Summary
यहाँ हम एक Langendorff छिड़काव प्रणाली का उपयोग कर वयस्क माउस cardiomyoctyes के अलगाव का वर्णन. जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं, + सहिष्णु विद्युत मौन सीए 2 हैं और सुसंस्कृत और एडिनो या जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने lentiviruses साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता. उनकी कार्यक्षमता भी MMSYS प्रणाली और पैच दबाना तकनीक का उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है.
Abstract
संस्कृति में प्राथमिक cardiomyocytes (सीएमएस) के उपयोग को दिल की बीमारी के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने में हृदय रोग का murine मॉडल के लिए एक शक्तिशाली पूरक प्रदान की गई है. विशेष रूप से, कोढ़ की स्थिति में है और रोग के कारण परिवर्तन से आयन homeostasis, आयन चैनल समारोह, सेलुलर excitability और उत्तेजना संकुचन युग्मन और उनके परिवर्तन का अध्ययन करने की क्षमता हृदय रोगों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व किया है. इसके अलावा, संस्कृति में वयस्क मुख्यमंत्रियों की नकल करने की पर्याप्त अमर सेल लाइन की कमी है, और नवजात मुख्यमंत्रियों की सीमाओं (वयस्क सीएमएस के संरचनात्मक और कार्यात्मक बायोमैकेनिक्स विशेषता के कई कमी है), संकेत दे रास्ते के बीच जटिल परस्पर क्रिया के बारे में हमारी समझ के आड़े आती है आयन चैनल और वयस्क अलग cardiomyocytes का अध्ययन करने के महत्व को मजबूत बनाने के वयस्क दिल में सिकुड़ा गुण. यहाँ, हम adenoviral-expre द्वारा जीन अभिव्यक्ति का अलगाव, संस्कृति, जोड़ - तोड़ के लिए तरीके पेशssed प्रोटीन, और वयस्क माउस से cardiomyocytes के बाद कार्यात्मक विश्लेषण. इन तकनीकों का उपयोग सेलुलर excitability को विनियमित कि रास्ते, सीए 2 + गतिशीलता और सिकुड़ना संकेत में यंत्रवत अंतर्दृष्टि विकसित करने और हृदय रोग का एक बहुत अधिक physiologically प्रासंगिक लक्षण वर्णन प्रदान करने में मदद मिलेगी.
Introduction
हृदय रोग के murine मॉडल संभावित चिकित्सीय लक्ष्य 1,3 की पहचान करने के लिए मौलिक रोग तंत्र 1,2 elucidating के साथ ही के लिए प्रभावी उपकरण के रूप में सेवा की है. विशेष रूप से, (जैसे कि दबाव अधिभार के रूप में) का अधिग्रहण हृदय रोग के दोनों murine मॉडल 4,5 और ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोग हृदय रोग 6-8 की हमारी समझ को उन्नत किया है. एकल कक्ष के स्तर पर दिल 11-13 में सेलुलर excitability और उत्तेजना संकुचन युग्मन कायम करना है कि व्यक्ति प्रोटीन में cascades संकेत 3,9,10 और परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए सेल कल्चर तकनीक के इस्तेमाल में vivo माउस मॉडल पूरित है. हालांकि, वयस्क मुख्यमंत्री संरचना और समारोह को प्रतिबिंबित कि पर्याप्त सेल लाइनों की कमी एक महत्वपूर्ण सीमा किया गया है. जांचकर्ता heterologous अभिव्यक्ति प्रणालियों में, इस तरह के आयन चैनल के रूप में व्यक्तिगत प्रोटीन का अध्ययन कर इस पर काबू पाने की मांग की है
प्राथमिक नवजात चूहे निलय cardiomyocytes (NRVMs) संस्कृति के लिए अपेक्षाकृत आसान है,, जीन अभिव्यक्ति 15 में हेरफेर करने adenoviruses और lentiviruses से संक्रमित हो सकते हैं कर रहे हैं एकएन डी इसलिए सफलतापूर्वक 1 इस्तेमाल किया, लेकिन उनकी खुद की सीमाएं हैं किया गया है. वे एक शारीरिक microenvironment 1 उपलब्ध कराने और संकेतन क्षेत्र के workhorse कर दिया गया है, आकारिकी और NRVMs और वयस्क cardiomyoctyes के subcellular संगठन के बीच काफी मतभेद हैं उन्हें वयस्क दिल में आयनिक अपशिष्टों और उत्तेजना संकुचन युग्मन की जांच के लिए एक अपर्याप्त मॉडल बनाने . सबसे विशेष रूप से NRVMs एक निश्चित टी ट्यूबलर उपतंत्र 4 की कमी है. सीए 2 + प्रवाह और गतिशीलता परिपक्व टी ट्यूबलर और sarcoplasmic जालिका (एसआर) संरचना 6, सीए 2 + गतिशीलता और NRVMs में हृदय सिकुड़ना के कार्यात्मक अध्ययन पर निर्भर हैं चूंकि वयस्क cardiomyocytes में इन महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं के एक सटीक प्रतिबिंब नहीं हैं. इसके अलावा, संकेत दे रास्ते के कुछ घटकों, जिससे एक और रोग प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए सीमा और उनके मैं प्रदान करने, नवजात और वयस्क चूहों 9 के बीच अलगNRVMs में सेलुलर excitability और सिकुड़ना पर mpact. अंत में, सिकुड़ा मशीनरी का वितरण सिकुड़ा माप की सटीकता सीमित multidirectional और गैर वर्दी सेल छोटा करने के लिए जाता है.
पृथक वयस्क cardiomyocytes के उपयोग इसलिए एक अधिक सटीक में इन विट्रो मॉडलिंग सिस्टम प्रदान करता है. चूहों के आनुवंशिक हेरफेर से संभव बनाया ज्ञान की असाधारण वृद्धि चूहों से कार्यात्मक अलग cardiomyocytes प्राप्त करने के महत्व को रेखांकित करता है. वास्तव में, माउस मॉडल से अलग वयस्क सीएमएस के लक्षण वर्णन कई जैविक और रोग की घटनाओं पर प्रकाश डाला गया है. ट्रांसजेनिक माउस मॉडल से अलग मुख्यमंत्रियों जिससे में से प्राप्त जानकारी के पूरक, ऐसे ischemia / reperfusion 17,18 के रूप में रोग मॉडल में लाभ या प्रोटीन के समारोह के नुकसान के एकल कक्षों 2,16 से सिकुड़ा गुणों पर, और व्यवहार्यता के अध्ययन के लिए अनुमति दी है पर vivo अध्ययनएसई चूहों. या (शारीरिक अतिवृद्धि मॉडलिंग के लिए) व्यायाम 5,21 परीक्षा के लिए अनुमति देता है (mimics उच्च रक्तचाप या महाधमनी वाल्व स्टेनोसिस कि इस तरह के अनुप्रस्थ महाधमनी कसना प्रेरित दबाव अधिभार के रूप में) का अधिग्रहण हृदय रोग 3,19,20 की murine मॉडल से अलग वयस्क सीएमएस का प्रयोग करें एकल कक्ष के स्तर पर सेलुलर excitability और उत्तेजना संकुचन युग्मन के साथ इन प्रक्रियाओं में फंसा cascades संकेत की बातचीत की. इसके अलावा, वयस्क मुख्यमंत्रियों में adenoviral संचालित जीन अभिव्यक्ति का उपयोग जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने की क्षमता हमें जटिल संकेत दे रास्ते के घटकों को काटना अवसर देता है.
एक electrophysiological दृष्टिकोण से, पूरे सेल वोल्टेज और पृथक वयस्क मुख्यमंत्रियों पर वर्तमान दबाना प्रयोगों आधारभूत पर आयनिक अपशिष्टों की प्रकृति elucidating में और विभिन्न रोग राज्यों में आलोचना की गई है. क्योंकि सेलुलर झिल्ली की जटिल संरचना और अंतर prote कीवयस्क सीएमएस और NRVMs या heterologous सेल लाइनों के बीच मचान संरचनाओं में, वयस्क कोशिकाओं पैच करने की क्षमता निश्चित झिल्ली प्रोटीन, संरचनात्मक प्रोटीन, और वयस्क दिल की electrophysiological घटकों पर आयन चैनल से बातचीत भागीदारों के प्रभाव का एक बेहतर प्रतिनिधित्व देता है.
, वयस्क murine cardiomyocytes का अध्ययन अलग और वयस्क चूहों cardiomyocytes चुनौती रहा है संवर्धन, व्यवहार्य माउस cardiomyocytes अलग करने के लिए और वायरल का उपयोग आगे आनुवंशिक हेरफेर की अनुमति के लिए संस्कृति में उन्हें बनाए रखने के लिए कार्यप्रणाली का एक व्यवस्थित और सटीक विवरण के लिए जरूरत के आग्रह में ऐसे प्रमुख फायदे के बावजूद वैक्टर. पिछले अध्ययनों तीव्रता से पृथक माउस वयस्क सीएमएस या सुसंस्कृत चूहे वयस्क मुख्यमंत्रियों या तो इस्तेमाल किया है. उत्तरार्द्ध वयस्क माउस सेमी की तुलना में संस्कृति के लिए आसान कर रहे हैं, और इन विट्रो में जीन की अभिव्यक्ति से छेड़छाड़ सबसे प्रयोगों चूहे वयस्क मुख्यमंत्रियों का इस्तेमाल किया है. कुछ अध्ययनों सफलतापूर्वक बदल दिया और कामकाज की जांच की हैप्रयोगों के क्षेत्र में एक बड़ी सीमा पेश माउस वयस्क मुख्यमंत्रियों में onal जीन अभिव्यक्ति,. इसलिए, यहाँ हम विस्तार से अलगाव 7,8,22, संस्कृति 3,10,15,23, adenoviral संक्रमण 11-13,15, और वयस्क माउस निलय cardiomyoctyes के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए पिछले जांच से संशोधित इस तरह के तरीके,, प्रस्तुत करते हैं. इस अलगाव प्रोटोकॉल हम अप करने के लिए 72 घंटे के लिए सफलतापूर्वक सुसंस्कृत और क्षणिक adenovirus साथ ट्रांसफ़ेक्ट है कि सीए 2 + सहिष्णु, उत्तेजनीय cardiomyocytes में परिणाम है. इन अलग कक्षों की कार्यक्षमता MMSYS इमेजिंग प्रणाली 14,24 और भी चर्चा की जाएगी जो पैच दबाना, का उपयोग मूल्यांकन किया जा सकता है.
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Protocol
1. Cardiomyocyte अलगाव
माल (चित्रा 1)
संदंश microdissecting
ऊतक संदंश
नाजुक रक्तवाहिका संदंश
रक्तवाहिका संदंश
Microdissecting, दाँतेदार, घुमावदार संदंश
आपरेटिंग कैंची, सीधे
आपरेटिंग कैंची, घुमावदार
15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब (5)
60 मिमी पेट्री डिश
फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस)
नायलॉन जाल - 400 माइक्रोन ताकना आकार
लघु कीप
वैक्स लेपित, लट रेशम 4-0, 19 मिमी, लंबे 7-10 सेमी
गैर चमड़े के नीचे सुई, कुंद अंत, 24 जी या वाणिज्यिक पशु खिला सुई (W/1-1/4, में 24 एक्स 1)
हेपरिन सोडियम
Ketamine / xylazine मिश्रण
पाश्चर pipettes
OptiVision विदारक चश्में
IonOptix MMSYS प्रणाली
नोट: संवर्धन कोशिकाओं हैं, इस प्रोटोकॉल की शुरुआत से पहले सेल संस्कृति पर खंड 2 देखें.
नोट: सभी चूहों में के लिए देखभाल कर रहे थेअनुमोदित IACUC नियमों, प्रथाओं, और प्रक्रियाओं के अनुसार एक बाधा सुविधा और बलिदान किया.
नोट: पिछले प्रक्रिया शुरू करने के लिए, पूरे सिस्टम Langendorff प्रणाली (चित्रा 2A, चित्रा 3) के सभी तत्वों को उचित और पूरी collagenase गतिविधि के लिए अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है यह सुनिश्चित करने के लिए छोड़ देते जाना चाहिए.
- 150 खासियत इकाइयों पेट अंतरिक्ष में सोडियम हेपरिन के साथ वयस्क चूहों (~ 12 सप्ताह) इंजेक्षन.
- एक वजन पर निर्भर खुराक (1 टेबल) पर एक ketamine / xylazine मिश्रण का एक इंजेक्शन के साथ anesthetize.
- 80:12 मिलीग्राम / किग्रा ketamine: xylazine नुस्खा: 2.6 मिलीलीटर ketamine (100 मिलीग्राम / मिलीलीटर) + 0.4 मिलीलीटर xylazine (100 मिलीग्राम / मिलीलीटर) + 37 मिलीलीटर पीबीएस. अंतिम: ketamine = 6.5 मिलीग्राम / एमएल, xylazine = 1 मिलीग्राम / मिलीलीटर
- , परिचालन पैड को बेहोश माउस सुरक्षित दिल आबकारी, और एक कमरे के तापमान पीबीएस के पकवान या 0.9% खारा (चित्रा 1J) में जगह है. बनावटsiologic खारा बरकरार दिल कक्ष में रक्त का बेहतर बाहर निकालना और 1.6 कदम की पूर्व महाधमनी की आसान पहचान के लिए अनुबंध करने के लिए अनुमति देता है. चूहे वे गहराई से पिछले अंग पैर के अंगूठे चुटकी पलटा और पूर्व thoracotomy की शुरुआत करने के लिए सांस की दर के धीमा के नुकसान के माध्यम से anesthetized हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए जांच की गई.
- महाधमनी की पहचान और पर्दाफाश करने के लिए OptiVision विदारक चश्मे (चित्रा 1 ए) का प्रयोग करें. महाधमनी जड़ स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है, तो यह पोत के दृश्य की सुविधा है, हालांकि, महाधमनी के आसपास के ऊतकों को हटाने सेल अलगाव के अनुकूलन के लिए आवश्यक नहीं है.
- प्रधानमंत्री छिड़काव बफर के साथ पंप (2 तालिका). तापमान का उपयोग कर प्रक्रिया की लंबाई के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किया जाना चाहिए एक पानी स्नान (चित्रा 2 डी) परिसंचारी, नियंत्रित.
- Langendorff उपकरण (2A चित्रा) पर दिल माउंट. दो सूक्ष्म विदारक संदंश (आंकड़े 1 डी ई) का उपयोग करना, जनसंपर्कबाहर का टिप पर सिलिकॉन ट्यूब के साथ गैर चमड़े के नीचे, कुंद अंत सुई (24 जी) के आसपास महाधमनी IME. वैकल्पिक रूप से (W/1-1/4, में 24 एक्स 1) एक वाणिज्यिक पशु खिला सुई का इस्तेमाल किया जा सकता है. 24 जी सुई या पशु खिला सुई पर सिलिकॉन ट्यूब नाली के ऊपर सिवनी हासिल करने के लिए अनुमति देगा. एक जुर्राब के रूप में सुई पर महाधमनी रखें. (चित्रा -2).
- नोट: यह इस गंभीर रूप से करेंगे, क्योंकि यह बाएं वेंट्रिकल में महाधमनी वाल्व के माध्यम से विस्तार नहीं करता है कि सुई के अंत आदर्श सही अनामी को महाधमनी जड़ बाहर का में, आरोही महाधमनी में टिकी हुई है कि यकीन होना जरूरी है, लेकिन प्रभावी रूप से कोरोनरी धमनियों के माध्यम से दिल के माध्यम से छिड़कना को बफ़र्स की क्षमता की सीमा.
- टाई सही अनामी arter नीचे, आरोही महाधमनी के स्तर पर सुनिश्चित करना है कि महाधमनी के ऊपर चारों ओर (7-10 सेमी लंबे) suturing रेशम की एक छोटी लंबाई (चित्रा 1K) बांधने से सुई को दिल सुरक्षितवाई, लेकिन सुई के अंत से ऊपर है.
- एक उपयुक्त परिवेश के तापमान को बनाए रखने में मदद करने के लिए शंक्वाकार कांच के इंटीरियर (चित्रा 2 बी) में हृदय को कम करें.
- 1 मिलीग्राम / मिनट की दर से 5 मिनट के लिए छिड़काव बफर के साथ दिल छिड़कना और perfusate शंक्वाकार गिलास में जमा है और दिल लिफाफा करने की अनुमति के लिए कांच के कक्ष बहिर्वाह दबाना. दिल को पचाने के लिए योजनाबद्ध 3 चित्र में दिखाया गया है.
- इस बिंदु पर आप दिल वृद्धि की मात्रा को देखना चाहिए. साथ ही, हृदय के ऊतकों में रक्त ऊतक पीलापन, जिससे perfusate द्वारा प्रतिस्थापित किया जाएगा.
- Perfusate निकास के लिए बहिर्वाह बंद करना छोड़ें. एंजाइम बफर कंटेनर (चित्रा 2 ई) के लिए छिड़काव बफर कंटेनर से ट्यूबिंग स्थानांतरित करने के लिए पंप बंद करो. / मिनट 1 मिलीलीटर में एंजाइम बफर (तालिका 2) के साथ दिल छिड़कना शुरू करने के लिए पंप फिर से शुरू करें. एंजाइम बफर लिफाफा करने की अनुमति के लिए फिर से बहिर्वाह दबानादिल.
- इधर, एंजाइम दिल perfusing और संयोजी ऊतक पचा जाता है, दिल पीला हो जाएगा और संरचनात्मक अखंडता कम होगा.
- पच दिल से निलय में कटौती शंक्वाकार गिलास से बाहर दिल उठा, धीरे संदंश के साथ दिल निचोड़ और एक छोटा सा पेट्री डिश में perfusate की कुछ बूंदों को इकट्ठा करने और एकल कक्षों गिर रहे हैं या नहीं, यह देखने के लिए जाँच करने के लिए जब निर्धारित करने के लिए .
- नौसिखिया के लिए यह एक दबाव नापने का यंत्र के साथ छिड़काव लाइन कनेक्ट करने के लिए उपयोगी है. दिल पच रही है जब संयोजी ऊतक प्रतिरोध पकड़ नहीं करता है के रूप में दबाव तेजी से गिरावट आई है. दबाव नापने का यंत्र सुई की स्थिति महाधमनी वाल्व से ऊपर नहीं है और निलय में है कि यह सुनिश्चित करने के लिए भी नौसिखिया के लिए उपयोगी है. कम दबाव सुई निलय कक्ष में है और उच्च दबाव सुई वाल्व को छूता है कि संकेत दिया है कि संकेत जाएगा.
- एक डिश में दिल से निलय कटनिलय दबाव आप perfusate में एकल कक्षों को देखने में सक्षम हैं जब नाटकीय कमी या शुरू होता है जब हस्तांतरण बफर (ए) (2 तालिका) से भरा है. यह आमतौर पर ~ 7-10 मिनट लगते हैं.
- फिर से (चित्रा 1C) सूक्ष्म विदारक संदंश का उपयोग, अलग कर देना करने के लिए छोटे टुकड़ों में निलय कीमा. एक सफल पाचन ऊतक के सबसे हदबंदी पर अनाकार बनने के साथ, क़ीमा के बाद ऊतक की लगभग कोई ठोस हिस्सा छोड़ देंगे.
- इसके अलावा, ऊतक अलग कर देना टिप एक ~ 45 डिग्री के कोण पर कटौती की गई थी जिसमें से एक प्लास्टिक पाश्चर विंदुक (चित्रा 4) का उपयोग / बाहर समाधान विंदुक के लिए. इस संशोधन के ऊतकों triturated है के रूप में पिपेट टिप इस प्रकार की कोशिकाओं पर कतरनी तनाव की मात्रा कम की भीतरी पूरा पूरा अंतरिक्ष बढ़ाने के लिए कार्य करता है.
- संदंश के साथ ऊतक विदारक इससे पहले यह व्यक्ति कक्षों अलग और अलग आलिंद, बाएं निलय या righ अलग कर देना करने के लिए संभव हैटी निलय कोशिकाओं.
- Clamps का उपयोग कर एक छोटा सा कीप (चित्रा 1L) को चुकता मेष (चित्रा 1M) सुरक्षित और एक 15ml फाल्कन ट्यूब (चित्रा 1 मैं) में इस फ़िल्टरिंग तंत्र जगह है.
- पकवान से सेल समाधान निकालने और फाल्कन ट्यूब में समाधान फ़िल्टर को संशोधित पाश्चर पिपेट का उपयोग करें.
- (लाइव सेल अवसादन 2-4 मिनट लग चाहिए) जीवित कोशिकाओं ट्यूब के नीचे के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें.
- 4 अलग 15ml फाल्कन ट्यूबों में चार कैल्शियम समाधान (तालिका 3) के प्रत्येक विभाज्य 2.5ml.
- फिर एक मानक पाश्चर पिपेट का प्रयोग, ध्यान ट्यूब के नीचे से सेल गोली निकालें और कैल्शियम समाधान की पहली कोशिकाओं हस्तांतरण.
- कोशिकाओं अंतिम समाधान में हैं जब तक कोशिकाओं ट्यूब के नीचे बसा है और बाद में कैल्शियम समाधान में कदम 1.17 दोहराने की अनुमति दें.
- कोशिकाओं fourt में बसने मत देनाज कैल्शियम समाधान. ट्यूब टोपी और अपने पक्ष में बदल जाते हैं.
2. सेल संस्कृति
- अलगाव, प्लेट 1 स्नातकीय / एमएल प्राकृतिक माउस कांच coverslips पर laminin और 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे के लिए सेते हैं और 2% सीओ 2 से पहले. इसके अलावा अपने चढ़ाना और संस्कृति मीडिया (तालिका 4) 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में गर्म और 2% सीओ 2 के लिए अनुमति देते हैं. यह मीडिया में भंग सीओ 2 संतुलित करने के लिए अनुमति देता है.
- मीडिया से ऊपर न निकालें. बस संक्रमण से बचने के शीर्ष ढीला.
- अलग कक्षों फाल्कन ट्यूब के नीचे गोली करने की अनुमति दें.
- मीडिया चढ़ाना की उचित मात्रा में एक मानक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट और resuspend का उपयोग कर गोली निकालें.
- उचित आकार पकवान में laminin लेपित coverslips पर कोशिकाओं की थाली और 37 डिग्री सेल्सियस में सेते हैं और 2% कम से कम 30-60 मिनट के लिए सीओ 2 कोशिकाओं coverslips का पालन करने की अनुमति देने के लिए.
- ** Adenovirus साथ transfecting हैं, चढ़ाना मीडिया का एक उचित मात्रा में वायरस पतला और वायरस युक्त मीडिया के साथ डिश में चढ़ाना मीडिया की जगह. वायरस 37 डिग्री सेल्सियस में 2 घंटे और 2% सीओ 2 के लिए कोशिकाओं पर सेते करते हैं. **
- पकवान से चढ़ाना मीडिया निकालें और संस्कृति मीडिया के साथ की जगह.
- Coverslips पर कोशिकाओं को परेशान करने के लिए नहीं के रूप में तो ध्यान से हर दिन संस्कृति मीडिया बदल जाते हैं.
इस प्रक्रिया का उपयोग, कोशिकाओं को सफलतापूर्वक अप करने के लिए 72 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया है. ट्रांसफ़ेक्ट सुसंस्कृत और GFP कोशिकाओं की छवियों चित्रा 5 में पाया जा सकता है.
3. MMSYS सिस्टम
- आर्क दीपक पहले शुरू की है यह सुनिश्चित करना कि MMSYS प्रणाली शक्ति.
- पंप से MMSYS चैंबर के उचित इनलेट और आउटलेट (चित्रा 6) के लिए ट्यूब कनेक्ट करें.
- प्रधानमंत्री कैल्शियम बफर (बी) के साथ प्रणाली (तालिका 2).
- एक appr रखेंचैम्बर और बाँध (चित्रा 6E) में opriately आकार के कांच coverslip. अधिकांश MMSYS कक्षों 22 मिमी या 25 मिमी वर्ग coverslips या तो उपयोग करें. अपने कक्ष के लिए उपयुक्त coverslip निर्धारित करने के लिए अपने MMSYS उपयोगकर्ता मैन्युअल देखें.
- एक छोटे Eppendorf ट्यूब सेल समाधान के 500 μl स्थानांतरण.
- कोशिकाओं के छोटे ट्यूब 0.5 μl Fura2-AM (1 ग्राम / μl के शेयर समाधान) जोड़ने और उन्हें 5-7 मिनट के लिए आरटी पर अंधेरे में सेते दें. इस Fura2-AM कोशिका झिल्ली के माध्यम से तेजी से निष्क्रिय प्रसार के माध्यम से कोशिकाओं में "लोड" करने के लिए अनुमति देता है.
- Fura-2 लोड कोशिकाओं ट्यूब के नीचे गोली करते हैं, और कैल्शियम बफर बी के 500 μl के साथ अतिरिक्त Fura धोने
- कमरे लाइट बंद.
- एक मानक पाश्चर विंदुक का प्रयोग, चैम्बर (चित्रा 6C) के केंद्र में "लोड" सेल के समाधान के (सेल एकाग्रता के आधार पर) 1-2 बूँदें ड्रॉप और कोशिकाओं टी की अनुमतिओ 5 मिनट के लिए coverslip पर बसा.
- चैम्बर में कोशिकाओं के घनत्व एक गैर अतिव्यापी कोशिकाओं को आसानी MMSYS डाटा अधिग्रहण मंच में देखा जा सकता है कि ऐसा होना चाहिए.
- ध्यान कक्ष के माध्यम से कैल्शियम बफर (बी) के प्रवाह शुरू.
- 37 डिग्री सेल्सियस के चैम्बर के तापमान में वृद्धि
- महत्वपूर्ण: प्रवाह शुरू किया गया है जब तक हीटिंग तंत्र चालू न करें. यह गंभीर प्रतिक्रिया thermocoupler (चित्रा 6A) को नुकसान पहुंचा सकते हैं.
- कनेक्शन तार (चित्रा 6B) के माध्यम से चैम्बर MyoPacer से जुड़ा है कि सुनिश्चित करें और 1.5x कोशिकाओं के लिए पेसिंग दहलीज पर कोशिकाओं 5 हर्ट्ज गति शुरू करते हैं.
- सही आवृत्ति पर धड़क रहा है कि एक सेल चुनें और तैयार एपर्चर में चलते हैं.
- पूरे सेल क्षैतिज निर्देशित, खिड़की के केंद्र में है कि इतना sarcomeres एपी के साथ, कैमरा और तैयार एपर्चर आयामों को समायोजितमाता - पिता.
- सेल लंबाई के लिए सेल के किनारे करने के लिए (बाएं सही और) photodiode संकेतक लाल और हरे रंग समायोजित करें. सेल के किनारों पर सफेद / काला विपरीत अनुकूलन के विपरीत समायोजित करें. अधिक जानकारी के लिए Ionoptix संदर्भ लें.
- अच्छी तरह से परिभाषित sarcomeres युक्त सेल के एक क्षेत्र में बॉक्स प्लेस और बिजली स्पेक्ट्रम (लाल) के शिखर अनुकूलन करने के लिए ध्यान समायोजित. इसके अलावा नीले समरेखण खिड़की और काले विपरीत जानकारी अनुकूलन करने के लिए माइक्रोस्कोप की चमक को समायोजित.
- लाल बिजली स्पेक्ट्रम (चोटी) और जितना संभव हो कम पृष्ठभूमि के रूप में ज्यादा कब्जा करने के लिए हरी सीमा सलाखों समायोजित करें.
- रिकॉर्डिंग शुरू.
- पर्याप्त डेटा दर्ज किया गया है, के बाद अस्थायी रूप से रिकॉर्डिंग को रोकने के लिए "रोकें" क्लिक करें और, देखने खिड़की का ध्यान केंद्रित है और न ही आयाम न तो बदल रहे हैं कि सुनिश्चित करना, कोई कोशिकाओं या सेलुलर सामग्री हो सकती है, जिसमें coverslip के एक क्षेत्र को माइक्रोस्कोप के चरण के लिए कदम देखा. लेनरिकॉर्डिंग के GTH अन्वेषक की प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है.
- नोट: "बंद करो" पर क्लिक इस रिकॉर्डिंग को समाप्त कर देगा और कोई पृष्ठभूमि कि सेल के लिए रिकॉर्ड किया जा करने में सक्षम हो जाएगा.
- एक पृष्ठभूमि माप रिकॉर्ड करने के लिए "फिर से शुरू" पर क्लिक करें.
- पर्याप्त पृष्ठभूमि रिकॉर्डिंग समाप्त करने के लिए "बंद करो" पर क्लिक करें दर्ज करने के बाद.
- एक भी. ZPT फ़ाइल में है कि सेल के सभी निशान को बचाने के लिए "फाइल >> सहेजें" क्लिक करें.
- पर्याप्त कोशिकाओं दर्ज किया गया है जब तक 3.20 - दोहराएँ 3.12 दोहराएँ.
- दर्ज आंकड़ों के विश्लेषण पर निर्देश के लिए IonOptix-MMSYS उपयोगकर्ता मैनुअल 12 से परामर्श करें. जंगली प्रकार cardiomyocytes की विशेषता दर्ज आंकड़ों चित्रा 7 में दिखाया गया.
4. पैच दबाना
विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का पैच clamping अच्छी तरह से इस पत्रिका 25-28 में पहले से वर्णित किया गया है. इसलिए हम कुछ आलोचक पर ध्यान केंद्रितवयस्क cardiomyocytes की सफल पैच clamping के लिए अल मापदंडों हमारे प्रोटोकॉल में वर्णित का उपयोग कर अलग.
- एक विंदुक खींचने और borosilicate ग्लास (रेशा के साथ: आयुध डिपो 1.5 मिमी, आईडी 0.86 मिमी - 10 सेमी लंबाई) का प्रयोग पिपेट समाधान (5 तालिका) से भरा जब ~ 2.0-3.0 MΩ दर्शाती है कि एक विंदुक खींच.
- आग से पोलिश धीरे एक Narishige या अन्य ऊर्ध्वाधर आग पालिशगर का उपयोग पिपेट टिप. पैच विंदुक के प्रतिरोध आग चमकाने के बाद 2-4 एमओ होना चाहिए.
- कंप्यूटर, एम्पलीफायर (Axopatch 200B), ई. कनवर्टर (Digidata 1440A, एक्सॉन उपकरण) और micromanipulator (MP-285) पर मुड़ें. पूरे सेल पैच clamping के लिए, हम पहले से वर्णित के रूप में मानक मापदंडों के साथ शुरू करते हैं.
- सुसंस्कृत वयस्क सीएमएस के लिए, इनक्यूबेटर से उन्हें हटाने और धीरे मुख्यमंत्रियों कमरे के तापमान पर पीबीएस के साथ चढ़ाया जाता है, जिस पर coverslip धो लो.
- धीरे coverslip हटाने और उलटा माइक्रोस्कोप (Nikon ते 2 पर छिड़काव चैम्बर में जगह000).
- (सक्शन के लिए) छिड़काव प्रणाली और दुकान के लिए इनलेट सिर्फ coverslip की सतह से ऊपर हैं सुनिश्चित करें.
- उचित अतिरिक्त सेलुलर समाधान (5 तालिका) के साथ perfusing शुरू करो.
- हौसले से अलग वयस्क सीएमएस के लिए, के रूप में ऊपर छिड़काव प्रणाली में एक कोलेजन लेपित coverslip जगह.
- कोशिकाओं समाधान में हो जाएगा, धीरे कोशिकी बफर के साथ समाधान की जगह.
- संशोधित पाश्चर पिपेट (चित्रा 4) का उपयोग करना, धीरे, कोशिकी बफर में कोशिकाओं resuspend एक विभाज्य ले और coverslip पर जगह है.
- कोशिकाओं 4.4 में के रूप में छिड़काव शुरू करने से पहले 10-15 मिनट के लिए देते हैं.
- बैक भरने एक MICROFIL (विश्व परिशुद्धता उपकरण, 28 जी) सुई का उपयोग अंतर सेलुलर बफर के साथ पूरे सेल पैच विंदुक. कोई हवाई बुलबुले पिपेट की नोक में कर रहे हैं कि सुनिश्चित करना; धीरे हवा के बुलबुले surfa फ्लोट करने के लिए अनुमति देने के लिए नलसमाधान के CE.
- Microelectrode और आंतरिक समाधान के बीच संपर्क है कि यह सुनिश्चित करने, पिपेट धारक को भरा पैच विंदुक देते हैं.
- हम चांदी क्लोराइड इलेक्ट्रोड का उपयोग करें, लेकिन घरेलू ब्लीच में रात भर डुबो कर चांदी के तारों को कम से कम सप्ताह में एक बार 'chloriding' का ख्याल रखना.
- धीरे स्नान इलेक्ट्रोड स्नान / अतिरिक्त सेलुलर समाधान में हर समय डूब जाता है यह सुनिश्चित करना कि स्नान में पिपेट कम है. इस समय कोई भी तरल जंक्शन क्षमता ऑफसेट. बड़े जंक्शन क्षमता इलेक्ट्रोड पर चांदी क्लोराइड बिगड़ती का संकेत हो सकता है.
- स्वस्थ बेलनाकार वयस्क मुख्यमंत्रियों माइक्रोस्कोप में पहचान की है और दर्शन के क्षेत्र में केंद्रित कर रहे हैं. पहले से वर्णित है, micromanipulator चलती है और ध्यान केंद्रित समायोजन का एक संयोजन करीब पैच पिपेट की निकटता और मुख्यमंत्री की सतह के लिए अनुमति देता है.
- वे एक ही फोकल विमान में होते हैं, हम दृश्य का एक संयोजन का उपयोगसेल और (Axopatch 200B में उपलब्ध) परीक्षण नाड़ी की ization.
- पिपेट का प्रतिरोध (पिपेट सेल की सतह के साथ संपर्क में है, सुझाव है कि), और सेल बेलनाकार देखने के लिए जारी छमाही में कम हो जाती है एक बार, हम कोमल चूषण का उपयोग gigaohm सील की स्थापना.
- सीएमएस के लिए, हम नकारात्मक दबाव की स्थापना के लिए मुंह चूषण पसंद करते हैं. एक gigaseal सफलतापूर्वक प्राप्त किया जाता है, तो हम फिर से पूरे सेल पैच मोड स्थापित करने के लिए सेल को 'तोड़ में' कोमल लयबद्ध मुंह चूषण का उपयोग करें.
- स्वस्थ मुख्यमंत्रियों की विशिष्ट विश्राम क्षमता -85 -90 के लिए एम वी के क्रम में हैं. एक gigaseal प्राप्त हो जाने के बाद, मैं = 0 पा के साथ वर्तमान दबाना का उपयोग कर आराम झिल्ली संभावित उपाय.
- आराम झिल्ली संभावित depolarized है, तो यह एक क्षतिग्रस्त कोशिका या एक गरीब मुहर संकेत कर सकते हैं.
- सीएम सतह क्षेत्र के साथ एक बहुत बड़े कोशिकाओं रहे हैं क्योंकि, सावधान ध्यान विशेष रूप से, w मुआवजा समाई को भुगतान किया जाना चाहिएजैसे सोडियम चैनल के रूप में मुर्गी तेजी से सक्रिय करने की धाराओं का अध्ययन करने की आवश्यकता है. पर्याप्त समाई मुआवजा प्राप्त का उपयोग नहीं किया जा सकता है, तो पल्स जनरेटर पर मुआवजा सेटिंग में बनाया, उप दहलीज वोल्टेज में prepulses और विपरीत polarity आवेदन किया है और दर्ज संकेत से घटाया परिणामी वर्तमान होना पड़ सकता है. इस तरह के एक प्रोटोकॉल आसानी Axopatch में क्रमादेशित है.
- पूरे सेल पैच मोड स्थापित किया गया है, संतुलन के लिए अनुमति देने के लिए 15 मिनट इंतजार और पूर्व शुरुआत वोल्टेज या वर्तमान दबाना प्रोटोकॉल को सील की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए. हम इस में पहले से वर्णित किया गया है कि मानक प्रोटोकॉल और अन्य पत्रिकाओं का उपयोग करें और पर सविस्तार नहीं किया जाएगा.
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Representative Results
छड़ी के आकार का, धारीदार, और (अनायास पिटाई नहीं) मौन कोशिकाओं (चित्रा 5A) में वयस्क cardiomyoctyes परिणामों का अलगाव. मृत कोशिकाओं गोल दिखेगा और कोई स्त्रिअतिओन्स उपस्थित रहेंगे. मौन कोशिकाओं सुसंस्कृत और जीन अभिव्यक्ति (आंकड़े 5 ब और 5C) में हेरफेर करने adenovirus साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता. संस्कृति के 24 घंटा, जीवित कोशिकाओं की आकारिकी परिवर्तन नहीं करता है के बाद, वे अभी भी सीए 2 + सहिष्णु हैं, और वे क्षेत्र उत्तेजना से पुस्तक की जा सकती है. प्रस्तावित प्रक्रिया के साथ, 80-90% व्यवहार्य कोशिकाओं की एक उपज प्राप्त किया जा सकता है.
सेल का सिकुड़ना मापने के लिए, MMSYS सिस्टम सॉफ्टवेयर sarcomere या सेल लंबाई में या तो परिवर्तन की रिपोर्ट को माइक्रोस्कोप से चरण जानकारी लेता है. एक जंगली प्रकार C57BL6 माउस के sarcomere लंबाई माप के माध्यम से एक प्रतिनिधि सिकुड़ना ट्रेस (चित्रा 7A) में दिखाया गया है. से स्वस्थ वयस्क माउस myocytes के लिएएसई चूहों, आधारभूत sarcomere लंबाई ~ 1.7-1.9 मीटर है. MMSYS सिस्टम सॉफ्टवेयर एक साथ कैल्शियम सक्रिय डाई Fura2-AM की अपार रूपों के लिए बाध्य के अनुपात को मापने के द्वारा सिकुड़ना और कैल्शियम से निपटने को मापने में सक्षम है. अनुपात उपायों setups के बीच थोड़ा भिन्न हो सकता है, स्वस्थ कोशिकाओं के लिए, अनुपात आम तौर पर 1.5-2.5 (चित्रा 7B) के बीच है. MMSYS प्रणाली कैल्शियम के लिए calibrated किया गया है, तो इस अनुपात तो intracellular कैल्शियम एकाग्रता का एक निरपेक्ष माप में अनुवाद किया जा सकता है. सिकुड़ना और कैल्शियम निशान से उत्पन्न कर रहे हैं कि डेटा का विश्लेषण करने के लिए, निशान कि सेल के लिए एक विशेषता का पता लगाने (आंकड़े 7C और 7 दिन) बनाने के लिए औसतन किया जाना चाहिए. उन विशेषता निशान तो फिर सिस्टोलिक और डायस्टोलिक समारोह के लिए पैरामीटर उत्पन्न करता है जो MMSYS सिस्टम सॉफ्टवेयर से एक monotransient डेटा विश्लेषण एल्गोरिथ्म के अधीन हैं. आगे की जानकारी आयन में मौजूद हैंOptix पुस्तिका.
वयस्क माउस cardiomyocytes भी कार्रवाई संभावित वर्तमान दबाना मोड में दर्ज की गई थी, जिसमें पूरे सेल पैच दबाना प्रयोगों (चित्रा 8) के अधीन थे.
| शरीर के वजन (छ) | Ketamine / xylazine (एमएल) |
| 15 | 0.18 |
| 20 | 0.25 |
| 25 | 0.31 |
| 30 | 0.37 |
| 35 | 0.43 |
| 40 | 0.49 |
| 45 | 0.55 |
| 50 | 0.62 |
तालिका 1. वयस्क माउस वजन पर निर्भर Ketamine / xylazine खुराक (80:12).
| समाधान | नुस्खा |
| Tyrode बफर * (पीएच 7.4) | 1 एल DDH 2 हे 137 मिमी NaCl 4 मिमी KCl 1 मिमी MgCl 10 मिमी HEPES 0.33 मिमी नाह 2 पीओ 4 |
| छिड़काव बफर * (पीएच 7.4) | 500 मिलीलीटर Tyrode बफर 10 मिमी डी (+) ग्लुकोज, न्यूनतम 5 मिमी Taurine 10 मिमी Butanedione Monoxime (BDM) |
| एनजाइम बफर * | 50 मिलीलीटर छिड़काव बफर 0.024 ग्राम Collagenase डी (प्रकार चतुर्थ) 0.018 ग्राम Collagenase बी (प्रकार द्वितीय) Streptomyces griseus से 0.003 ग्राम Protease XIV |
| बफर हस्तांतरण (एक) | 45 मिलीलीटर छिड़काव बफर 5 एमएल गोजातीय सीरम albumin (5 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान से) |
| कैल्शियम बफर (बी) | 1 एल Tyrode बफर 1.2 मिमी CaCl 5.5 मिमी डी (+) ग्लुकोज, न्यूनतम |
तालिका 2. वयस्क cardiomyocyte अलगाव बफर व्यंजनों.
| [CaCl] | बफर हस्तांतरण (एक) | कैल्शियम बफर (बी) |
| 0.06 मिमी सीए 2 + | 9.5 मिलीलीटर | 0.5 मिलीलीटर |
| 0.24 मिमी सीए 2 + | 8.0 मिलीलीटर | 2.0 मिलीलीटर |
| 0.60 मिमी सीए 2 + | 5.0 मिलीलीटर | 5.0 मिलीलीटर |
| 1.20 मिमी सीए 2 + | 0 मिलीलीटर | 10 मिलीलीटर |
टेबल 3.Calcium अनुमापन समाधान व्यंजनों.
| मध्यम चढ़ाना | पोषक माध्यम |
|
|
तालिका 4. चढ़ाना और संस्कृति मीडिया व्यंजनों.
| विंदुक समाधान | स्नान समाधान |
|
|
सारणी 5. पैच दबाना समाधान (दिखाया समाधान सोडियम धाराओं को मापने के लिए कर रहे हैं).
चित्रा 1. .. वयस्क cardiomyocyte अलगाव उपकरणों ए) OptiVisor ऑप्टिकल ग्लास दूरबीन ताल बी) ऊतक संदंश, 1x2 दांत में 5.5 -. Roboz वैज्ञानिक सी) Moloney संदंश -. Roboz वैज्ञानिक डे) ड्यूमॉन्ट - (11.5 सेमी) लंबे मामूली वक्र, दाँतेदार में 4.5 # 3 संदंश, Dumostar, टिप आकार 0.17 x 0.10 मिमी. एफ) पैकर Mosquito संदंश सीधे फ्लैट में 5 -. Roboz वैज्ञानिक जी) माइक्रो विदारक कैंची में 4.5 घुमावदार तीव्र / तीव्र -. Roboz वैज्ञानिक एच) सीधे तीव्र / तीव्र 20 मिमी में सूक्ष्म विदारक कैंची 3.5 -. Roboz वैज्ञानिक मैं) 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब - थर्मो फिशर वैज्ञानिक जे) 60mm पेट्री पीबीएस कश्मीर) Softsilk युक्त पकवान: वैक्स लेपित लट रेशम, 19 मिमी - Covidien एल) प्लास्टिक कीप, 6.0 सेमी व्यास एम) नायलॉन जाल - 400μm ताकना आकार.....
चित्रा 2. वयस्क cardiomyocyte अलगाव. बी) cannulated दिल. सी) गैर चमड़े के नीचे केन्युलेशन सुई के बढ़े हुए देखने गर्म करने के लिए प्रयोग किया जाता खोखला, शंक्वाकार गिलास संग्रह कीप के बढ़े हुए देखने के लिए इस्तेमाल किया Langendorff उपकरण. ए) पूरे Langendorff छिड़काव प्रणाली. (पुन: प्रयोज्य Feedinजी सुई (24 जी, सीधे, गोल टिप, 25 मिमी लंबा, ललित विज्ञान उपकरण इंक मद 18061-24). डी) पानी स्नान घूम ई) जल छिड़काव, एंजाइम और हस्तांतरण बफ़र्स incubating के लिए स्नान.
चित्रा 3. छिड़काव प्रणाली की एक विस्तृत योजनाबद्ध.
चित्रा 4. संशोधित पाश्चर पिपेट. पिपेट एक लगभग 45 डिग्री के कोण पर टिप के काटने से संशोधित किया गया था. यह एक बड़ा सतह क्षेत्र के लिए अनुमति देता है और वे अलग किया जा रहा है के रूप में कोशिकाओं पर कम कतरनी तनाव पैदा करता है. इनसेट संशोधित टिप के एक करीब देखने से पता चलता है.
चित्रा 5. ट्रांसफ़ेक्ट सुसंस्कृत और GFP cardiomyocytes. ए) हौसले ISOLAT 12 सप्ताह के एक C57BL6 चूहा से एड वयस्क cardiomyocytes. तीर मृत या मर कोशिकाओं को इंगित करें. इन कोशिकाओं को सेमी. बी) GFP ट्रांसफ़ेक्ट वयस्क माउस cardiomyoctyes 24 संस्कृति. सी) के मानव संसाधन सुसंस्कृत वयस्क माउस cardiomyocytes 24 घंटे के बाद के बाद स्वस्थ, छड़ के आकार वयस्क की तुलना में अधिक गोल कर रहे हैं. इनसेट सुसंस्कृत myocytes की वृद्धि बढ़ाई पता चलता है.
चित्रा 6. . MMSYS प्रणाली कक्ष नीले तीर छिड़काव बफर (बफर बी) के प्रवाह का प्रतिनिधित्व क) एकल, में लाइन समाधान हीटर -... वार्नर उपकरण निगम बी) MyoPacer क्षेत्र उत्तेजक को MMSYS प्रणाली कक्ष से तारों को जोड़ने सी) प्लेटिनम चैंबर के केंद्र में स्थित क्षेत्र उत्तेजना के लिए इलेक्ट्रोड. डी) बहना जलाशय. ई) चैंबर खुले स्थान में clamps.
चित्रा 7. प्रतिनिधि MMSYS प्रणाली डेटा जैक्सन प्रयोगशाला से प्राप्त जंगली प्रकार C57BL6 चूहों के लिए दर्ज की गई. 2 सीए के ए) MMSYS आधार सिकुड़ना निशान. बी) अनुपात सीए 2 + करने के लिए बाध्य + अपार Fura2-AM आधार कैल्शियम निशान उत्पन्न करने के लिए दर्ज की गई. ये निशान) एक में सिकुड़ना माप के अनुरूप हैं. सी) एक विशेषता सिकुड़ना ट्रेस. डी) बी में आधार निशान से संकलित विशेषता कैल्शियम ट्रेस) में MMSYS सिस्टम सॉफ्टवेयर द्वारा संकलित आधार सिकुड़ना निशान औसत. समग्र निशान का विश्लेषण शोधकर्ता सिस्टोलिक और डायस्टोलिक समारोह के लिए किराए मापदंडों उत्पन्न करने के लिए अनुमति देगा. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 8. एक जंगली प्रकार वयस्क माउस cardiomyocyte की कार्रवाई क्षमता दिखा पैच दबाना ट्रेस.
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Discussion
इस रिपोर्ट में, हम माउस दिल से सफल अलगाव और वयस्क सीएमएस की संस्कृति के लिए आवश्यक तकनीक का वर्णन किया है. हमारी तकनीक ऊपर वर्णित विधि का उपयोग कर मुख्यमंत्री समारोह और excitability के बाद अध्ययन के लिए अनुमति देता है. वयस्क सीएमएस की कार्यक्षमता के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर अलग मुख्यमंत्रियों के स्वास्थ्य की गुणवत्ता है. ऊपर वर्णित है, हमारी तकनीक adenoviral / lentiviral संस्कृति में संक्रमण, और सेलुलर excitability और सिकुड़ा समारोह के विश्लेषण का उपयोग जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी हैं कि कार्यात्मक कोशिकाओं के एक उच्च उपज के लिए अनुमति देते हैं.
कार्यात्मक वयस्क माउस सीएमएस के अलगाव के लिए सबसे महत्वपूर्ण मानदंडों में से एक गैर चमड़े के नीचे सुई पर सटीक और दिल का तेजी से केन्युलेशन है. केयर बाएं वेंट्रिकल से जुड़ी महाधमनी दिल की तेज और अधिक तेजी से केन्युलेशन के लिए अनुमति देने के लिए एक पर्याप्त लंबाई को विच्छेदित कर रहा है कि यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए. टी cannulating जबवह दिल, यह सुई की नोक आरोही महाधमनी में रहता है और कोरोनरी धमनियों के माध्यम से ऊतक के कुशल छिड़काव के लिए अनुमति देने के लिए बाएं वेंट्रिकल में महाधमनी वाल्व अतीत का विस्तार नहीं करता कि यह भी आवश्यक है. अगले महत्वपूर्ण कदम एक रेशम सीवन का उपयोग कर सुई की स्टेम करने महाधमनी हासिल है. छिड़काव बफर कोरोनरी धमनियों और बाएं निलय गुहा में प्रतिगमनपूर्वक बहती है लेकिन विच्छेदित महाधमनी या महान वाहिकाओं के बाहर का अंत के माध्यम से antegradely बाहर प्रवाह नहीं है कि इतनी सीवन, आरोही महाधमनी पर बंधे होने चाहिए.
कुछ जांचकर्ता यह मददगार केन्युलेशन की गुणवत्ता और एंजाइम के बाद छिड़काव का आकलन करने के लिए एक दबाव नापने का यंत्र स्थापित करने के लिए लगता है. 100 CMH 2 हे, और एंजाइम के साथ छिड़काव पर, दबाव ~ 40-50 cmh 2 ओ को कम करेगा - एक दबाव नापने का यंत्र का उपयोग करते समय, प्रारंभिक बाएं निलय दबाव ~ 80 होना चाहिए निलय दबाव इस बिंदु तक पहुँच जाता है, यह हैसबसे अधिक संभावना सुई से कटौती करने के लिए होने के लिए तैयार है. निलय अच्छी तरह से पचा रहे हैं, यह सुनिश्चित करने के माध्यम से प्रवाह की कुछ बूँदें एक पेट्री डिश में दिल के नीचे से एकत्र की है और किसी भी जीवित, मौन कोशिकाओं मौजूद हैं देखने के लिए जाँच की जा सकती.
इस प्रक्रिया से उत्पन्न अलग कक्षों में अच्छी तरह से immunocytochemistry के लिए उधार दे. वे नियमित रूप से फिक्सिंग तरीकों 29 (यानी Formalin, paraformaldehyde, ठंडा मेथनॉल या एसीटोन) का उपयोग कर तय किया जा सकता है, लेकिन अधिक से permeabilization के एक उच्च स्तर आम तौर पर नवजात cardiomyoctyes के लिए प्रयोग किया जाता है कभी कभी छवि साइटोसोलिक प्रोटीन या प्रोटीन संरचनाओं की जरूरत है (यानी अल्फा sarcomeric actin, बीटा मायोसिन). अंत में, कोशिकाओं सुसंस्कृत और बाद में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने एडिनो या lentiviruses से संक्रमित, या सेलुलर सिकुड़ा तंत्र के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
वयस्क माउस सीएमएस की संस्कृति में लंबे समय के रूप में वर्णित किया गया हैचुनौतीपूर्ण. कार्यात्मक कोशिकाओं की उपज 36 घंटा के बाद स्पष्ट रूप से कम हो जाती है, हालांकि यहां वर्णित तकनीकों का उपयोग करना, हम नियमित तौर पर संस्कृति अप करने के लिए 72 घंटे के लिए इन कोशिकाओं कर सकते हैं. संवर्धन कोशिकाओं है, यह कोशिकाओं 2% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर चढ़ाया जाना आवश्यक है. यह पहले 24 घंटे के लिए 10% सीओ 2 में सुसंस्कृत और फिर 5% सीओ 2, या भी 5% सीओ 2 को पसंद करते हैं जो नवजात हृदय fibroblasts, के लिए बंद किया जाना पसंद करते जो नवजात सीएमएस से अलग है. भंग सीओ 2 2% है कि इतनी चढ़ाना और संस्कृति मीडिया equilibrated किया जा सकता है.
मीडिया बदल जाता है जब वे कांच की लिफ्ट बंद नहीं करते हैं तो कोशिकाओं laminin लेपित coverslips पर चढ़ाया जाता है. हालांकि, cardiomyocytes भी laminin कोटिंग के साथ कांच के लिए बहुत सुरक्षित रूप से संलग्न नहीं है. यह सावधानी बाँझ pipettes का उपयोग, संस्कृति मीडिया बदलते समय लिया, और नहीं एक वैक्यूम आकांक्षा प्रणाली हो कि इसलिए बहुत महत्वपूर्ण है. एक बार सेलएस चढ़ाया जाता है, वे अधिक नहीं 2 घंटे के लिए वायरस incubating द्वारा adenovirus साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है. समय वायरस और पर व्यक्त किया जा रहा है प्रोटीन की अनुमापांक पर निर्भर करता है, तो हम वायरस के लिए एलडी 50 और प्रवर्तन निदेशालय 50 निर्धारित करने के लिए प्रारंभिक प्रयोगों का आयोजन सलाह देते हैं. ज्यादातर मामलों में, हम adenovirus के लिए 20-100 के MOI का उपयोग करें. कोशिकाओं वायरस के साथ incubated किया गया है एक बार, लक्ष्य जीन (एस) की अभिव्यक्ति आम तौर पर 24-36 घंटा ~ लेता है.
MMSYS प्रणाली कक्ष के लिए एक उपयुक्त आकार की coverslips पर चढ़ाया जाता है कि अलग कक्षों भी MMSYS इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर सिकुड़ना और कैल्शियम से निपटने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है. ये coverslips सीधे कक्ष में रखा जा सकता है, और संस्कृति के माध्यम छिड़काव प्रणाली मोड़ से हटाया जा सकता है. कोशिकाओं सुसंस्कृत नहीं जा रहे हैं और सीधे अलगाव के बाद के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, तो एक coverslip रखा गया है एक बार, वे कक्ष से सीधे जोड़ा जा सकता है. जबयह हौसले से अलग कोशिकाओं का विश्लेषण करते हैं, हमारे अनुभव में, laminin कोशिकाओं बेहतर coverslip का पालन करना मदद करता laminin साथ coverslips कोट पूर्व के लिए आवश्यक नहीं है. MMSYS इकाई के लिए एक धीमी प्रवाह दर का प्रयोग इसके अतिरिक्त कक्षों coverslip से जुड़ी रहना सुनिश्चित करता है. अंत में, माइक्रोस्कोप, विशेष उद्देश्य लेंस की प्रकाशिकी राजनीति सिकुड़ना के मूल्यांकन के लिए आवश्यक sarcomeres की सटीक दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए, पिछले एक प्रयोग को साफ किया जाना चाहिए.
MMSYS प्रणाली के सबसे महत्वपूर्ण घटक यह चैम्बर में बहती के रूप में छिड़काव बफर (बी) तपता है कि एकल में लाइन द्रव हीटर है. उपकरण के इस टुकड़े की thermogenic तत्व संवहनी गर्मी हस्तांतरण के माध्यम से तरल पदार्थ गुजरने के साथ गर्मी का आदान प्रदान करने के लिए बनाया गया है, ताकि प्रवाह अनुपस्थित है, तो एक्सचेंजर ज़्यादा गरम करना होगा और अपूरणीय सिस्टम को नुकसान पहुंचा सकता है. यह हीटर प्रवाह शुरू की है के बाद ही चालू है इसलिए यह जरूरी है.
वयस्क cardiomyocytes की सिकुड़ा तंत्र का विश्लेषण करने के अन्य तरीकों में पहले परमाणु बल माइक्रोस्कोपी 30-32 का उपयोग परिष्कृत तरीकों सहित, में वर्णित किया गया है. इन तरीकों में से कुछ इस तरह प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से प्राप्त सीएमएस के रूप में स्पष्ट रूप से परिभाषित sarcomeric सिस्टम के बिना अनियमित आकार कक्षों या कक्षों की माप के लिए उन्हें और अधिक अनुकूल बनाने, स्थानीयकृत सिकुड़ा बल और ऐसे यंग मापांक के रूप में संपत्ति के और अधिक परिष्कृत माप के लिए अनुमति देते हैं. इन तकनीकों में बस के रूप में आसानी से अलग वयस्क मुख्यमंत्रियों पर इस्तेमाल किया जा सकता है. MMSYS प्रणाली का लाभ सिकुड़ना और स्पष्ट रूप से परिभाषित sarcomeres के साथ कोशिकाओं में समय की एक छोटी अवधि में कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या को मापने की क्षमता को मापने के सापेक्ष कम है. इसके अतिरिक्त, सेल की लंबाई या sarcomeres के बीच लंबाई उपाय कर सकते हैं कि मुलायम बढ़त और sarcomere विश्लेषण प्रणाली क्रमशः दो अलग (लेकिन अनुसंधान के लिए अनुमति देते हैंउत्तेजित) तरीकों सिकुड़ना को मापने के लिए. उन्नत, उपयोगकर्ता के अनुकूल विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ संयुक्त डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर जानने के लिए और उपयोग करने के लिए इस प्रणाली को आसान बनाता है. अंत में, एक साथ कैल्शियम की गतिशीलता को मापने की क्षमता सिकुड़ना और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी के साथ संभव नहीं है, जो कैल्शियम homeostasis, के बीच संबंध के लिए अनुमति देता है. डेटा उत्पादन एक कैल्शियम सक्रिय डाई (Fura2-AM) की एक ratiometric उपाय है क्योंकि इसके अलावा, सही अंशांकन के साथ, आंतरिक कैल्शियम की सांद्रता का पूर्ण उपायों एकत्र किया जा सकता है.
वयस्क cardiomyocytes से आयन चैनल संकेतों के सफल रिकॉर्डिंग कोशिकाओं इष्टतम हालत में होने की आवश्यकता है. इसके तत्काल बाद वे पक्षपाती नहीं कर रहे हैं और समाधान में जारी करेगी कोशिकाओं के अलगाव और चढ़ाना के बाद, इस स्तर पर वे अध्ययन नहीं किया जा सकता. कुछ ही घंटों के भीतर ही वे एक लेपित coverslip का पालन करना होगा और यह वे अध्ययन किया जा सकता है कि इस बिंदु पर है. हमारे अनुभव के कुछ ही घंटों के भीतर पट्टी मेंचढ़ाना, इष्टतम परिणाम पैदावार पर प्रतिकूल बहुत लंबा इंतज़ार कर के रूप में कोशिकाओं को प्रभावित करता है. एक gigaohm सील की स्थापना और सेल में तोड़ने के बाद आराम झिल्ली क्षमता है, साथ ही खुद कोशिकाओं पट्टी के समय में कर रहे हैं कि कैसे स्वस्थ प्रतिबिंबित कि दो मापदंडों हैं एक gigaohm मुहर स्थापित करने की क्षमता का परीक्षण, ऊपर वर्णित है. यह करार नहीं कर रहे हैं कि कोशिकाओं पर पैच करने के लिए आसान है, यह एक शर्त नहीं है, पर्याप्त जवानों के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं की धड़कन पर प्राप्त किया जा सकता है. इस बिंदु पर इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल पैच clamping के अध्ययन के लक्ष्यों पर निर्भर; वर्तमान दबाना तकनीक का उपयोग, सहज या प्रेरित कार्रवाई क्षमता दर्ज किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, वोल्टेज clamping विशिष्ट आयन चैनल का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. झिल्ली में चैनलों की आड़ देखते हुए इस तरह रिकॉर्डिंग आमतौर पर आयन चैनल ब्लॉकर्स की उपस्थिति में प्रदर्शन कर रहे हैं. Tetrodotoxin (TTX), nisoldipine, और सीज़ियम अक्सर, क्रमशः althou सोडियम, कैल्शियम और पोटेशियम चैनलों को ब्लॉक करने के लिए उपयोग किया जाता हैजीएच दवाओं की एक किस्म का इस्तेमाल किया गया है, और उनके उपयोग के विवरण के बड़े पैमाने पर प्रकाशित किया गया है. अधिकांश दृष्टिकोण या तो रिकॉर्डिंग आयन चैनल ब्लॉकर्स के आवेदन और धाराओं को घटाकर पहले और बाद में धाराओं, और / या पूर्व रिकॉर्डिंग करने के लिए उपयुक्त ब्लॉकर्स के साथ पृष्ठभूमि चैनलों अवरुद्ध शामिल है.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
| D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
| Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
| Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
| Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Tissue forceps, 5.5", 1x2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Forceps 5" Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Micro Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
References
- Chlopcikova, S., Psotová, J. Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart. Biomedical Papers. , (2001).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Ballou, L. M., Lin, R. Z. Rapamycin and mTOR kinase inhibitors. J. Chem. Biol. 1, 27-36 (2008).
- Brette, F., Orchard, C. T-Tubule Function in Mammalian Cardiac Myocytes. Circ Res. , (2003).
- Sakata, Y., Hoit, B., Liggett, S., Walsh, R. Decompensation of pressure-overload hypertrophy in G?q-overexpressing mice. Circulation. , (1998).
- Lieu, D. K., et al. Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).
- Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition. J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).
- Muthuchamy, M., et al. Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction. Circ. Res. 85, 47-56 (1999).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).
- Epstein, F., Hunter, J. Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure. New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).
- Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes. Cell Calcium. , (2007).
- Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).
- Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O'Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure. Circ. Res. 78 (2), (1996).
- Splawski, I., et al. Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia. Science. 297, 1333-1336 (2002).
- Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).
- Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition. Science. , (1998).
- Heinzel, F. R., et al. Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice. Circ. Res. 97, 583-586 (2005).
- Li, X., Heinzel, F. R., Boengler, K., Schulz, R., Heusch, G. Role of connexin 43 in ischemic preconditioning does not involve intercellular communication through gap junctions. J. Mol. Cell. Cardiol. 36, 161-163 (2004).
- Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
- Nakamura, A., Rokosh, D. LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).
- Boström, P., et al. A PGC1-?-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis. Nature. 481, 463-468 (2012).
- Liao, R., Jain, M. Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes. Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).
- Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture. J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).
- Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. -S. Methods in Molecular Biology. 689, Humana Press. 205-214 (2010).
- Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269 (2011).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936 (2008).
- Arman, A. C., Sampath, A. P. Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation. J. Vis. Exp. (43), e2107 (2010).
- Wen, H., Brehm, P. Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish. J. Vis. Exp. (45), e2351 (2010).
- Maier, S., Westenbroek, R. An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).
- Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy. Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).
- Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope. European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).
- Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Grütter, P. Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist. Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).
