Summary
Apresentamos um método de triagem rápida e de baixo custo para a identificação de reguladores de transcrição usando de alto rendimento transfections robóticos e um ensaio de luciferase dual-brilho caseiro. Este protocolo gera rapidamente dados funcionais diretos side-by-side para milhares de genes e é facilmente modificável para atingir qualquer gene de interesse.
Abstract
Apresenta-se um protocolo rápido e barato de rastreio de alto rendimento para identificar reguladores transcricionais de alfa-sinucleína, um gene associado com a doença de Parkinson. As células 293T são transfectadas transitoriamente com os plasmídeos a partir de uma biblioteca de expressão de ORF formado, em conjunto com os plasmídeos repórter da luciferase, em um formato de um gene-por-microplaca. A actividade da luciferase do pirilampo é ensaiado após 48 horas para determinar os efeitos de cada biblioteca de genes mediante transcrição alfa-sinucleína, normalizadas para a expressão de uma construção de controlo interno (de um promotor de hCMV dirige a luciferase da Renilla). Este protocolo é facilitada por um robô de bancada fechado numa cabine de segurança biológica, que executa a manipulação asséptica líquido em formato de 96 poços. O protocolo de transfecção automatizado é facilmente adaptável para maior rendimento da produção de biblioteca lentiviral ou outros protocolos de rastreio funcionais que requerem triple-transfecções de um grande número de plasmídeos biblioteca original em conjunction com um conjunto comum de plasmídeos auxiliares. Apresentamos também uma alternativa barata e validado para comercialmente disponíveis, dupla reagentes luciferase que emprega PTC124, EDTA, e pirofosfato de suprimir a atividade da luciferase de vaga-lume antes da medição de Renilla luciferase. Usando esses métodos, nós analisamos 7.670 genes humanos e identificou 68 reguladores de alfa-sinucleína. Este protocolo é facilmente modificável para atingir outros genes de interesse.
Introduction
A capacidade de identificar elementos reguladores genéticos chave e os fatores que atuam sobre eles é fundamental para a exploração de numerosos processos biológicos. No entanto, a identificação de fatores que regulam a expressão de genes em tipos de células raras, como populações neuronais específicas, pode ser um desafio. Aqui, nós apresentamos um protocolo para a identificação de novos reguladores transcricionais de alfa-sinucleína (SNCA), um gene associado com a doença de Parkinson e expresso em neurónios dopaminérgicos na substantianigra região pars compacta do mesencéfalo. Nós conseguimos isso usando uma tela repórter de alto rendimento, dual-luciferase, in vitro para desconstruir expressão alfa-sinucleína em células 293T. O promotor de alfa-sinucleína é primeiro clonado num plasmídeo repórter contendo o gene da luciferase do pirilampo. Um plasmídeo disponível comercialmente contendo a luciferase de Renilla sob o controlo de um promotor constitutivamente activo serve como um controlo interno. Tsconstruções repórter e são co-transfectados para células 293T em microplacas com plasmídeos de uma biblioteca de expressão de ADN, de modo a que cada poço é transfectada com um único plasmídeo biblioteca. Após 48 horas, a atividade de luciferase para cada repórter é medido sequencialmente através de um ensaio duplo-brilho. A expressão relativa de alfa-sinucleína em resposta a cada gene biblioteca é inferida pela relação de pirilampo: a actividade da luciferase de Renilla em cada poço (F: razão R) após normalização com base em placa.
Este protocolo prevê a possibilidade de um número elevado de genes (~ 2.500 por semana) por sua capacidade de transativar um gene repórter utilizando mão de obra mínima (1-2 pessoas) e um custo mínimo (cerca de US $ 3 Custo reagente por ensaio microplaca). Reguladores da transcrição de genes neuronais (por exemplo, alfa-sinucleína), que são difíceis de estudar em neurónios cultivados refractários a manipulação genética, podem ser comparados lado a lado no presente ensaio funcional directa. Nós incluímos em nossoprotocolo de um método detalhado para a clonagem e crescimento de plasmídeos contendo o promotor de alfa-sinucleína, uma vez que descobrimos que os plasmídeos contendo esta região são instáveis quando cultivadas com procedimentos convencionais (ver discussão). Nós também incluímos uma alternativa barata para comercialmente disponíveis reagentes dual-luciferase para ensaios de alto rendimento. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para atacar outros elementos reguladores de interesse, ou para qualquer processo que requer a high-throughput transfecções transientes.
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Protocol
Para uma visão geral experimental, ver Figura 1.
1. Prepare plasmídeos repórter contendo a alfa-sinucleína Promotor
Os elementos reguladores do gene da alfa-sinucleína (Figura 2) abranger cerca de 10 kb, a montante do PNS (A-beta não componente de peptídeo amilóide) dinucleótido sequência de repetição de 1,2 através de intrão 2 3. Nós incluem uma porção dessa região nossa construção repórter. Descobrimos que plasmídeos contendo intron 2 necessários procedimentos especiais para o crescimento, como descrito abaixo. Os plasmídeos de luciferase, e pGL4.10 pGL4.75 (Figura 3), encontram-se comercialmente disponíveis a partir de Promega e podem ser propagadas por meio de protocolos de biologia molecular convencionais.
- Amplificar os dois componentes do promotor de alfa-sinucleína em PCR separadas utilizando a receita na Tabela 1 e os iniciadores na Tabela 2.
- Verify produtos de PCR sobre um gel de agarose e limpos utilizando o kit de purificação PCR QIAquick (Qiagen), eluindo-se em 50 ul de TE (Tris-EDTA). Armazenar o eluído fragmento 0,9 kb a -20 ° C para uso futuro.
- Digerir o volume total de 3,4 kb do fragmento de PCR, assim como 5 ug de pGL4.10, com Saci e Xhol. Tratar o vector com fosfatase alcalina de intestino de vitelo (Roche) e purificar em gel utilizando o kit de PureLink rápida Gel Extraction (Invitrogen).
- Ligar o fragmento e o vector utilizando ADN-ligase de T4 (NEB). Limpar a reacção concluída, utilizando o kit de PCR PureLink Micro (Invitrogen), eluindo-se em 10 ul de tampão TE.
- Transformar 2 ul do limpa, reacção de ligação em 20 ul de células competentes Electromax Stbl4 (Invitrogen) e electroporate acordo com as instruções do fabricante. Agitar em um de 30 ° C numa estufa a 225 rpm durante 90 min. Espalhe 2 volumes em placas de LB contendo 100 mg / ml de ampicilina e incubar a 30 ° C durante 2 dias.
- Usando um palito, selecione 4-6 pequenas colônias para inoculação em 2 ml de TB (Terrific Broth). Crescer estas culturas miniprep num agitador de 30 ° C O / N.
- Purifica-se o DNA de plasmídeo a partir de 1,5 ml de cada cultura utilizando o kit miniprep PureLink HiPure plasmídeo Miniprep (Invitrogen).
- Digerir as minipreps com BamHI e electroforese em gel de agarose. O clone correta deve produzir fragmentos de 2,8 kb e 4,9 kb.
- Restreak a cultura restante de miniprep a partir do clone correcto em LB (Luria Broth) placa fresca e crescer a 30 ° C durante 2 dias.
- Selecione uma pequena colônia e inocular uma cultura inicial de 1,5 ml TB. Agite O / N a 30 ° C. Não deixe que a cultura inicial crescer a saturação.
- Diluir toda a cultura de arranque em 150 ml de TB pré-aquecido e agitar a 30 ° C por 2 dias. Antes de prosseguir para o próximo passo, utilizar de 1,5 ml desta cultura para uma digestão adicional e miniprep para confirmar que o clone não se transformam durante replicati na.
- Purifica-se o DNA de plasmídeo a partir da cultura restante, utilizando o kit Plasmid Maxiprep PureLink HiPure (Invitrogen). Rendimentos esperados deste plasmídeo intermediário são 50-150 mg por 150 ml de cultura.
- Descongelar o fragmento de 0,9 kb congeladas na etapa 1.2. Repetir Passos 1,3-1,12 para clonar o fragmento de 0,9 kb no plasmídeo intermediário, digerindo vez com Kpnl e Saci. Ligadura, transformar, selecionar e crescer para maxipreps como acima. A digestão com BamHI deve originar fragmentos de 5,8 kb e 2,8 kb. Este é o plasmídeo que será utilizado para a tela.
2. Prepare células 293T, Repórter Plasmids e DNA Biblioteca de Triagem
As células 293T foram semeadas em primeiro lugar em placas de 96 cavidades e foram transfectadas no dia seguinte. Os plasmídeos repórteres e ADN de biblioteca são diluídos em placas de 96 poços. Obtivemos placas de biblioteca de DNA transfecção-grade a partir do DNA do núcleo no Massachusetts General Hospital (obter = "_blank"> dnacore.mgh.harvard.edu). Este protocolo transfects uma única chapa de biblioteca em duas placas idênticas de células 293T (Figura 1), assim, duas placas de células deveriam ser semeadas por cada placa de biblioteca a ser rastreada.
Nota: Cresça as células em meio sem vermelho de fenol ou antibióticos, uma vez que estes interferem com os ensaios de luciferase e aumentar a toxicidade durante a transfecção, respectivamente.
- Para cada placa de biblioteca a ser rastreada, ressuspender as células 293T com tripsina a uma concentração de 1,5 x 10 5 células / ml em DMEM contendo 14% de FBS. Despeje em um reservatório estéril (Axygen).
- Coloque o reservatório, 2 de fundo claro, placas de 96 poços (Corning), e uma caixa de filtro de pontas de pipeta (Agilent) sobre o convés do robô. Pipetar 100 ul de células em cada poço de ambas as placas, para uma densidade de 1,5 x 10 4 culas por po.
- Centrifugar as placas de celulares a 50 xg por 2 min, usando baixas velocidades de rampa para garantir a igualdadedensidade celular ao longo de cada poço. Incubar a 37 ° C e 10% de CO 2 S / N.
- Diluir o pirilampo e Renilla plasmídeos repórter a 5 ng / mL em meio isento de soro. Combina-se as diluições em uma proporção de 05:03 de pirilampo para Renilla plasmídeo (em volume) em um tubo de 15 ml.
- Pipeta os plasmídeos combinadas em cada poço de uma placa de 96 poços, a dosificação de 17 ul por placa biblioteca, mais excesso de 2-10 ul, a cada poço.
- Obtenção de placas da biblioteca de ADN de transfecção grau como acima e diluir a 13,3 ng / mL com água isenta de endotoxina. O volume mínimo por poço deve ser de 28 mL.
3. Realizar transfecções
No dia 2 da tela, plasmídeos repórter e ADN de biblioteca são transfectados para células 293T.
- Para cada placa de biblioteca, mistura de 107,5 ul de RT Optifect (Invitrogen) com 4,3 ml de meio isento de soro (diluição 1:40) em um tubo de poliestireno. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente, e on dispensar 44 ul (por placa de biblioteca) para cada poço de uma placa de 96 poços, de fundo V de poliestireno (Greiner).
- Coloque a placa de diluído Optifect, plasmídeos repórter (Passo 2.5), DNAs biblioteca (Passo 2.6), e uma caixa de pontas de pipeta na plataforma do robô.
- Aspirar 17 l de plasmídeos repórter, 43 mL de diluído Optifect, e 26 mL de DNA biblioteca, inserindo um espaço de ar 5 jul entre cada aspiração. O ADN da biblioteca devem ser aspirados última para evitar a contaminação cruzada. Dispense o conteúdo das dicas para uma nova placa de poliestireno-V fundo, misture, tampe e reserve por 20 minutos para permitir que os complexos de lipídios / DNA para formar. Se transfecção de múltiplas placas de biblioteca, substituir as pontas de pipeta e placa de biblioteca, e repita.
- Descubra a placa de mistura Optifect / DNA e colocá-lo na plataforma do robô com 2 placas de células 293T. Usando uma única caixa de pontas de pipeta, aspirado 80 ml da Optifect: mistura de DNA e, lentamente, dispensar 40 mL em cada placa de células. Se transfecting múltiplas placas de biblioteca, repita para todos Optifect: placas de DNA. Cubra células.
- Centrifugar as placas da célula de 1.200 xg durante 30 min. Cobrir e retornar para a incubadora.
- Incubar as células por 4-6 horas. Durante esta incubação, preparar por meio fresco por mistura de 12 ml de DMEM contendo 10% de FBS e 10 ng / ml de ciprofloxacina (Cellgro) para cada placa transfectada biblioteca. Despeje meio fresco em um reservatório estéril.
- Coloque 2 caixas de dicas robô, uma única placa de células, o reservatório contendo meio fresco, e um reservatório de resíduos para o convés do robô. Aspirar 100 ul de meio a partir das células e dispensar para o reservatório de resíduos parcialmente preenchido com etanol a 70%. Utilizando pontas frescas, aspirado de 100 ul de meio fresco e dispensar lentamente sobre as células. Repita o procedimento para todas as placas de células.
- Retornar placas na incubadora durante 48 h.
4. Realizar luciferase dupla Ensaios
No dia 4 de tela, ovaga-lume e Renilla ensaios de luciferase são executadas.
Nota: O ensaio de luciferase dupla requer a adição sequencial de dois tampões de ensaio, 3X tampão de ensaio de pirilampo e Renilla tampão de ensaio 3X, como descrito na Tabela 3 do vaga-lume e luciferase Renilla não são segregadas, assim, as células devem ser lisados antes de se medir a actividade da luciferase. . Tampão de ensaio de pirilampo lisa as células e proporciona substrato para a luciferase do pirilampo; tampão de ensaio de Renilla extingue o sinal de pirilampo e proporciona substrato para a luciferase de Renilla.
- Para cada placa de biblioteca, preparar 8 ml de tampão 3X pirilampo ensaio a partir de soluções estoque como descrito na Tabela 3, e dispensar 82 mL em cada poço de uma placa de 96 poços de fundo em V.
- Para cada placa de biblioteca, também preparar-se 12 ml de tampão de ensaio 3X Renilla e dispensar 122 mL em cada poço de uma placa de 96 poços de fundo em V. Ponha de lado tanto ovaga-lume e Renilla buffers ensaio.
- Colocar uma caixa de pontas de pipeta, um reservatório de resíduos, e duas placas de células (transf a partir da mesma chapa de biblioteca) sobre o convés do robô.
- Aspirar 60 ul de meio de cada placa e descartar no reservatório de resíduos parcialmente preenchido com etanol a 70%. Placas de cobertura e reserve. Se transfecção de múltiplas placas de biblioteca, repita para todos os conjuntos de placas.
- Coloque 2 caixas de pontas de pipeta, a placa de 3X tampão vagalume ensaio, e um conjunto de placas de celulares na plataforma do robô.
- Aspirar 40 ul de tampão 3X pirilampo ensaio e adicioná-lo à primeira placa de células, misturando cuidadosamente. Mudar para novas pontas de pipeta, repita o procedimento para a segunda placa celular. Colocar as células à temperatura ambiente durante 10 min para completar a lise. Se transfecção de múltiplas placas de biblioteca, substituir as caixas de sugestões e placas celulares, e repita.
- Ficha de luminescência de cada poço da placa de células em cada um luminómetro, a gravação de um segundo por poço. Retornar placas ao robôdeck.
- Colocar duas caixas de pontas de pipeta, a placa de tampão de ensaio 3X Renilla, e um conjunto de placas da célula no convés do robô.
- Aspirar 60 ul de tampão de ensaio 3X Renilla, e adicioná-lo à primeira placa de células, misturando cuidadosamente. Mudar para uma nova caixa de pontas de pipeta, repita o procedimento para a segunda placa celular. Se transfecção de múltiplas placas de biblioteca, repita para todos os conjuntos de placas celulares.
- Grave luminescência de todas as placas em um luminometer, registrando cada poço por 1 segundo acima. Descarte placas.
5. Análise de Dados
- Calcule o vaga-lume: relação Renilla luminescência ("F: Relação R") para cada bem, dividindo as acusações de sinal de vaga-lume pelas acusações de sinal Renilla.
- Calcular o valor de indução através da divisão do F: razão R de cada poço pela média F: relação R da placa, excluindo o mais alto e mais baixo de 25% dos poços.
- Calcular a média dos valores de indução através de repetiçõespara uma única placa de biblioteca transfectadas. Genes induzindo ou reprimindo alfa-sinucleína mais de três dobras são considerados "hits" nesta tela e estão sujeitos a uma validação adicional e telas secundárias.
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Representative Results
Os valores típicos da luciferase, F: rácios R e os valores de indução para um único semi-placa são mostrados na Figura 4 Nota da batida no bem H2, um indutor de 32 vezes.. Genes que causam toxicidade excessiva (por exemplo, bem E3), ou poços que foram mal transfectadas, irá produzir valores baixos, tanto para vaga-lume e luciferases Renilla, mas um valor médio de indução. Os genes que causam indução não específica da actividade da luciferase, talvez através da interacção com a coluna vertebral pGL4, irá induzir luciferases do pirilampo e Renilla igualmente, resultando em um valor médio de indução. Grandes discrepâncias nos valores de indução entre repetições deve levantar a suspeita de erros de execução. É importante verificar se a tela é realizada dentro da faixa linear dos ensaios repórter para que clones que causam o aumento da expressão será medido como aumento da atividade da luciferase. Nós transfectadas quantidade cada vez maior de cada gene repórter para validar a linearidadedo ensaio repórter sob nossas condições experimentais (Figura 5). É também importante para a realização dos ensaios de imediato após o passo de incubação, para evitar a não linearidade, devido ao esgotamento de substrato. Observou-se a actividade da luciferase do pirilampo significativa até 1 hora após a adição de reagentes (Figura 6).
Figura 1. Resumo Experimental. Cada placa única de ADN de biblioteca é combinado com 2 construções repórter e usadas para transfectar as placas duplicadas de células. Após 48 horas, a actividade de cada repórter da luciferase é medida sequencialmente. A indução do promotor específico de plasmídeo SNCA por cada plasmídeo biblioteca é calculada pela relação de pirilampo para a luciferase da Renilla após normalizatio baseada em chapan.
Figura 2. Esquemática da região de 5 'de alfa-sinucleína (SNCA), localizado no cromossoma 4, utilizado no plasmídeo de pirilampo. Nomes de iniciadores correspondem às sequências na Tabela 2. Marcas de escotilha indicar um segmento de aproximadamente 8 kb eliminado a partir da figura , caso contrário, à escala. O codão de iniciação ATG para SNCA está localizado no exão 3.
Figura 3. Plasmídeos repórter de luciferase utilizados neste protocolo de rastreio. As regiões genómicas SNCA são clonados no sítio de clonagem múltipla de pGL4.10 imediatamente a montante da luciferase do pirilampo. Um plasmídeo com o hCMV-IE1 (citomegalovírus humano 1 precoce imediato) promotor que dirige a expressão da luciferase de Renilla foi utilizado como um controlo interno. Ambos os plasmídeos são comercialmente disponíveis da Promega.
Figura 4. Resultados representativos para a metade de uma única placa de 96 poços. A. primas contagem firefly luciferase contagens luciferase B. Raw Renilla C. F:. Relações R, calculado dividindo-se o valor em A pelo valor em valores B. D. Indução para cada bem, calculado dividindo-se cada F: relação R. pela média F:. relação R da placa, excluindo a parte superior e inferior de 25% dos poços E. Representação gráfica dos valores de indução para uma única placa, com bem H2, um sucesso positivo, destacou. Hit H2 é um fator de transcrição neuronal não previamente associadas com a expressão SNCA. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 5. Ensaios de linearidade. Células foram transfectadas com quantidades crescentes de pirilampo e Renilla plasmídeos de luciferase sob o controlo do forte promotor de hCMV-IE1 e ensaiadas com o protocolo acima. (A quantidade total de ADN transfectado foi mantida constante através da utilização de um plasmídeo balanceador neutro). Ensaio linearidade A. Firefly. Note-se que a atividade continua a ser vaga-lume linear através de uma ampla gama de valores de ensaio linearidade B. Renilla.. Note-se a inclinação da curva acima de 15 ng / poço.
.. Figura 6 Curso de tempo de decaimento do sinal de ensaio de luciferase de pirilampo reagentes luciferase foram adicionados a uma única placa transfectada com um CMV-luciferase construir no tempo 0; medições em série foram feitas sem a adição de outros reagentes.
| Componente | Volume | Concentração final |
| BAC 2002-D6 a 5 ng / mL | 4 mL | - |
| 5X Phusion GC Tampão | 20 ul | 1X |
| DMSO | 6 mL | 6% |
| dNTPs (10 mm) | 2 ul | 200 uM |
| Adiante Primer (100 uM) | 1 ul | 10 uM |
| Reverse Primer (100 uM) | 1 ul | 10 uM |
| DDH 2 O | 65 mL | - |
| Phusion DNA polimerase | 1 ul | - |
| Total de: 100 l |
Tabela 1. PCR set-up para amplificar o promotor alfa-sinucleína.
| Nome | Seqüência | Restrição do Site |
| SNCA7 | 5'-GTC ggtacc tgaagttaacctcccctcaatacc-3 ' | KpnI |
| SNCA8 | 5'-TGC gagctc aagaagacagccatctgcaagcc-3 ' | Saci |
| SNCA1 | 5'-TCT gagctc tctgagcatttccctaggtg-3 ' | Saci |
| SNCA2 | 5'-tag CTCGAG ggctaatgaattcctttaca-3 ' | XhoI |
.. Tabela 2 Primers para amplificar o promotor alfa-sinucleína A Repita amplicon NACP deve produzir um fragmento de 0,9 kb; o outro comprimento de fragmento amplificado é de 3,4 kb. Para locais de primers, por favor, consulte a Figura 2.
| A: 3X Firefly Tampão de Ensaio | ||
| Soluções de Stock (armazenar a -80 ° C) | Volume 100 ml 3X Firefly Tampão de Ensaio | Concentração final (3X) |
| DTT 500 mM | 3,0 ml | 15 mM |
| 10 mM de coenzima A | 6,0 ml | 0,6 mM |
| ATP 100 mM | 0,45 ml | 0,45 mM |
| 80 mg / mlluciferin | 0,525 ml </ Td> | 4,2 mg / mL |
| Tampão de lise Triton | 90,025 ml | - |
| B. Tampão de Lise Triton | ||
| Componente (loja em RT) | Volume 100 ml Triton Tampão de Lise | Concentração final |
| Tris-HCl pó | 1.705 g | 0,1082 M |
| Pó de Tris-base de | 0,508 g | 0,0419 M |
| NaCl 5 M | 1,50 ml | 75 mM |
| 1 M de MgCl2 | 0,30 ml | 3 mM |
| Triton X-100 líquido puro | 0,75 ml | 0,25% |
| Água | para 100 ml de volume total | - |
| C. 3X Renilla Tampão de Ensaio | ||
| Volume por ~ 100 ml 3X Renilla Tampão de Ensaio | Concentração final (3X) | |
| PTC124 10 mM em DMSO | 0,6 ml | 0,06 mM |
| 2 mM de h-CTZ em etanol | 0,5 ml | 0,01 mM |
| Renilla Sais | 100 ml | - |
| D. Renilla Sais | ||
| Componente (loja em RT) | Volume por 100 ml de Renilla Sais | Concentração final |
| 0,5 M de Na 2 EDTA | 9,0 ml | 45 mM |
| Na Pyrophosphate | 1,34 g | 30 mM |
| NaCl | 8,33 g | 1.425 M |
| Água para 100 ml de volume total | - | |
Tabela 3. Soluções Stock e buffers do ensaio para o vaga-lume e Renilla ensaios de luciferase. A. 3X receita tampão vagalume ensaio. DTT, ditiotreitol. Salvo indicação, todos os componentes são solúveis em água. B. Triton lise receita tampão C. 3X Renilla receita tampão de ensaio.. h-CTZ, h-coelenterazina. Adicione 2 mM h-CTZ pela adição de 10 mg de H-CTZ para 12,2 ml de EtOH a 100% e 120 mL de HCl concentrado. PTC124 é solúvel em D. Renilla sais receita DMSO.. Triton tampão de lise e sais Renilla são estáveis durante várias semanas a 4 ° C e temperatura ambiente, respectivamente. Tampão de ensaio vagalume 3X e tampão de ensaio 3X Renilla deve ser misturado dentro de 3-4 horas da realização do ensaio de luciferase.
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Discussion
Alfa-sinucleína foi implicada na doença de Parkinson (PD), como um componente de corpos de Lewy, 4 inclusões intracelulares considerados patognomónico para a doença. Numerosos estudos de associação do genoma ligaram polimorfismos de nucleotídeo único em alfa-sinucleína com risco aumentado para esporádica PD 5,6,7. Embora menos comum do que a PD esporádica, PD familiar também pode ser causada por mutações em alfa-sinucleína 8, bem como a duplicação e triplicação do locus alfa-sinucleína 9,10,11, fenômeno também observado na DP esporádica 12. Tomados em conjunto, estes estudos reforçam a centralidade da alfa-sinucleína na patogênese da DP. O objectivo deste ensaio foi a identificação de genes que regulam a alfa-sinucleína e, por conseguinte, pode desempenhar um papel na patogénese da doença de Parkinson. Usando este protocolo, nós analisamos 7.670 genes humanos e identificou 154 visitas preliminares (pelo menos 3 vezes indutores), representando 140genes únicos. Estas visitas foram sujeitos a ensaios secundários usando novas preparações de DNA para determinar hit reprodutibilidade. Acertos na gama de 3 vezes reproduzida em 28% dos ensaios de luciferase subsequentes. Reprodutibilidade aumentada para 59%, 69%, e 78% em 4 -, 5 -, e indutores de 5 vezes, respectivamente. Hits com induções mais de 7 vezes superior reproduzida 100% do tempo. Nós, em última análise identificou 68 novos reguladores da alfa-sinucleína transcrição.
Várias linhas de evidência sugerem que as 68 batidas por nós obtidos são reguladores reais de alfa-sinucleína. Nossa lista de hits identificados inclui GATA3, um membro da família de fatores de transcrição GATA anteriormente apresentados para regular a expressão SNCA 3. Marcando um dos poucos reguladores SNCA conhecidos dá grande confiança na fiabilidade da nossa tela. Além disso, marcou de forma independente como atinge vários membros de uma mesma família de fatores de transcrição neuronais, o que sugere que a tela é reprodutível e não identificação de genesaleatoriamente. Mais importante ainda, em ensaios de acompanhamento adicionais, a capacidade do nosso Top Hits para regular a expressão endógena SNCA em células neuronais foi validado em superexpressão e ensaios knockdown. Nós superexpressos alguns dos maiores sucessos usando BacMamvectors 3 em células dopaminérgicas SY5Y e foram capazes de aumentar os níveis endógenos SNCA 2-8 vezes, enquanto shRNA knockdown dessas visitas resultou em níveis de mRNA SNCA diminuíram. Estes estudos demonstram conclusivamente que os nossos maiores sucessos são reguladores de níveis SNCA endógenos e simplesmente não são artefatos do sistema luciferase desconstruída. Estudos adicionais de acompanhamento para outros sucessos serão necessários para determinar as verdadeiras taxas negativas falsos positivos e falsos para a lista completa de visitas em nossa tela. Uma descrição completa dos hits e sua relação com a doença de Parkinson está em preparação 14.
É importante ter em conta as limitações de nossa metodologia de triagem. Deve ser obvious que a tela não identificam qualquer regulador não apresentar na biblioteca de triagem. Embora a biblioteca de rastreio foi substancial, que contém cerca de um quarto do genoma humano, que não era completa. Dada a simplicidade do nosso ensaio, bibliotecas adicionais podem ser rastreadas com facilidade. Aumentamos o número de genes selecionados de forma orientada, incluindo parálogos de hits, quando disponível, em nossos ensaios secundários. Nós também não marcou qualquer hit que obrigado a regiões genômicas fora daqueles incluídos em nossa construção repórter. Para maximizar a possibilidade de incluir a região apropriada, o nosso repórter continha as seqüências de acompanhamento imediatas para os vários locais de início de transcrição encontrados no promotor SNCA. É provável que os factores adicionais se ligam a regiões afastadas do lado de fora da região do promotor imediato para regular a expressão SNCA. Estes podem ser detectados através da realização de telas com as regiões a montante e a jusante adicionais, se desejado, apesar de apenas ~ 10 kb de uma só vez pode ser umssessed desta maneira devido a limitações de clonagem eficiente em vectores de plasmídeo e a estabilidade das elevado número de cópias pGL4 vectores. Alternativamente, a construção de luciferase poderia ser adaptado para DNAs BAC contendo o locus SNCA. Uma desvantagem para a última abordagem é que a transfecção de BACs, mesmo sob condições ideais é> 100 vezes menos eficiente em seguida os plasmídeos 15. Outra abordagem seria a de "knock-in", o repórter luciferase para o locus SNCA endógena, um método que é muito mais trabalhoso, então nossa abordagem. Também não marcar qualquer acerto que já é expresso em níveis de saturação de modo a que a sobre-expressão não resulta num aumento da actividade da luciferase. Por esta razão, optou-se por empregar células 293T não-neuronais, o que pode não possuem fatores neuronais que regulam SNCA, e na verdade nós marcou uma série de fatores de transcrição neuronais. Uma desvantagem potencial das células 293T, porém, é que talvez não marcou qualquer gene como um sucesso, se é necessária umafatores neuronais dicional para funcionar corretamente. Assim, como todas as telas, o nosso estudo poderia faltar um número de potenciais reguladores SNCA. No entanto, em termos práticos, os acessos 68 obtivemos aumento do número de reguladores conhecidos de SNCA por mais do que 10 vezes e exigirá anos de trabalho para acompanhar, de forma acessos adicionais podem não ser necessários, no nosso caso.
Também é importante compreender os potenciais artefactos que possam ocorrer utilizando esta metodologia. Nas telas químicas, luciferase é notório por compostos artificialmente pontuação pela estabilização da proteína luciferase e não por indução de transcrição. Para descartar artefatos de estabilização de proteínas, nós analisamos os nossos sucessos contra várias outras construções promotor-luciferase e não encontrou qualquer hits que pareciam agir pós-transcricional, elevando a expressão de promotores constitutivos. Outro artefacto potencial poderia ser um factor de transactivação que se liga a espinha dorsal do vector, em vez de pGL4o promotor SNCA. Nós empregamos o vetor pGL4 que tem sido extensivamente mutado para remover fator de transcrição sítios de ligação para evitar esse problema. Para avaliar se qualquer um dos nossos acertos exigido a espinha dorsal do vetor para a indução, foi utilizado PCR para amplificar a região do vetor SNCA-luciferase desprovido de qualquer backbone e usou este fragmento linear como repórter para ensaios secundários. Nós não encontramos nenhuma diferença significativa nos valores de indução entre o nosso repórter plasmídeo completo ea construção linear sem espinha dorsal com uma exceção. GATA2 mostrou indução ~ 15 vezes com o plasmídeo repórter, mas apenas ~ 2,7 vezes com o repórter linear, sugerindo que alguma da indução GATA2 pode ser devido à ligação a componentes da espinha dorsal.
Um número de outros métodos para identificar reguladores da transcrição foram descritos. Quase 30 anos atrás, o mapeamento dos elementos de controle transcricional de ação cis em fortes promotores virais através de expressão do gene repórter transfectadas foi established 16. Este método, às vezes chamado de "promotor bashing," caiu em desuso para o mapeamento de promotores específicos de tipo de célula, uma vez que é difícil de obter e transfecção de linhas celulares primários adequados, e essas linhas podem não representar fielmente seu tecido de origem. O sistema de um híbrido de levedura 17 contorna este problema, fornecendo um sistema repórter desconstruído para detectar interações entre uma biblioteca de genes de fusão e um elemento cis-acting específico. A nossa abordagem é semelhante ao sistema de levedura de um híbrido na sua concepção segmentada, mas no nosso sistema, clones de expressão normais empregar, em vez de fusões de genes, que empregam células de mamífero em vez de levedura e que empregam robótica que permite quantitativa lado-a-lado leituras funcionais para cada gene de teste. Um método promissor denominado proteômica dos segmentos de cromatina isolados (Pich), que permite a identificação de proteínas ligadas a regiões específicas do genoma tem sido descrita 18 anos, mas não tem aindasido aplicado com sucesso genes humanos de cópia única. Genome-wide cromatina imunoprecipitação (CHIP-seq e chip-chip) estudos têm sido usados para identificar regiões de ação cis em larga escala 19. Este método é potencialmente poderosa, mas, como Pich, pode ser menos útil para tipos de células, tais como as populações neuronais específicas que não são facilmente obtidos em cultura homogénea. Além disso, quando temos verificado bancos de dados do chip para nossos sucessos validados, eles não mostraram ligação dessas visitas ao promotor SNCA. A razão para isso não é clara, uma vez que temos sido capazes de demonstrar a ligação desses fatores para o promotor SNCA pelo chip convencional 14; mas pode ser devida à falta da região promotora SNCA todo ser utilizado em estudos de ChIP utilizando leituras de microarranjos (Chip-chip). Pich, o Chip-seq, e outras abordagens proteômicas pode, portanto, ser mais útil quando acoplado às leituras funcionais directas que o nosso método gera.
Dual-luciferaseensaios empregando vaga-lume e luciferases Renilla oferecer um método sensível para estudar inúmeros processos intracelulares em formato de alto rendimento 20. A fusão de um promotor alvo para a luciferase de pirilampo foi utilizada para estudar a regulação e a estrutura do promotor de transcrição de numerosos alvos in vitro, incluindo a alfa-sinucleína 1,2. Nós desenvolvemos uma alternativa barata para comercialmente disponíveis reagentes luciferase dupla que proporcionaram sinal robusto e era linear na gama de nosso ensaio (Figura 6). O nosso método é adaptado a partir de um protocolo generosamente fornecida por Ron Johnson na NIH e um ensaio de luciferase dupla não comercial anteriormente descrito 21. O tampão de ensaio de pirilampo lisa as células e proporciona ATP e luciferina, o substrato da luciferase do pirilampo. Este ensaio dá uma reacção de brilho, com uma meia-vida de aproximadamente 1 hora (Figura 7). O tampão de ensaio de Renilla extingue o firefly sinal e fornece substrato adequado (celenterazina). Note-se que o próprio tampão de ensaio de Renilla não lisar as células e devem ser usadas em combinação com tampão de lise Triton ou tampão de ensaio de pirilampo. Descobrimos que anteriormente descritos tampões de ensaio de Renilla facilmente precipitados à TA, assim, eliminado sulfato de sódio e reduziu a quantidade de pirofosfato de sódio em 60%. O nosso ensaio também inclui PTC124, um potente inibidor da luciferase do pirilampo 22 que contribui têmpera adicional no ensaio. Actividade de têmpera é também fornecida por EDTA, NaCl e pirofosfato no buffer de Renilla. Com estas novas formulações, de aproximadamente 99,5% da actividade do pirilampo é extinta pelo tampão de Renilla. A intensidade e a reprodutibilidade de ambos os sinais de luciferase de pirilampo e Renilla foram ligeiramente melhorado através da mistura após a adição dos tampões (Passos 4.6 e 4.10).
Em nossa experiência, a uma completapromotor lpha-sinucleína em pGL4.10 é singularmente difícil para amplificar e clone, talvez por causa de regiões ricas em GC e estrutura secundária complexa no intron 2. Estávamos mais bem sucedidos com células competentes STBL4, que são otimizados para a clonagem de inserções instáveis. Mesmo seguindo essas precauções, freqüentemente recuperado um mutante em que E. DNA genómico de E. coli foi inserido no extremo 3 'da construção. Este mutante cria bandas de aproximadamente 5,8 kb e 4 kb, quando digerido com BamHI (versus 5,8 kb e 2,8 kb do clone correcto) e aparece como colónias maiores em placas selectivas. Cuidado crescimento de células competentes, a 30 ° C e evitando culturas de alcançar reduções de saturação, mas não eliminar, a possibilidade de recuperar o mutante. Recomendamos verificar a pureza de todas as preparações de DNA por digestão de restrição e electroforese em gel antes da transfecção.
Este protocolo de selecção pode ser facilmente adaptada a outros promotores, umad deve ser optimizado de acordo, usando genes como controlos positivos e negativos já conhecidos para regular o promotor alvo. Várias considerações aplicam-se à clonagem e à transfecção dos plasmídeos repórter. Quando a clonagem do promotor alvo no plasmídeo repórter de luciferase de pirilampo, o local de início da luciferase devem aproximar do local de início da tradução no gene alvo. Telas Dual-luciferase tipicamente colocar o plasmídeo de Renilla sob o controlo de um promotor mínimo, tal como o promotor de HSV-tk, para minimizar os efeitos do esqueleto de plasmídeo. No entanto, descobrimos que um dos nossos controles positivos induzidos este promotor, assim, optamos pelo promotor CMV. A quantidade relativa de cada um dos plasmídeos repórter deverá ser determinado empiricamente e é influenciada pela actividade constitutiva de cada promotor. Linha de base ideal (transfectados, mas não induzido) contagens de luciferase deve ser de pelo menos cinco a dez vezes sobre o fundo a partir de células transfectadas, para permitir a detecção de library genes que reprimem ou que causa toxicidade, o que irá resultar em menor sinal. Antes do exame, verificar que as contagens de luciferase esperados cair dentro da faixa linear de cada ensaio, que pode variar entre luminômetros. (Note-se que o nosso Renilla conta normalmente cair na extremidade superior do intervalo linear no nosso ensaio.) Verificou-se que aumentando a proporção de ADN da biblioteca de pirilampo plasmídeo repórter resultou na indução superiores, assim, utilizada a quantidade mínima de este repórter.
O protocolo de transfecção deve ser optimizado assim. Escolhemos 293T células para a sua relativa facilidade de transfecção, a eficiência do que o aumento de 50 vezes com a adição de um passo de centrifugação (Passo 3.5). O SY5Y linha dopaminérgico é mais de 100 vezes menos transfectable em nossas mãos, e, como discutido acima, pode não ser o ideal para a realização de triagem superexpressão. O nosso tempo de ensaio óptima foi empiricamente determinado como sendo de 48 horas, portanto, as células foram plaqueadas a uma densidade inicial baixa, Necessitando do uso de Optifect, que é concebido para transfectar células de 10-70% de confluência. Outras linhas de células podem necessitar de diferentes densidades de partida e diferentes reagentes de transfecção. Optamos por mudar a mídia celular após transfecção para adicionar antibióticos (o que poderia causar toxicidade se presente durante a transfecção). Embora isso diminui a probabilidade de contaminação bacteriana, que aumenta o custo de materiais (especialmente dicas robô pipeta), assim a necessidade desta etapa deve ser avaliado ao adaptar este protocolo para outros sistemas. Os ensaios de luciferase pode ser utilizado com optimização mínima, mas antes de realizar este ensaio in high-throughput com um tipo diferente de células, verificar que as células são lisadas de forma adequada pelo tampão de lise Triton. Note-se que o Triton X-100 faz com que a coelenterazina autofluorescência. O sinal Renilla em nosso ensaio foi forte o suficiente para banalizar este efeito, mas quando otimizar este ensaio para outros tipos de células, limitar Triton X-100 volumes para a minimal quantidade necessária para a lise celular.
Nós apresentamos um método de rastreio rápido e relativamente barato para a identificação de novos reguladores transcricionais de alfa-sinucleína, utilizando células transfectadas transitoriamente com um sistema de repórter duplo da luciferase. Este protocolo é facilmente modificável para atingir outros genes de interesse e também pode ser adaptado para qualquer aplicação que exija transfections de alto rendimento, como a produção lentivírus 23.
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Disclosures
Este trabalho foi apoiado por royalties obtidos por BacMamreagents licenciamento (Patente dos EUA 5.731.182).
Acknowledgments
Agradecemos a John Darga do MGH DNA do núcleo para a preparação da biblioteca triagem DNA. Christopher Chigas de Perkin Elmer forneceu apoio inestimável para o nosso Wallac 1420 luminometer. Steven Ciacco e Martin Thomae de Agilent forneceu apoio para o robô Bravo. Agradecemos a Ron Johnson e Steve Tito no NIH para generosamente fornecer seu protocolo de ensaio de luciferase dual-brilho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K2100-12 | |
| PureLink PCR Micro Kit | Invitrogen | K310250 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K2100-03 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K2100-07 | |
| Bravo Robot | Agilent | - | |
| Robot Pipet Tips with Filter | Agilent | 19477-022 | |
| Robot Pipet Tips without Filter | Agilent | 19477-002 | |
| Clear-bottomed 96-well Plates | Corning | 3610 | |
| Reservoirs | Axygen | RES-SW96-HP-SI | |
| Polystyrene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651101 | |
| Polypropylene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651201 | |
| Adhesive Plate Covers | CryoStuff | #FS100 | |
| Reagent | |||
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| BAC 2002-D6 | Invitrogen | 2002-D6 | |
| Calf Intestine Alkaline Phosphatase | Roche | 10713023001 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| pGL4.74 | Promega | E6931 | |
| ElectroMAX Stbl4 Competent Cells | Invitrogen | 11635-018 | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| DMEM without Phenol Red | Invitrogen | 31053-028 | |
| Optifect | Invitrogen | 12579017 | |
| Ciprofloxacin | CellGro | 61-277-RF | |
| Tris-Hydrochloride Powder | Sigma | 93287 | |
| Tris-Base Powder | Sigma | 93286 | |
| Triton X-100 Pure Liquid | Fisher | BP151-100 | |
| DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
| C–nzyme A | Nanolight | 309 | |
| ATP | Sigma | A6419 | |
| Luciferin | Invitrogen | L2912 | |
| h-CTZ | Nanolight | 301 | |
| PTC124 | SelleckBiochemicals | S6003 | |
References
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