領域様部。我々は、293T細胞におけるα-シヌクレイン発現を分解するための高スループット、デュアルルシフェラーゼレポーターインビトロスクリーンを用いてこれを達成する。 α-シヌクレインプロモーターは、第ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミドにクローニングする。構成的に活性なプロモーターの制御下でウミシイタケルシフェラーゼを含む市販のプラスミドを内部対照として役立つ。テサロニケ電子レポーター構築物を、各ウェルが単一のライブラリープラスミドでトランスフェクトされるように、DNA発現ライブラリー由来のプラスミドでマイクロプレート中の293T細胞に同時トランスフェクトする。 48時間後、各レポーターのためのルシフェラーゼ活性は、デュアルグローアッセイを用いて順次測定される。プレートベースの正規化後：（R比F）各ウェルのウミシイタケルシフェラーゼ活性：各ライブラリ遺伝子に応じて、α-シヌクレインの相対発現は、ホタルの比によって推定される。
このプロトコルは、最小限の人員（1-2人）と最小のコスト（マイクロプレートアッセイあたり約3ドル試薬コスト）を使用して、レポーター遺伝子をトランスする能力について多数の遺伝子（週〜2500）をスクリーニングする機能を提供します。遺伝子操作に難治培養ニューロンで研究することが困難である神経細胞の遺伝子の転写調節因子（ 例えば 、α-シヌクレイン）は、この直接機能アッセイで並べて比較することができる。私達は私達の中に含まれるプロトコル我々は、従来の手順（説明を参照）で成長させたときに、この領域を含むプラスミドが不安定であることが見出さため、クローニングおよびα-シヌクレインプロモーターを含むプラスミドの増殖のための詳細な方法。また、ハイスループットアッセイ用の市販のデュアルルシフェラーゼ試薬に安価な代替品が挙げられる。このプロトコルは、容易に、または高スループット一過性トランスフェクションを必要とするあらゆるプロセスに関心のある他の調節エレメントを標的とするように適合させることができる。
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Protocol
実験概要については、 図1を参照してください。
1。α-シヌクレインプロモーターを含むレポータープラスミドを準備
α-シヌクレイン遺伝子（ 図2）の調節要素は、上流NACP（アミロイドペプチドの非ベータ成分）ジヌクレオチド反復配列1,2からのイントロン2〜3を、約10キロバイトに及ぶ。私たちは、この地域の一部を含む私たちのレポーター構築。私たちは、成長のために必要な特別な手順2イントロンを含むプラスミドは、下記のとおりことがわかった。ルシフェラーゼプラスミド、pGL4.10およびpGL4.75（ 図3）は 、Promega社から市販されており、従来の分子生物学プロトコルを用いて増殖させることができる。
- 表1の配合表および表2のプライマーを用いて別々のPCRにおけるα-シヌクレインプロモーターの2成分を増幅する。
- ベリTE（トリス-EDTA）50μlに溶離をQiaquick PCR精製キット（Qiagen）を用いてアガロースゲル上できれいなfyのPCR産物。将来の使用のために-20℃で溶出した0.9kbのフラグメントを格納します。
- SacIとXhoIで、全体の3.4キロバイトPCR断片の量だけでなく、pGL4.105μgのダイジェスト。子牛腸アルカリホスファターゼ（Roche）を、ベクターを治療し、ゲルがPureLinkクイックゲル抽出キット（Invitrogen）を用いて浄化する。
- T4 DNAリガーゼ（NEB）を用いて断片とベクターを連結する。 10μlのTE緩衝液に溶出して、PureLink PCRのマイクロキット（Invitrogen）を用いて完了した反応を清掃してください。
- ELECTROMAX Stbl4テントセル（Invitrogen）を20μLに洗浄、ライゲーション反応の2液を変換し、メーカーの指示に従って、エレクトロポレーション。 90分間、225 rpmで30℃のインキュベーター中で振盪する。 100 mg / mlのアンピシリンを含むLBプレート上で2ボリュームを広げ、2日間30℃でインキュベートする。
- つまようじを使用して、結核の2ミリリットル（テリフィックブロス）への接種のための4-6の小さなコロニーを選択します。 30℃で振とうのO / Nでこれらのミニプレップの文化を育てる
- PureLink HiPureプラスミドミニプレップキット（Invitrogen）を用いて、各ミニプレップ培養物を1.5mlからプラスミドDNAを精製する。
- BamHIでミニプレップを消化し、アガロースゲル上で電気泳動。正しいクローンは2.8キロバイトと4.9 KBのフラグメントを生成する必要があります。
- 新しいLB（ルリアブロス）プレート上の正しいクローンから、残りのミニプレップ文化をRestreakし、2日間30℃で成長する。
- 小さなコロニーを選択し、1.5ミリリットルのTBスターター培養を接種する。 30℃でO / Nを振るスターター文化が飽和状態に成長させてください。
- 温めておいた結核の150ミリリットルに全体のスターターカルチャーを希釈し、2日間、30℃で振る。次のステップに進む前に、クローンはreplicati中に変異していないことを確認するために、追加のミニプレップおよび消化のために、この文化の1.5ミリリットルを使用上。
- PureLink HiPureプラスミドマキシプレップキット（Invitrogen）を用いて、残りの培養物からプラスミドDNAを精製する。この中間体プラスミドの期待利回りは、文化の150ミリリットルあたり50〜150μgのです。
- ステップ1.2で凍結し0.9kbのフラグメントを解凍する。 1.3〜1.12のKpnIおよびSacIで消化する代わりに、中間プラスミドに0.9kbの断片をクローン化するための手順を繰り返します。ライゲーション、形質転換、選択、および上記のように大量調製（Maxiprep）のために成長する。 BamHIで消化は5.8キロバイトと2.8 KBのフラグメントが得られるはずです。これは、スクリーンに使用されるプラスミドである。
2。スクリーニングのための293T細胞、レポータープラスミド、およびライブラリーDNAを準備
293T細胞は、最初の96ウェルプレートに播種し、翌日、トランスフェクトされる。レポータープラスミドおよびライブラリーDNAを96ウェルプレートに希釈する。私たちは、マサチューセッツ総合病院（でDNAコアからトランスフェクショングレードのライブラリーDNAのプレートを得た= "_blank"> dnacore.mgh.harvard.edu）を取得します。このプロトコルは、293T細胞の2の同一のプレート（ 図1）に単一のライブラリ版をトランスフェクトし、細胞のこのよう2プレートは、スクリーニングされる各ライブラリのプレートのために播種する必要があります。
注：これらは、ルシフェラーゼアッセイに干渉し、それぞれ、トランスフェクションの際に毒性を高めるように、フェノールレッドや抗生物質を含まない培地中の細胞を成長させる。
- 各ライブラリープレートは、14％FBSを含有するDMEM中1.5×10 5細胞/ mlの濃度まで再懸濁し、トリプシン処理293T細胞をスクリーニングするために。無菌貯水池（アキシジェン）に注ぐ。
- 貯水池、2透明底、96ウェルプレート（Corning）、ロボットデッキ上のフィルターピペットチップ（アジレント）のボックスを配置します。ウェル当たり1.5×10 4細胞の密度のため、両プレートの各ウェルに細胞100μlを分注する。
- 等しい確実にするために低いランプ速度を用いて、2分間50×gで細胞プレートを遠心分離する各ウェルを通して細胞密度。 37℃でインキュベートし、10％CO 2 O / N.
- 無血清培地中で5 NG /μlにホタルおよびウミシイタケレポータープラスミドを希釈する。 15ミリリットルコニカルチューブに（容量）ホタルウミプラスミドを5:3の割合で希釈液を兼ね備えています。
- ピペットで各ウェルに、ライブラリプレートあたり17μLに加え、2月10日μL過剰を分配する96ウェルプレートの各ウェルに結合したプラスミドは、。
- 上記のようにトランスフェクショングレードのDNAライブラリープレートを取得し、エンドトキシンフリー水で13.3 NG /μlに希釈する。ウェルあたり最小容積は28μLである必要があります。
3。トランスフェクションを行います
画面の2日目に、レポータープラスミドおよびライブラリーDNAを293T細胞にトランスフェクトする。
- 各ライブラリのプレートには、ポリスチレンチューブに4.3ミリリットルの無血清培地（午前1時40希釈）を用いてRT Optifect（Invitrogen）を107.5μLをミックス。 RTで5分間インキュベートし、そしてN 96ウェル、ポリスチレンV底プレート（グライナー）の各ウェルに（ライブラリープレートあたり）44μLを分注する。
- 希釈Optifectのプレート、レポータープラスミド（ステップ2.5）、ライブラリのDNA（ステップ2.6）、およびロボットデッキにピペットチップの箱を置きます。
- 各吸引の間に5μlのエアギャップを挿入して吸引除去するレポータープラスミドの17μlの希釈Optifectの43μL、およびライブラリーDNAの26μL、。ライブラリーDNAは、交差汚染を防止するために、最後に吸引されるべきである。新しいポリスチレンV底プレートにヒントの内容を分配する、ミックス、カバー、および脂質/ DNA複合体を形成することができるように、20分のために確保さ。複数のライブラリプレートをトランスフェクションした場合、ピペットチップとライブラリプレートを交換し、繰り返してください。
- Optifect / DNA混合プレートを明らかにし、293T細胞の2プレートをロボットデッキの上に置きます。 DNA混合物を、ゆっくりと、細胞の各プレートに40μLを分注：Optifectの80μlを、ピペットチップの単一のボックスを吸引使用。トランスの場合複数のライブラリ版をfecting、すべてOptifectためリピート：DNAプレート。セルをカバー。
- 30分間1200×gで細胞プレートを遠心分離する。カバーし、インキュベーターに戻す。
- 4-6時間のために細胞をインキュベートします。このインキュベーションの間、各トランスフェクトライブラリ版のため、10％FBSおよび10μg/ mlのシプロフロキサシン（CELLGRO）を含む12ミリリットルのDMEMを混合することにより、新鮮な培地を準備。無菌リザーバに新鮮な培地を注ぐ。
- ロボットデッキに2ロボット先端の箱、細胞の単板、新鮮な培地を含む容器、および廃棄物容器を置きます。細胞から培地を吸引し、100μlのおよび部分的に70％エタノールで充填された廃棄物容器内に分注する。新鮮な培地100μlを、新鮮なヒントを吸引し使用して、徐々に細胞上に分注する。セルのすべてのプレートについて繰り返します。
- 48時間インキュベーターにプレートを返します。
4。二重ルシフェラーゼアッセイを行う
画面の4日目に、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼアッセイが行われる。
注：デュアルルシフェラーゼアッセイを、表3で説明したように、2アッセイバッファ、3Xホタルアッセイバッファと3X ウミアッセイ緩衝液の連続添加を必要とするホタルおよびウミルシフェラーゼが分泌されない、このように細胞が前にルシフェラーゼ活性を測定するために溶解されなければならない。 。ホタルアッセイ緩衝液は、細胞を溶解し、ホタルルシフェラーゼの基質を提供し、 ウミシイタケアッセイ緩衝液は、ホタルシグナルを消光し、 ウミシイタケルシフェラーゼの基質を提供する。
- 表3に記載したように、各ライブラリープレートについては、ストック溶液から3Xホタルアッセイバッファを8mlを調製し、96ウェルV底プレートの各ウェルに82μlずつ分注する。
- 各ライブラリープレートについて、また3× ウミシイタケアッセイ緩衝液を12mlを調製し、96ウェルV底プレートの各ウェルに122μlずつ分注する。両方を脇に置きますホタルおよびウミアッセイ緩衝。
- ロボットデッキで（同じライブラリのプレートからトランスフェクト）ピペットチップの箱、廃液容器、およびセルの2枚を配置します。
- 各プレートからの培地の吸引物60μLと部分的に70％エタノールで満たされた廃棄物容器に廃棄します。プレートをカバーし、脇に置きます。複数のライブラリプレートをトランスフェクションした場合、プレートのすべてのセットのために繰り返します。
- 2ピペットチップの箱、3Xホタルアッセイバッファのプレートと、ロボットデッキに細胞プレートのセットを配置します。
- 3Xホタルアッセイバッファの吸引物40μLと十分に混合、細胞の第一プレートに追加します。新しいピペットチップへの切り替え、第二のセルプレートのために繰り返します。溶解が完了するまで室温で10分間細胞を置く。複数のライブラリ版をトランスフェクションする場合は、ヒントと細胞プレートのボックスを交換して、繰り返します。
- ウェルあたり1秒間記録ルミノメーター上の各細胞プレートの各ウェルからの記録発光、。ロボットにプレートを返すデッキ。
- 2ピペットチップの箱、3X シイタケアッセイバッファープレート、ロボットデッキ上の細胞プレートのセットを配置します。
- 吸引物60 3X ウミアッセイバッファーのμL、および十分に混合、細胞の第一プレートに追加します。ピペットチップの新しいボックスに切り替えて、第二のセルプレートのために繰り返します。複数のライブラリプレートをトランスフェクトした場合、細胞プレートのすべてのセットのために繰り返します。
- 上記のように1秒間各ウェルを記録するルミノメーター上のすべてのプレートからの記録発光、。プレートを捨てる。
5。データ解析
- ウミ信号のカウントによってホタル信号のカウント数で除して各ウェルについて： ウミ発光比（「R比F： "）ホタルを計算します。
- 井戸の最高と最低の25％を除いた、プレートのR比：各R比を十分に平均Fで、Fを分割することにより誘導値を計算します。
- 複製物全体に誘導値を平均シングルトランスフェクトライブラリプレート用。 α-シヌクレインを誘導または抑制遺伝子以上の3倍量この画面で「ヒット」とみなされ、さらに検証および二次スクリーニングの対象とされています。
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Representative Results
典型的なルシフェラーゼ値、F：R比およびシングルハーフプレート用の誘導値は、図4に示されているだけでなく、H2、32倍誘導剤でヒットに注意してください。過剰な毒性（例えば、よくE3）、または不十分なトランスフェクションした井戸を引き起こす遺伝子は、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼが、平均誘導値の両方のために低い値を生成します。 pGL4骨格との相互作用を介して 、おそらくルシフェラーゼ活性の非特異的誘導を引き起こす遺伝子は、誘導平均値が得られ、均等にホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ誘導する。複製物の間の誘導値が大幅に不一致が実行エラーのための疑いを発生させる必要があります。これは、増加した発現を引き起こすクローンが増加し、ルシフェラーゼ活性として測定されるように画面がレポーターアッセイの直線範囲内で行われることを確認することが重要である。我々は、直線性を検証するために、各レポーター遺伝子の増加量をトランスフェクト我々の実験条件下でレポーターアッセイを（ 図5）。それは、基板の枯渇への非線形性を避けるために、インキュベーション工程後速やかにアッセイを行うことも重要である。我々は、試薬（ 図6）の添加後1時間に有意なホタルルシフェラーゼ活性を観察した。
図1実験の概要。ライブラリDNAの各単板は2レポーター構築と一緒にし、細胞の複製プレートをトランスフェクトするために使用されている。 48時間後、各ルシフェラーゼレポーターの活性を順次測定する。各ライブラリプラスミドによりSNCAプロモータープラスミドの具体的な誘導はプレートベースnormalizatio後のウミシイタケルシフェラーゼに対するホタルの比率で計算されるN。
図2。第4染色体上にあるα-シヌクレイン（SNCA）の5 '領域の概略、ホタルレポータープラスミドで使用。プライマー名は、 表2の配列に対応する。ハッチマークが図から排除さ約8キロバイトのセグメントを示している、そうでないスケール。 SNCAのためのATG開始コドンは、エキソン3に位置している。
【図3】このスクリーニングプロトコルで使用されるルシフェラーゼレポータープラスミド。SNCAゲノム領域は、PGのマルチクローニングサイトにクローニングするホタルルシフェラーゼのすぐ上流L4.10。 ウミシイタケルシフェラーゼの発現を誘導のhCMV-IE1（ヒトサイトメガロウイルス最初期1）プロモーターを有するプラスミドを内部対照として用いた。両方のプラスミドはプロメガから市販されている。
図4単一96ウェルプレートの半分のための代表的な結果。 A.下流ホタルルシフェラーゼカウントB.下流ウミシイタケルシフェラーゼカウントC. F：それぞれFで割ることにより算出された各ウェルについてB. D.誘導値が値Aの値を割ることによって計算はR比：R比平均Fで：。井戸の上部と下部の25％を除いたプレートのR比、E.グラフィカル誘導値の表現のための単板は、よくH2、正のヒットと、強調した。ヒットH2は、以前SNCA発現に関連しない神経細胞の転写因子である。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図5直線アッセイ：細胞は、強いのhCMV-IE1プロモーターの制御下でホタルの量およびウミシイタケルシフェラーゼプラスミドを増大でトランスフェクトし、上記のプロトコルを用いてアッセイした。 （トランスフェクトされたDNAの総量は、中性バランサプラスミドを用いて一定に保った）。A.ホタル直線性アッセイ。ホタル活動は値。B. ウミ直線性アッセイの広い範囲で線形のままであることに注意してください。 15 NG /ウェル上記曲線のフラット化に注意してください。
図6ホタルルシフェラーゼアッセイのための減衰信号の経時ルシフェラーゼ試薬は時間0で、CMV-ルシフェラーゼ構築物でトランスフェシングルプレートに加えた。;連続測定は、さらなる試薬の添加なしで行った。
| コンポーネント | ボリューム | 最終濃度 |
| 5 NG /μLでBAC 2002-D6 | 4μL | - |
| 5XのPhusion GCバッファー | 20μL | 1X |
| DMSO | 6μL | 6％ |
| のdNTP（10mm）で | 2μL | 200μMの |
| フォワードプライマー（100μM） | 1μL | 10μMの |
| Reverseプライマー（100μM） | 1μL | 10μMの |
| のddH 2 O | 65μL | - |
| のPhusion DNAポリメラーゼ | 1μL | - |
| 合計：100μL |
α-シヌクレインのプロモーターを増幅するための表1。のPCRセットアップ。
| 名前 | シーケンス | 制限酵素認識部位 |
| SNCA7 | 5'-GTC GGTACC tgaagttaacctcccctcaatacc-3 ' | KpnIで |
| SNCA8 | 5'-TGC GAGCTC aagaagacagccatctgcaagcc-3 ' | SacIで |
| SNCA1 | 5'-TCT GAGCTC tctgagcatttccctaggtg-3 ' | SacIで |
| SNCA2 | 5'-タグCTCGAG ggctaatgaattcctttaca-3 ' | XhoIで |
表2、α-シヌクレインのプロモーターを増幅するためのプライマー NACPリピートアンプリコンが0.9 kbの断片を生成する必要があります。;他のアンプリコンの長さは3.4 KBです。プライマーの位置については、 図2を参照してください。
| ：3Xホタルアッセイバッファー | ||
| ストック溶液 （-80℃で保存） | 100ミリリットル3Xホタルアッセイバッファー当たりの体積 | 最終濃度（3X） |
| 500のDTT | 3.0ミリリットル | 15 mMの |
| 10mMの補酵素A | 6.0ミリリットル | 0.6 mMの |
| 100のATP | 0.45ミリリットル | 0.45mmの |
| 80ミリグラム/ mlluciferin | 0.525ミリリットル</ TD> | 4.2 mg / mlの |
| トリトン溶解緩衝液 | 90.025ミリリットル | - |
| B.トリトン溶解バッファー | ||
| コンポーネント （RTで店） | 100ミリリットルトリトン溶解バッファー当たりの体積 | 最終濃度 |
| トリス-HCl粉末 | 1.705グラム | 0.1082 M |
| トリス - ベース粉末 | 0.508グラム | 0.0419 M |
| 5のNaCl | 1.50ミリリットル | 75 mMの |
| 1 M MgCl 2を | 0.30ミリリットル | 3 mMの |
| トリトンX-100純粋な液体 | 0.75ミリリットル | 0.25％ |
| 水 | 100ミリリットル全量 | - |
| C. 3X ウミアッセイバッファー | ||
| 〜100ミリリットル3X ウミアッセイバッファー当たりの体積 | 最終濃度（3X） | |
| DMSO中10 mMのPTC124 | 0.6ミリリットル | 0.06 mMの |
| エタノールに2 mMのH-CTZ | 0.5ミリリットル | 0.01 mMの |
| ウミ塩 | 100ミリリットル | - |
| D. ウミ塩 | ||
| コンポーネント （RTで店） | 100ミリリットルウミ塩当たりの体積 | 最終濃度 |
| 0.5 MのNa 2 EDTA | 9.0ミリリットル | 45 mMの |
| NAピロリン | 1.34グラム | 30 mMの |
| NaClを | 8.33グラム | 1.425 M |
| 水 100ミリリットル全量 | - | |
表3。ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼアッセイ用のストック溶液およびアッセイバッファー。 A. 3Xホタルアッセイバッファのレシピ。 DTT、ジチオスレイトール。断りのない限り、全ての成分が水に可溶性である。B.トリトン。C. 3X ウミアッセイ緩衝レシピバッファレシピを溶解緩衝。 H-CTZ、H-セレンテラジン。 100パーセントエタノールの12.2ミリリットルの濃HCl 120μlに10 mgのH-CTZを追加することにより、2 mMのH-CTZを作る。 PTC124はDMSOに可溶である。D. ニラ塩レシピ。トリトン溶解緩衝液およびウミ塩をそれぞれ4℃およびRTで数週間安定である。 3Xホタルアッセイバッファと3X ウミシイタケアッセイ緩衝液は、ルシフェラーゼアッセイを行う3-4時間以内に混合されるべきである。
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Discussion
α-シヌクレインはレビー小体4、疾患のための考えられる特徴的な細胞内封入体の成分としてのパーキンソン病（PD）に関与している。数々のゲノムワイド関連解析は、散発的なPDの5,6,7リスクの増加とα-シヌクレインに一塩基多型をリンクされています。散発PDよりも一般的であるが、家族性PDはまた、α-シヌクレイン8と同様に、α-シヌクレイン遺伝子座9,10,11、また散発PD 12で見られる現象の重複や三重の変異によって引き起こされることがあります。まとめると、これらの研究は、PDの病因にα-シヌクレインの重要性を補強する。この画面の目的は、α-シヌクレインを調節し、従って、パーキンソン病の病因において役割を果たし得る遺伝子を同定することであった。このプロトコルを使用して、我々は140を表す、7,670ヒト遺伝子をスクリーニングし、154予備ヒット（少なくとも3倍の誘導因子）を同定しユニークな遺伝子。これらのヒットはヒット再現性を決定するために、新たなDNA調製を用いた二次アッセイに供した。 3倍の範囲内のヒットは、その後のルシフェラーゼアッセイの28％で再現。それぞれ、5倍の誘導因子 - 、5 - 再現性が4で59％、69％、および78％に増加した。 7倍以上の誘導とのヒットが100％の時間を再現した。我々は最終的には、α-シヌクレインの転写の68小説レギュレーターを同定した。
いくつかの証拠は、我々が得た68のヒットがα-シヌクレインの本当の調節因子であることを示唆している。同定されたヒットの私達のリストは、転写因子のGATAファミリーのメンバーが以前にSNCA発現3を調節することが示さ、GATA3を含む。いくつかの既知のSNCAレギュレータの1得点は、私たちの画面の信頼性に大きな自信を与えます。加えて、我々は独立して、ニューロンの転写因子の同一のファミリーのいくつかのメンバーに当たるように、採点画面が再現性のある遺伝子を同定することはないことを示唆しているランダムに。最も重要なことは、追加的なフォローアップのアッセイでは、神経細胞における内因性SNCA発現を調節する私たちのトップヒットの能力が過剰発現およびノックダウンアッセイで検証した。我々はトップのいくつかはSY5Yのドーパミン作動性細胞内BacMamvectors 3を使用してヒット過剰発現させ、これらのヒットのshRNAのノックダウンが減少SNCA mRNAレベルをもたらした、内因性SNCAレベルを2-8倍に増加させることができた。これらの研究は、最終的に私たちのトップヒットは、内因性SNCAレベルの調節因子であり、単純に解体ルシフェラーゼ系の人工物ではないことを示している。その他のヒットのための追加のフォローアップ研究では、私達のスクリーンでのヒットの完全なリストについては、真の偽陽性や偽陰性率を決定する必要があります。ヒットとパーキンソン病との関係の完全な説明は準備14である。
それは私たちのスクリーニング方法の限界を考慮することが重要です。それはOBVする必要があります画面はスクリーニングライブラリに存在しない任意のレギュレータを識別できないだろIOUの。当社のスクリーニングライブラリは、ヒトゲノムの約4分の1を含む、かなりあったが、それは包括的ではなかった。我々のアッセイの単純さを考えると、追加のライブラリを簡単にスクリーニングすることができた。私たちは、二次アッセイでは、ヒットのパラログ、含めることによって目標とする方法でスクリーニング遺伝子の数を増加させた。また、当社は、レポーター構築物に含まれているもの以外でのゲノム領域に結合した任意のヒットを獲得しません。適切な領域を含む可能性を最大化するために、私たち記者はSNCAプロモーターで見つかった複数の転写開始点のための即時の隣接配列を含んでいた。これは、追加の因子は、SNCA発現を調節するズーム即時プロモーター領域の外側の領域に結合する可能性がある。必要に応じて一度に〜10キロバイトの可能性がありますが、これらは、追加的なアップストリームおよびダウンストリームの領域に画面を実行することによって検出することができたによる効率的なプラスミドベクターにクローニングし、高コピー数pGL4ベクターの安定性に制限があるため、このようにssessed。代わりに、ルシフェラーゼ構築はSNCA遺伝子座を含むBACのDNAに後付けすることができた。後者のアプローチの1つの欠点はあっても理想的な条件下でのBACのトランスフェクションは、その後> 100倍効率が悪くなり15をプラスミドということです。別のアプローチは、「ノックイン」にルシフェラーゼレポーターを、内在性SNCA遺伝子座は、我々のアプローチはるかに面倒であるメソッドになります。また、過剰発現が増加し、ルシフェラーゼ活性をもたらさないように、既に飽和レベルで発現される任意のヒットを獲得しない。このような理由から、我々はSNCAの調節、神経要素が不足している可能性があり、実際に我々は、ニューロンの転写因子の数をスコアでした非神経293T細胞を、採用することにしました。 293T細胞の1つの潜在的な欠点は、しかし、それは必要に応じて、我々はヒットとして任意の遺伝子のスコアがないかもしれないことであるdditionalニューロンの要因が適切に機能するために。このように、すべての画面と同様に、私たちの研究では、潜在的なSNCAレギュレータの数を見逃す可能性があります。しかし、実際問題として、我々は10倍以上増加のSNCAの既知の調節因子の数を取得し、フォローアップするための長年にわたる経験が必要になります68のヒットで、その追加のヒットは私たちの場合には必要ないかもしれない。
なお、この方法を使用して発生する可能性がある潜在的なアーチファクトを実現することも重要である。化学の画面では、ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼタンパク質の安定化によってではなく、転写の誘導によって、人工的にスコアリング化合物のための悪名高いです。タンパク質の安定化の成果物を除外するために、我々はいくつかの他のプロモーター - ルシフェラーゼコンストラクトに対する我々のヒットをスクリーニングし、構成的プロモーターからの発現を上昇させることにより転写後に行動するように思われた任意のヒットを見つけられませんでした。別の潜在的なアーティファクトはpGL4ベクター骨格に結合するのではなく、トランス活性化因子である可能性がSNCAプロモーター。我々は、広範囲に、この問題を回避するために、転写因子結合部位を除去するために突然変異誘発されたpGL4ベクターを用いる。私たちのヒットのいずれかを誘導するためのベクター骨格を必要としたかどうかを評価するために、我々はすべてのバックボーンを欠いSNCA-ルシフェラーゼベクター領域を増幅するためのPCRを使用し、二次アッセイのためのレポーターとして、この線状断片を使用していました。私達は私達の完全なプラスミドレポーターと一つの例外を除いて直線状主鎖のない構造の間の誘導値に有意な差は認められなかった。 GATA2は、プラスミドレポーターで〜15倍の誘導を示したが、GATA2誘導のいくつかが原因基幹部品との結合であることができることを示唆しているリニア記者とだけ〜2.7倍、。
転写調節因子を同定するための他の多くの方法が記載されている。 30年近く前、トランスフェクションし、レポーター遺伝子の発現を介して強力なウイルスプロモーターにおけるシス作用性転写制御エレメントのマッピングは、ESTた16 ablished。この方法は、時にはそれが適切な初代細胞株を取得し、トランスフェクトすることが困難であるため、「プロモーターバッシングは、「細胞型特異的プロモーターのマッピングのための好意から落ちたと呼ばれ、そのような線は正確にそれらの起源組織を表さないかもしれない。融合遺伝子のライブラリーおよび特定のシス作用エレメントとの間の相互作用を検出するための解体レポーター系を提供することによって、酵母ワンハイブリッドシステム17はこの問題を、回避。我々のアプローチは、その解体設計に酵母1ハイブリッドシステムと似ていますが、我々のシステムでは、通常の発現クローンではなく、遺伝子融合を採用し、我々は、哺乳動物細胞ではなく、酵母を用いて、我々はサイド·バイ·サイド、定量を可能にするロボット工学を採用各試験遺伝子のための機能読み出し。有望な方法はまだ特定のゲノム領域に結合したタンパク質の同定は、18に記載されている可能にするが、クロマチン有する単離されたセグメント（PICH）のプロテオミクスと称される首尾よく単一コピーヒト遺伝子に適用されて。ゲノムワイドなクロマチン免疫沈降法（ChIP-seqのとのChIP-チップ）の研究は、大規模19上のシス作用性領域を同定するために使用されている。この方法は、潜在的に強力であるが、PICHと同様に、例えば、容易に均質な培養では得られない特定のニューロン集団のような細胞タイプにはあまり有用であり得る。我々は検証され、ヒットするためのチップのデータベースをチェックしているときまた、彼らはSNCAプロモーターにこれらのヒットの結合を示していない。我々は従来のチップ14でSNCAプロモーターにこれらの要因の結合を示すことができたので、この理由は、明確ではありません。それは、マイクロアレイの読み出し（チップチップ）を用いたチップの研究で採用されている全体SNCAプロモーター領域が不足しているためかもしれません。本手法で生成される直接的な機能リードアウトに接続されたときのChIP-seqのPICH、およびその他のプロテオミクスのアプローチは、したがって、最も有用であろう。
デュアルルシフェラーゼホタル採用し、 ウミシイタケルシフェラーゼアッセイは、ハイスループットフォーマット20で多数の細胞内プロセスを研究のための高感度な方法を提供します。ホタルルシフェラーゼを標的プロモーターの融合は、α-シヌクレインの1,2を含むin vitroでの数々のターゲットの転写調節およびプロモーター構造を研究するために使用されています。私たちは、強いシグナルを提供し、我々のアッセイ（ 図6）の範囲で直線であった市販のデュアルルシフェラーゼ試薬に安価な代替品を開発しました。我々の方法は、寛大に、NIH、前述の非商用のデュアルルシフェラーゼアッセイ21でロン·ジョンソンが提供するプロトコルから適応される。ホタルアッセイ緩衝液は、細胞を溶解し、ATPおよびルシフェリンを提供し、ホタルルシフェラーゼの基質。このアッセイは、約1時間の半減期（ 図7）付きグロー反応を生じる。 ウミアッセイ緩衝液はfireflを消光Y信号と適切な基質（セレンテラジン）を提供します。 ウミシイタケアッセイ緩衝液自体が細胞を溶解せず、トリトン溶解緩衝液またはホタルアッセイバッファのいずれかと組み合わせて使用されなければならないことに留意されたい。そこで我々は、我々は硫酸ナトリウムを排除し、60％のピロリン酸ナトリウムの量が減少し、容易にRTで沈殿前述のことをウミシイタケアッセイ緩衝剤を発見した。私たちのアッセイはまた、PTC124、アッセイで追加の消光を貢献するホタルルシフェラーゼ22の強力な阻害剤が含まれています。クエンチング活性は、EDTA、NaClおよびウミ緩衝液中のピロリン酸によって提供される。これらの新しい製剤を用いて、ホタル活性の約99.5％は、 ウミ緩衝液によりクエンチする。両方のホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼシグナルの強度および再現性が若干バッファ（ステップ4.6および4.10）の添加後に混合することにより、改善された。
我々の経験、完全なAにpGL4.10におけるLPHA-シヌクレインプロモーターは、おそらくため、イントロン2において、GCリッチ領域と複雑な二次構造の、増幅し、クローニングするために、独自に困難である。我々は不安定なインサートのクローニングに最適化されていSTBL4テントセル、最も成功した。でも、これらの注意に続き、我々は頻繁に変異体を回復している中で、E.大腸菌ゲノムDNAを、構築物の3 '末端に挿入した。この変異体は、（5.8キロバイト、正しいクローン中の2.8キロバイト対）をBamHIで消化し、約5.8キロバイトと4キロバイトのバンドを作成し、選択プレート上の大きなコロニーとして表示されます。慎重に30℃でコンピテント細胞の増殖および飽和に到達するのを防止する培養物は減少するが、変異体を回収する可能性を排除しない。我々は、トランスフェクションの前に制限酵素消化し、ゲル電気泳動により、すべてのDNA調製物の純度を確認することをお勧めします。
このスクリーニングプロトコルは、容易に、他のプロモーターに適合されるdはすでに標的プロモーターを調節することが知られて陽性および陰性対照遺伝子を用いて、それに応じて最適化されなければならない。いくつかの考慮事項がレポータープラスミドのクローニングおよびトランスフェクションに適用されます。ホタルルシフェラーゼレポータープラスミドに標的プロモーターをクローニングすると、ルシフェラーゼの開始部位は、標的遺伝子の翻訳開始部位を近似すべきである。デュアルルシフェラーゼスクリーンは、典型的にはプラスミド骨格の影響を最小限に抑えるために、HSV-tkプロモーターなどの最小プロモーターの制御下でウミシイタケプラスミドを置く。しかし、我々は、このプロモーターを誘導した私たちの肯定的なコントロールの1つに、このように我々は、CMVプロモーターを選んだことがわかった。各レポータープラスミドの相対的な量は、経験的に決定されるべきであり、各プロモーターの構成的活性によって影響される。理想的なベースライン（トランスフェクションしたが、非誘導）ルシフェラーゼ数は、少なくとも5〜10倍図書館（室）の検出を可能にするために、非トランスフェクト細胞からのバックグラウンドの上でなければなりませんY抑制遺伝子または低い信号をもたらすことの原因毒性、。スクリーニングの前に、照度計の間で変動し得る、期待ルシフェラーゼ数は各アッセイの直線範囲内に収まることを確認してください。 （私たちのウミは 、一般的に数えることに注意してください我々のアッセイの線形範囲の上端に分類されます。）我々は、このように我々は、この記者の最小限の量を使用し、ホタルレポータープラスミドにライブラリーDNAの割合を増加させることは、より高い誘導をもたらすことを発見した。
トランスフェクションプロトコールは、同様に最適化されなければならない。我々は、トランスフェクションのそれらの相対的な容易さのために、293T細胞を選んだの効率は、遠心分離工程（工程3.5）を添加して50倍増加した。ドーパミン作動ラインSY5Yは、我々の手の中にかけて100倍以下でトランスフェクションであり、かつ、上述したように、過剰発現のスクリーニングを実施するための最適ではないかもしれません。我々の最適なアッセイ時間は経験的に48時間であると決定された、従って、我々の細胞は、低い初期密度で播種した、10〜70％コンフルエントで細胞をトランスフェクトするために設計されてOptifectの使用を必要とする。他の細胞株は、異なる出発濃度および異なるトランスフェクション試薬を必要とし得る。私たちは、（存在するならば、トランスフェクションの際に毒性を引き起こす可能性）抗生物質を追加するために、トランスフェクション後、細胞培地を変更することにしました。これは、細菌汚染の可能性を減少させるが、他のシステムにこのプロトコルを適応させるとき、したがって、このステップの必要性が評価されるべき材料（特に、ロボットピペットチップ）にコストを増加させる。ルシフェラーゼアッセイは、最小限の最適化で使用されるが、異なる細胞型で高スループットでこのアッセイを行う前に、細胞を適切トリトン溶解緩衝液によって溶解されていることを確認することができる。トリトンX-100は、セレンテラジンの自家蛍光を発生することに注意してください。我々のアッセイにおいて、ウミシイタケ信号は、この効果を矮小化するのに十分強力であったが、他の細胞型のために、このアッセイを最適化する際に、周辺にトリトンX-100のボリュームを制限する細胞溶解に必要なニマル量。
我々は、一過性のデュアルルシフェラーゼレポーター系をトランスフェクトした細胞を用いて、α-シヌクレインの新規な転写調節因子を同定するための迅速かつ比較的安価なスクリーニング方法を提示している。このプロトコルは、関心のある他の遺伝子を対象とする、容易に変更可能であり、また、このようなレンチウイルスの生産23などのハイスループットトランスフェクションを必要とするあらゆるアプリケーションに適合させることができる。
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Disclosures
この作業は、ライセンスBacMamreagents（米国特許5731182）により得られた使用料によってサポートされていました。
Acknowledgments
我々は、DNAスクリーニングライブラリの調製のためのMGHのDNAコアのジョンDargaに感謝します。パーキンエルマーのクリストファーChigasは、私たちのワラック1420ルミノメーターのための貴重な支援を提供した。スティーブンCiaccoとAgilentのマーティン·トーメはブラボーロボットのためのサポートを提供した。我々は寛大に自分のデュアルグロールシフェラーゼアッセイプロトコルを提供するためのNIHのロン·ジョンソンとスティーブタイタスに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K2100-12 | |
| PureLink PCR Micro Kit | Invitrogen | K310250 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K2100-03 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K2100-07 | |
| Bravo Robot | Agilent | - | |
| Robot Pipet Tips with Filter | Agilent | 19477-022 | |
| Robot Pipet Tips without Filter | Agilent | 19477-002 | |
| Clear-bottomed 96-well Plates | Corning | 3610 | |
| Reservoirs | Axygen | RES-SW96-HP-SI | |
| Polystyrene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651101 | |
| Polypropylene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651201 | |
| Adhesive Plate Covers | CryoStuff | #FS100 | |
| Reagent | |||
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| BAC 2002-D6 | Invitrogen | 2002-D6 | |
| Calf Intestine Alkaline Phosphatase | Roche | 10713023001 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| pGL4.74 | Promega | E6931 | |
| ElectroMAX Stbl4 Competent Cells | Invitrogen | 11635-018 | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| DMEM without Phenol Red | Invitrogen | 31053-028 | |
| Optifect | Invitrogen | 12579017 | |
| Ciprofloxacin | CellGro | 61-277-RF | |
| Tris-Hydrochloride Powder | Sigma | 93287 | |
| Tris-Base Powder | Sigma | 93286 | |
| Triton X-100 Pure Liquid | Fisher | BP151-100 | |
| DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
| C–nzyme A | Nanolight | 309 | |
| ATP | Sigma | A6419 | |
| Luciferin | Invitrogen | L2912 | |
| h-CTZ | Nanolight | 301 | |
| PTC124 | SelleckBiochemicals | S6003 | |
References
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