Summary
ここでは、ランゲンドルフ灌流システムを使用して、成体マウスcardiomyoctyesの単離を記載している。得られた細胞は、電気的に休止状態、のCa 2 +·トレラントであり、培養およびアデノ又は遺伝子発現を操作するためのレンチウイルスでトランスフェクトすることができる。それらの機能は、MMSYSシステムおよびパッチクランプ技術を用いて分析することができる。
Abstract
文化の中での一次心筋細胞（CMS）を使用すると、心臓病の理解を進める上で、心臓病のマウスモデルへの強力な補完を提供してきました。具体的には、疾患状態および疾患を引き起こす突然変異により、イオンホメオスタシス、イオンチャネル機能、細胞の興奮と興奮収縮連関とその変化を研究する能力は、心臓疾患に有意な洞察をもたらした。さらに、成人のCMを模倣するための適切な不死化細胞株の欠如、文化の中で（成人のCMの構造的および機能的生体力学特性の多くを欠いている）新生児のCMの制限は、シグナル伝達経路間の複雑な相互作用の理解を妨げている成人の心臓のイオンチャネルおよび収縮特性は、大人の孤立心筋細胞を研究することの重要性を強化する。ここでは、アデノウイルスexpreによる遺伝子発現の単離、培養、操作するための方法を提示するssedタンパク質、および成体マウスの心筋細胞のその後の機能解析。これらの技術の使用は、細胞の興奮性を調節する経路、Ca 2 +の動態及び収縮性をシグナルに機械的な洞察力を開発し、心血管疾患の多くの生理学的に関連する特性評価を提供するのに役立ちます。
Introduction
心血管疾患のマウスモデルは、潜在的な治療標的に1,3を識別するための基本的な病気のメカニズムの1,2の解明だけでなく、のための効果的なツールとして役立ってきた。具体的には、（例えば、圧力過負荷など）後天性心疾患の両方のマウスモデル4,5およびトランスジェニックマウスモデルの使用は、心臓病6-8の我々の理解を進めてきた。単一細胞のレベルで心臓11-13に細胞の興奮と興奮収縮連関の根底にある個々のタンパク質におけるシグナル伝達カスケード3,9,10及び変更を研究するための細胞培養技術の使用は、 インビボのマウスモデルを補完している。しかしながら、成人のCMの構造と機能を反映十分な細胞株の欠如は、重大な制限となっている。研究者らは、異種発現系において、イオンチャネルなどの個々のタンパク質を研究することによってこの問題を克服しようとしてきた
原発新生児ラット心室心筋細胞（NRVMs）が文化に比較的容易に、遺伝子発現15を操作するためにアデノウイルスおよびレンチウイルスに感染することができているNDしたがって首尾よく1使用されますが、自分自身の限界を持っているされています。これらは生理的微小環境1を提供し、シグナリング·フィールドの主力してきたが、形態およびNRVMsと大人のcardiomyoctyesの細胞内組織との間の実質的な違いは、彼らに大人の心の中のイオンフラックスと興奮収縮連関の研究には不十分モデルを作成。最も顕著なのはNRVMsは決定的なT-管状サブシステム4を欠いている。 Ca 2 +のフラックスとダイナミクスが成熟T-管状と筋小胞体（SR）構造6、Ca 2 +の動態とNRVMsにおける心収縮性の機能研究に決定的に依存しているので、成人の心筋細胞でこれらの重要なプロセスを正確に反映していない。さらに、シグナル伝達経路の一部のコンポーネントは、それによって病気のプロセスとそのIを研究するための別の制限を提供し、新生仔および成体マウス9の間で異なるNRVMs中の細胞の興奮と収縮性に対するMPACT。最後に、収縮機構の分布は、収縮測定の精度を制限する多方向不均一な細胞短縮につながる。
孤立した大人の心筋細胞の使用は、より正確なin vitroのモデル化システムを提供しています。マウスの遺伝子操作によって可能になった知識の驚くべき成長は、マウスから機能的な孤立心筋細胞を得ることの重要性を強調している。実際には、マウスモデルから分離され、成人のCMの特徴付けは、多くの生物学的および病理学的事象を解明しました。トランスジェニックマウスモデルから分離されたCMは、それによって中から得られた情報を補完し、そのような虚血/再灌流17,18として疾患モデルでのゲインまたはタンパク質の機能喪失単セル2,16の収縮特性上、及び生存率の研究を可能にした上のin vivo試験SEマウス。 （生理肥大をモデル化するための）や運動5,21検査のために可能にする（模倣高血圧や大動脈弁狭窄症は、そのような横方向の大動脈狭窄誘発の圧負荷など、）後天性心疾患3,19,20のマウスモデルから単離した成人のCMの使用単セルのレベルでの細胞の興奮と興奮収縮連関と、これらのプロセスに関与するシグナル伝達カスケードの相互作用の。さらに、成人のCMでアデノウイルス駆動性遺伝子発現を用いて遺伝子発現を操作する能力は、私たちの複雑なシグナル伝達経路の成分を分析する機会を与える。
電気生理学の観点から、全セル電圧および単離された成体のCMに電流クランプ実験は、ベースラインでのイオンフラックスの性質を解明することで、種々の疾患状態において重要であった。なぜなら、細胞膜の複雑な構造と差動proteの成人のCMとNRVMsまたは異種の細胞株の間に足場構造で、成人の細胞にパッチを適用する機能は、特定の膜タンパク質、構造タンパク質、および成人の心臓の電気生理学的コンポーネントのイオンチャネル相互作用パートナーの影響のより良い表現を提供します。
大人のマウスの心筋細胞を研究する上で、このような顕著な利点にもかかわらず、成体マウスの心筋細胞を分離して培養したウイルスを用いてさらに遺伝子操作を可能にするために実行可能なマウスの心筋細胞を分離し、培養液中で、それらを維持するための方法論の体系的かつ正確な説明の必要性を促し、挑戦しているベクトル。これまでの研究では、急性単離したマウスの成人CMSまたは培養したラットの成人のCMのいずれかを使用している。後者は、成体マウスのCMよりも文化に容易であり、in vitroでの遺伝子発現を操作するほとんどの実験は、ラット大人のCMを使用している。いくつかの研究が正常に変更し、functiをを調査した実験の範囲に大きな制約を提示し、マウスの大人のCMSのonal遺伝子発現。そこで、ここでは詳細に隔離7,8,22、文化3,10,15,23、アデノウイルス感染11-13,15、および成体マウスの心室cardiomyoctyesの機能解析のための以前の研究から変更などの方法を、紹介します。この分離プロトコル我々は、最大72時間のために正常に培養し、一過性にアデノウイルスでトランスフェクションしていたCa 2 +トレラント、興奮性心筋細胞における結果。これらの単離された細胞の機能は、説明するMMSYS撮像システム14,24およびパッチクランプを用いて評価することができる。
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Protocol
1。心筋細胞の単離
材料（図1）
Microdissecting鉗子
組織鉗子
繊細な止血鉗子
止血鉗子
Microdissecting、鋸歯状、湾曲鉗子
ストレート操作はさみ、
湾曲したオペレーティング·はさみ、
15ミリリットルファルコンチューブ（5）
60ミリメートルペトリ皿
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）
ナイロンメッシュ - 400ミクロンの孔の大きさ
小さな漏斗
ワックスコーティングされた、編まれた絹4-0 7-10センチ19ミリメートル、
非皮下注射針、平滑末端、24 Gまたは商業動物給餌針（W/1-1/4、24×1）
ヘパリンナトリウム
ケタミン/キシラジン混合物
パスツールピペット
OptiVision解剖ゴーグル
IonOptix MMSYSシステム
注意：細胞を培養する場合は、このプロトコルを開始する前に、細胞培養のセクション2を参照してください。
注：全てのマウスでの世話をし、バリア機能と承認されたIACUC規制、慣行、および手順に従って屠殺した。
注：前に作業を開始し、システム全体がランゲンドルフシステム（ 図2A、図3）のすべての要素が適切かつ完全なコラゲナーゼ活性を可能にするために37℃に温めていることを保証するために予熱する必要があります。
- 腹部の空間にナトリウムヘパリン150 USP単位で成体マウス（〜12週）を注入。
- 重量依存用量（ 表1）でのケタミン/キシラジン混合物の注射で麻酔。
- 80:12 mg / kgのケタミン：キシラジンレシピ：2.6ミリリットルケタミン（100 mg / ml）を+ 0.4ミリリットルキシラジン（100 mg / ml）を+ 37ミリリットルのPBS。最終：ケタミン= 6.5 mg / mlの、キシラジン= 1 mg / mlの
- 営業パッドに鎮静マウスを固定し、心臓を切除し、室温PBSまたは0.9％生理食塩水（ 図1J）の皿に置く。 PHYsiologic生理食塩水は、そのまま心臓がチャンバー内の血液のよりよい押出および1.6に移行する前に大動脈を容易に識別のための契約を可能にする。マウスは、彼らが深く後肢足指ピンチレフ前開胸の発症呼吸数の減速の損失を経由して麻酔することを確認するためにチェックした。
- 大動脈を特定して公開するOptiVision解剖ゴーグル（ 図1A）を使用します。大動脈基部がはっきり表示されている場合には、血管の可視化を容易ではないが、大動脈周囲の組織を除去すると、細胞単離の最適化のための必要はありません。
- 素数潅流緩衝液（ 表2）を有するポンプ。温度が制御され、循環水浴（ 図2D）を用いて手順の長さを37℃に保持されるべきである。
- ランゲンドルフ装置（ 図2A）に心をマウントします。 2マイクロ解剖鉗子（ 図1D-E）の使用、PR遠位先端にシリコンチューブを非皮下、平滑末端針（24 G）を中心に大動脈をIME。あるいは商用動物給餌針（W/1-1/4において24×1）を用いることができる。 24 G針や動物給餌針にシリコンチューブが溝の上に縫合糸を固定するためにできるようになります。靴下のような針で大動脈を配置します。 （ 図2C）。
- 注意：これは、針の端が理想的には腕頭に大動脈起始部の遠位に、上行大動脈にかかっているが、これは深刻なようにそれは、左心室に大動脈弁を通って延びていないことを確認することは重要である効果的に冠状動脈を介して心臓を通して灌流するバッファの能力を制限する。
- （7〜10センチメートルロング）縫合シルクの小さな長さを接続することにより針に心を固定します（ 図1K）大動脈の上部の周囲、タイが右腕頭のarterの下に、上行大動脈のレベルであることを保証Yが、針の端部を超えている。
- 適切な周囲温度を維持するために、円錐形ガラス（ 図2B）の内部に心を下ろします。
- 1ml /分の速度で5分間灌流緩衝液で心臓を灌流し、灌流液が円錐ガラス中に収集し、心臓を包むことができるようにガラスチャンバーの流出をクランプする。心を消化するための回路図を図3に示します。
- この時点で、心臓の増加量が表示されるはずです。さらに、心臓組織内の血液は、組織蒼白を引き起こし、灌流液によって置換される。
- 灌流液を排出するために流出クランプを解除する。酵素バッファー容器（ 図2E）に灌流バッファ容器からチューブを移動するためにポンプを停止します。 1ミリリットル/分で酵素緩衝液（ 表2）を心臓に灌流を開始するためにポンプを再起動します。酵素緩衝封筒できるようにするために、再び流出をクランプ心。
- ここでは、酵素は、心臓を灌流し、結合組織を消化しているように、心臓は淡いなり、構造的完全性は減少するでしょう。
- 、消化された心臓から心室をカット円錐ガラスから心を持ち上げ、静かにピンセットで心を絞ると、小さなシャーレに灌流液を数滴を収集し、単一の細胞が脱落しているかどうかをどうかを確認するかを決定するために。
- 初心者にとっては、圧力計の灌流ラインを接続するために役立ちます。心が消化なっている場合には、結合組織が耐性を保持していないように圧力が急速に低下する。圧力計は、針の位置が大動脈弁の上ではなく、心にあることを確実にするためにも、初心者に便利です。低圧は針が心室にあり、高圧ニードルバルブに触れることが示されたことを示します。
- 皿に心臓から心室をカット転送バッファ（A）（ 表2）の完全な心室圧は劇的たり、灌流液中の単一細胞を見ることができる時に低下し始めたとき。これは通常〜7月10日分かかります。
- 再び（ 図1C）、マイクロ解剖ピンセットを用いて、解離する小さな断片に心室をミンチ。成功の消化は、組織のほとんどが解離時にアモルファスになってきてて、ミンチ後の組織のほとんどない固体の塊を残す。
- さらに、先端が約45°の角度で切断されていたから、プラスチック製パスツールピペット（ 図4）を使用して、イン/アウト組織、ピペットソリューションを解離させる。この変形例は、組織が磨砕される細胞上の剪断応力の量を減少させる、従って、ピペットチップの内径の空間を増加させるのに役立つ。
- 鉗子で組織を切開する前に、それが個々のチャンバを分離し、別々に心房、左心室またはライを解離することが可能であるトン心室細胞。
- クランプを使用し、小さな漏斗（ 図1L）に乗メッシュ（ 図1M）を確保し、15ミリリットルのファルコンチューブ（ 図1I）に、この濾過装置を置く。
- 皿から細胞溶液を除去し、ファルコンチューブに溶液をフィルタリングするために修飾されたパスツールピペットを使用する。
- （生細胞沈降が2-4分を取る必要があります）生細胞をチューブの底に沈殿することができます。
- 4個別の15ミリリットルファルコンチューブに4カルシウムソリューション（ 表3）のそれぞれのアリコート2.5ミリリットル。
- 再度、標準的なパスツールピペットを用いて、慎重に管の底部から細胞ペレットを除去し、カルシウム溶液の最初に細胞を移す。
- 細胞は、チューブの底に沈殿し、細胞が最後の解決策になるまで、その後のカルシウム溶液中にステップ1.17を繰り返しすることができます。
- 細胞は4トンに定住させてはいけない時間カルシウム溶液。チューブに蓋をし、その側に回します。
2。細胞培養
- 隔離板の1μg/ mlの天然マウスガラスカバースリップ上にラミニンおよび37℃で少なくとも1時間インキュベートし、2％CO 2の前に。また、メッキや培養培地（ 表4）は 37℃、2％CO 2のインキュベーター内で加温することができます。これは、メディア内の溶解したCO 2を平衡化することができます。
- メディアからのトップを抜かないでください。単に汚染を避けるために、トップを緩めます。
- 単離された細胞は、ファルコンチューブの底にペレット化することができます。
- メディアのめっき適当量の標準的なプラスチックパスツールピペット再懸濁を使用してペレットを削除します。
- プレートに適切な大きさの皿の中で、ラミニンコートしたカバーガラス上の細胞と細胞がカバーグラスに付着することを可能にするために、少なくとも30〜60分間37℃、2％CO 2でインキュベートする。
- **アデノウイルスでトランスフェクションする場合には、メッキのメディアの適切な量のウイルスを希釈し、ウイルス含有培地で皿にプレーティングメディアを交換してください。ウイルスは、37℃で2時間、2％CO 2細胞上でインキュベートしましょう。**
- 皿からメッキメディアを取り出して、培養培地と交換してください。
- カバーガラス上の細胞を乱さないように注意深く毎日培養培地を変更してください。
この手順を使用して、細胞が正常に最大72時間培養した。培養し、GFPトランスフェクトされた細胞の画像を図5に見出すことができる。
3。 MMSYSシステム
- アーク灯が最初に開始されることを確実にするMMSYSシステムの電源を入れます。
- MMSYS室の適切な入口と出口（ 図6）にポンプからチューブを接続します。
- プライムカルシウム緩衝液（B）を有するシステム（ 表2）。
- APPRを配置室内へのopriatelyサイズのガラスカバースリップと（ 図6E）固定します。最もMMSYS室が22ミリメートル以上25ミリメートルの正方形カバーグラスのいずれかを使用する。あなた室のための適切なカバースリップを決定するためにあなたのMMSYSのユーザマニュアルを参照してください。
- 小さなエッペンドルフチューブに細胞溶液500μlを移す。
- 細胞の小さなチューブに0.5μLたFura2-AM（1μgの/μLのストック溶液）を追加し、それらを5-7分間、室温で暗所にインキュベートすることができます。これは、細胞膜を介した迅速な受動拡散を通じて細胞内への「ロード」のFura2-AMを可能にします。
- フラ-2負荷細胞をチューブの底にペレットましょう、とカルシウム緩衝液Bの500μlの過剰フラを洗う
- 部屋の照明をオフにします。
- 標準パスツールピペットを用いて、チャンバー（ 図6C）の中心に「ロードされた」細胞溶液1〜2滴（細胞濃度に依存）をドロップすると、細胞がT許すO 5分間カバースリップの上に落ち着く。
- チャンバー内の細胞の密度は、単一の非重複細胞は容易にMMSYSデータ取得プラットフォームで表示できるようにすべきである。
- 慎重にチャンバを通してカルシウム緩衝液（B）を流れ始める。
- 37℃に室内温度を上げる
- 重要：フローが開始されるまで、加熱装置をオンにしないでください。これは深刻なフィードバック熱電対（ 図6A）が損傷することがあります。
- 接続ワイヤ（ 図6B）を介してチャンバがMyoPacerに接続されていることを確認し、1.5倍の細胞のためのペーシング閾値において細胞を5 Hzのペースを開始。
- 正しい周波数で打っているセルを選択し、フレーミング開口部に移動します。
- セル全体がウィンドウの中心になるようにカメラとフレーミング開口寸法を調整して、水平方向、筋節のAPと親。
- セル長のために、セルの端に赤と緑（左右）、フォトダイオードの指標を調整します。セルの端の白/黒のコントラストを最適化するためにコントラストを調整します。詳細はIonoptixのマニュアルを参照してください。
- 明確に定義された筋節を含むセルの領域内にボックスを配置し、パワースペクトル（赤）のピークを最適化するために、ピントを合わせます。また、青色のスムージングウィンドウと黒のコントラスト情報を最適化するために、顕微鏡の明るさを調整します。
- 赤いパワースペクトル（ピーク）と、可能な限り少し背景をできるだけ多く取り込むために、緑のしきい値バーを調整します。
- 録音を開始します。
- 十分なデータが記録された後、一時的に録音を停止し、「一時停止」をクリックして、表示ウィンドウのフォーカスや寸法のいずれもが改変されることを保証する、細胞も細胞材料はならないことができるカバースリップの領域に、顕微鏡のステージに移動する見。レン記録のGTHは研究者の実験プロトコルに依存して変化する。
- （注）「停止」をクリックすると、録画を終了し、バックグラウンドは、そのセルのために記録することができなくなります。
- バックグラウンド測定を記録するために「再開」をクリックしてください。
- 十分な背景が録音を終了するために「停止」をクリックして記録された後。
- シングル。ZPTファイルでそのセルのすべてのトレースを保存するには、「ファイル>>保存」をクリックします。
- 十分な細胞が記録されるまで3.20 - を繰り返して3.12を繰り返します。
- 記録されたデータの分析方法については、IonOptix-MMSYSユーザーマニュアル12を参照してください。野生型心筋細胞の特性は記録されたデータは、図7の中で示されている。
4。パッチクランプ
異なる細胞型パッチクランプ法は、同様にこのジャーナル25-28に以前に記載されている。そこで我々は、いくつかの評論家に焦点を当てる大人の心筋細胞の正常なパッチクランプ用のアル·パラメータは、我々のプロトコルで説明を使用して単離した。
- （フィラメントで：ID 0.86ミリメートル外径1.5ミリメートル、 - 10cmの長さ）は、ピペットプラーとホウケイ酸ガラスを使用したピペット溶液（ 表5）で満たされたとき、〜2.0〜3.0MΩ示すピペットを引き出します。
- 火 - ポーランド優しくナリシゲまたは他の垂直火災ポリッシャーを使用してピペットチップ。パッチピペットの抵抗は、火研磨後2-4ミズーリでなければなりません。
- コンピュータの電源を入れ、アンプ（たAxopatch 200B）、ADコンバータ（Digidata 1440A、アクソン·インスツルメンツ）とマニピュレーター（MP-285）。ホールセルパッチクランプのために、我々は前述のように標準的なパラメータで始まります。
- 培養された大人のCMSの、インキュベーターからそれらを削除し、優しくのCMは、室温でPBSでメッキされているカバーガラスを洗う。
- 穏やかにカバースリップを除去し、倒立顕微鏡（TE、ニコン2上灌流チャンバーに配置し000）。
- （吸引用）灌流システムと出口の入口だけのカバーガラスの表面上にあることを確認してください。
- 適切な細胞外液（ 表5）で灌流を開始します。
- 新鮮に解離した大人のCMSの、上記のように灌流システムでコラーゲン被覆カバースリップを配置。
- 細胞は解決策になりますので、ゆっくりと細胞外液で溶液を交換してください。
- 修正されたパスツールピペットを用いて（ 図4）、そっと外のバッファに細胞を再懸濁、一定分量を取り、カバースリップの上に置きます。
- 細胞が4.4のように、灌流を開始する前に10〜15分間添付してみましょう。
- Microfil（世界の精密機器、28 G）の針を用いて細胞内液と全細胞パッチピペットをバックフィル。気泡がピペットの先端に存在しないことを確認してください。静かに気泡がsurfaに浮くことができるようにタップしてソリューションのCE。
- 微小電極と内部液との接触があることを保証し、ピペットホルダーに満たされたパッチピペットを取り付けます。
- 私たちは、塩化銀の電極を使用していますが、家庭用漂白剤に一晩浸漬することにより、銀線は少なくとも週に一度「塩化物化」の世話をする。
- そっと風呂電極はバス/細胞外液中に常時浸漬されることを保証する、お風呂にピペットを下げる。この時点でいずれかの液間電位を相殺した。大きな接合電位は、電極上に塩化銀の悪化の徴候である可能性があり。
- 健康的な円筒形の成人のCMは、顕微鏡で識別され、視野の中心にされています。前述したように、マイクロマニピュレータを移動させて焦点調節の組み合わせが近いパッチピペットの近傍とCMの表面を可能にする。
- それらが同じ焦点面に入ると、我々の視覚の組み合わせを使用（たAxopatch 200Bで利用可能）は、細胞と試験パルスのブリダイゼーション。
- ピペットの抵抗（ピペットは、細胞の表面に接触していることを示唆する）、および細胞は、円筒形を探し続け半分に減少したら、穏やかな吸引を使用して、ギガオームのシールを確立する。
- CMのために、我々は負圧を確立するために、口の吸引を好む。ギガシールの取得に成功した場合、我々は再びホールセルパッチモードにするセルに「侵入」に優しいリズミカルな口の吸引を使用しています。
- 健康的なCMの典型的な休止電位が-85〜-90 mVと順になっています。ギガシールが得られると、I = 0でpAの電流クランプを使用して、静止膜電位を測定する。
- 静止膜電位が脱分極している場合、これは、損傷した細胞やシール不良を示すことができます。
- CMは、表面積の多い大規模な細胞であるため、細心の注意は、特にW、キャパシタンス補償に支払われる必要があるナトリウムチャネルのような編急速に活性化する電流が検討される必要がある。十分な容量補正は、パルス発生器上で補正設定に内蔵用いて得ることができない場合には、サブスレッショルド電圧と逆極性でのプレパルスを印加する必要がある可能性があり、得られた電流が記録された信号から差し引く。このようなプロトコルを簡単たAxopatchにプログラムされている。
- 全細胞パッチ·モードが確立されると、平衡化を可能にするためには、15分待って、開始前に電圧または電流クランププロトコルにシールの安定性を確保する。私たちは、これと他の雑誌で、以前に記載されており、詳細な説明は省略する標準プロトコルを使用しています。
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Representative Results
棒状、横紋および（自発的に拍動しない）、静止細胞（ 図5A）の成人cardiomyoctyes結果の単離。死んだ細胞は、丸いなりますし、何条線は存在しません。静止状態の細胞を培養し、遺伝子発現（ 図5Bおよび5C）を操作するためのアデノウイルスでトランスフェクトすることができる。培養24時間後、生きた細胞の形態が変化しないが、それでものCa 2 +·トレラントであり、それらは電場刺激によってペーシングすることができる。提案された手順により、80〜90％の生存細胞の収率を達成することができる。
細胞の収縮性を測定するために、MMSYSシステムソフトウェアは、サルコメアの変化または細胞の長さのいずれかを報告するために、顕微鏡からの位相情報を要する。 （ 図7A）に示されていることは、野生型C57BL6マウスの筋節長の測定を経由して、代表収縮トレースです。から健康的な成体マウスの心筋細胞のためのそれマウスは、基線サルコメア長は〜1.7〜1.9程度である。 MMSYSシステムソフトウェアは、同時にカルシウム感受性色素たFura2-AMの非結合形態に結合したとの比を測定することにより、収縮性およびカルシウム処理を測定することができる。比対策はセットアップ間にわずかな違いがあることが、健康な細胞のため、比率は1.5〜2.5（ 図7B）の間である。 MMSYSシステムはカルシウムに対して較正されている場合、この比は、次に細胞内カルシウム濃度の絶対尺度に変換することができる。収縮性とカルシウムのトレースから生成されるデータを分析するために、トレースは、そのセルの特性トレース（ 図7Cおよび7D）を作成するために平均化されなければならない。これらの特徴的な痕跡はその後、その後収縮期および拡張期機能のためのパラメータを生成MMSYSシステムソフトウェアからmonotransientデータ解析アルゴリズムの対象となります。さらなる詳細は、イオン中に存在するオプティクスマニュアル。
成体マウス心筋細胞はまた、活動電位は、電流クランプモードで記録された全細胞パッチクランプ実験（ 図8）に供した。
| ボディ重量（g） | ケタミン/キシラジン（ml）を |
| 15 | 0.18 |
| 20 | 0.25 |
| 25 | 0.31 |
| 30 | 0.37 |
| 35 | 0.43 |
| 40 | 0.49 |
| 45 | 0.55 |
| 50 | 0.62 |
表1。成体マウス重量依存ケタミン/キシラジン投与量（80:12）。
| ソリューション | レシピ |
| タイロードバッファー* 液（pH7.4） | 1Lの蒸留H 2 O 137のNaCl 4のKCl 1mMのMgCl 10のHEPES 0.33ミリモルのNaH 2 PO 4 |
| 灌流バッファー* 液（pH7.4） | 500ミリリットルタイロードバッファー 10mMのD-（+） - グルコース、最小 5 mMのタウリン 10 mMのブタンジオンモノオキシム（BDM） |
| 酵素バッファー* | 50ミリリットル灌流バッファー 0.024グラムコラゲナーゼD（IV型） 0.018グラムコラゲナーゼB（タイプII） ストレプトマイセス·グリセウスから0.003グラムのプロテアーゼXIV |
| バッファ（A）を転送する | 45ミリリットル灌流バッファー （5 mg / mlのストック溶液から）を5mlのウシ血清アルブミン |
| カルシウムバッファ（B） | 1Lのタイロードバッファー 1.2のCaCl 5.5mMのD-（+） - グルコース、最小 |
表2。大人の心筋細胞の単離バッファーのレシピ。
| [塩化カルシウム] | バッファ（A）を転送する | カルシウムバッファ（B） |
| 0.06のCa 2 + | 9.5ミリリットル | 0.5ミリリットル |
| 0.24のCa 2 + | 8.0ミリリットル | 2.0ミリリットル |
| 0.60のCa 2 + | 5.0ミリリットル | 5.0ミリリットル |
| 1.20のCa 2 + | 0ミリリットル | 10ミリリットル |
表3.Calcium滴定ソリューションのレシピ。
| ミディアムのめっき | 培養培地 |
|
|
表4。メッキ、培養培地のレシピ。
| ピペット溶液 | 浴溶液 |
|
|
表5。パッチクランプソリューション（図示溶液はナトリウム電流を測定するためである）。
図1。大人の心筋細胞分離器A）OPTIVISOR光学ガラス双眼拡大鏡B）組織鉗子、1×2の歯、5.5 - 。Roboz科学C）モロニー鉗子- 4.5）11.5センチメートル（で長いわずかなカーブ、鋸歯状- 。Roboz科学DE）デュモン＃3鉗子、Dumostar、チップサイズ0.17 X 0.10ミリメートル。 女）パッカーMosquito鉗子ストレートフラット5 - 。Roboz科学G）マイクロ解剖はさみ4.5カーブシャープ/シャープ- 。Roboz科学H）ストレートシャープ/シャープ20ミリメートルでのマイクロ解剖はさみ3.5 - 。Roboz科学I）15ミリリットルファルコンチューブ-サーモ-フィッシャーサイエンティフィックPBSを含む、J）60ミリメートルシャーレK）Softsilk：。。ワックスコーティングされた編組シルク、19ミリメートル-コヴィディエンL）プラスチック漏斗6.0センチ直径M）ナイロンメッシュ- 400μmの孔サイズ。
図2。ランゲンドルフ装置成人の心筋細胞の単離に用いて、a）全体ランゲンドルフ灌流システム。B）カニューレを挿入し、心臓を暖めるために用いられる中空円錐状のガラスコレクションファンネルの拡大図。C）非皮下カニューレ挿入針の拡大図。 （再利用可能なFeedinG針（24 G、ストレート、ラウンドチップ、25ミリメートル、長、ファイン科学ツール株式会社アイテム18061から24）。D）水浴を循環e）水を灌流、酵素、転送バッファをインキュベートするための風呂。
図3灌 流システムの詳細な概略図。
図4。修正されたパスツールピペットピペットを約45°の角度で先端の切断することによって修正された。これは、より大きな表面積を可能にし、それらが解離されているように、細胞の少ないせん断応力を生成する。挿入図は、修正された先端部の拡大図を示している。
図5。トランスフェクションし、培養およびGFP心筋細胞、A）を新たに絶縁のある 12週のC57BL6マウスからのEDの大人の心筋細胞。矢印は、死亡または死につつある細胞を指す。これらの細胞は、健康、棒状の成人のCMよりも丸みを帯びている。B）、GFP-トランスフェクト成体マウスcardiomyoctyes培養24時間後に、C）培養成体マウスの心筋細胞24時間後。挿入図は、培養筋細胞の増加倍率を示しています。
図6。 。MMSYS系チャンバ青矢印は、灌流液（緩衝液B）の流れを表すA）のシングル、インラインソリューションヒーター- 。ワーナー音源株式会社B）MyoPacerフィールド刺激にMMSYSシステム室からの配線を接続するC）プラチナ室の中心に位置電場刺激のための電極、D）流出リザーバー、E）商工開いた位置にクランプします。
図7。ジャクソン研究所から得られた野生型C57BL6マウスのために記録された代表MMSYSシステムデータ。のCa 2 A）MMSYSベース収縮トレース。B）比のCa 2 +に結合した+結合していないたFura2-AMは、ベースカルシウムトレースを生成するために記録。これらのトレース）Aの収縮の測定に対応します。C）は、特徴的な収縮トレースにMMSYSシステムソフトウェアによってコンパイルベース収縮トレースを平均した。D）のBのベーストレースからコンパイルされた特徴的なカルシウム·トレース）。複合トレースの分析では、研究者が収縮期および拡張期機能のための代理パラメータを生成することができます。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図8。野生型成体マウスの心筋細胞の活動電位を示すパッチクランプ跡。
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Discussion
本稿では、マウスの心臓から大人のCMの成功単離および培養のために必要な技術を説明しています。我々の技術は、上記の方法を用いてCM機能および興奮性のその後の研究を可能にする。大人のCMの機能性を研究するための重要なパラメータは、孤立したCMの健康と品質です。上述したように、我々の技術は、アデノウイルス/レンチウイルスの培養における感染、および細胞興奮性と収縮機能の分析を用いて遺伝子発現の操作に適している官能細胞の高い収率を可能にする。
機能的な成体マウスのCMの単離のための最も重要なパラメータの一つは、非皮下注射針への心臓の正確かつ迅速なカニューレ挿入である。お手入れは、左心室に接続された大動脈は、心臓のより簡単で迅速なカニューレ挿入を可能にするのに十分な長さに解剖されていることを保証しなければならない。 Tにカニューレを挿入した場合彼の心には、針の先端が上行大動脈に残り、冠状動脈を介して組織の効率的な灌流を可能にするために、左心室に大動脈弁を越えて拡張しないことも重要です。次の重要なステップは、絹縫合糸を使用した針のステムに大動脈を確保している。灌流液は、冠状動脈および左心室腔に逆行流れますが、解剖した大動脈や大血管の遠位端を通って順行流出しないように、縫合糸は、上行大動脈に接続する必要があります。
一部の研究者は、それが参考にカニューレ挿入の質と酵素のその後の灌流を評価するために圧力計を設置することを見つける。 100 CMH 2 O、および酵素による灌流の際に、圧力は、約40〜50 CMH 2 Oに減少する-圧力計を使用する場合、初期左心室圧は約80であるべきである心室の圧力がこの点に到達すると、それは最も可能性の高い針から切断されること準備ができて。心室が十分に消化されることを保証するために、フロースルーの数滴をペトリ皿に心の下から収集され、任意の生きた、静止状態の細胞が存在するかどうかを確認することができます。
この手順の結果として単離された細胞は十分に免疫細胞化学に役立つ。彼らは、通常の固定方法29（ すなわち 、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、氷冷メタノールまたはアセトン）を用いて固定することができるが、典型的に、新生児cardiomyoctyesために使用されるより透過性の高いレベルは、時々 、画像サイトゾルタンパク質またはタンパク質構造に必要とされる（ すなわち、α-筋節アクチン、ベータミオシン）。最後に、細胞を培養し、続いて遺伝子発現を操作するアデノ又はレンチウイルスに感染した、または細胞収縮装置の機能解析のために使用することができる。
成体マウスのCMの培養物は、長として記載されている挑戦的。機能細胞の収率は36時間後に顕著に減少するが、ここで説明された技術を使用して、我々は、日常の文化までの72時間のためにこれらの細胞をできる。細胞を培養する場合には、細胞を、2％CO 2中37℃でめっきされることが必須である。これは、最初の24時間、10％CO 2で培養し、次いで、5％CO 2、またはさらに5％のCO 2を好む新生児心臓線維芽細胞、に切り替えられることを好む新生児のCMとは異なる。溶解したCO 2が 2％となるようにプレーティングし、培養培地を平衡化することができる。
メディアが変更されたとき、彼らは、ガラスのリフトオフしないように、細胞を、ラミニン被覆カバースリップ上にプレーティングする。しかし、心筋細胞でもラミニンコーティングでガラスに非常にしっかりと付着しない。これは、培養培地を変更するときは注意を滅菌ピペットではなく、真空吸引システムを用いて、取られることが非常に重要である。一旦細胞sはめっきされ、それらはこれ以上2時間以上インキュベートすることによってウイルスを、アデノウイルスでトランスフェクトすることができる。タイミングはウイルスの力価に依存し、タンパク質が過剰発現しているので、我々は、ウイルスのLD 50およびED 50を決定するために予備実験を実施することをお勧めします。ほとんどの場合、我々は、アデノウイルスのために20〜100のMOIを使用しています。細胞を、ウイルスとともにインキュベートされると、標的遺伝子の発現は、典型的には〜24〜36時間を要する。
MMSYS系チャンバのための適切な大きさのカバースリップ上に播種する単離された細胞はまた、MMSYSイメージングシステムを用いて、収縮性およびカルシウム処理について分析することができる。これらのカバーガラスをチャンバ内に直接配置することができ、そして培養培地を灌流システムをオンにすることによって除去することができる。細胞は培養されず、直接単離後に分析のために使用されている場合にカバースリップが配置されると、それらは、チャンバーに直接添加することができる。同時にそれが我々の経験では、ラミニンは細胞がより良いカバーガラスに付着助けない、新たに単離した細胞を分析する際に、ラミニンとカバースリップをコートに事前に必要ありません。 MMSYSユニット用の遅い流速を使用すると、さらに細胞がカバーグラスに付着したままことを保証します。最終的には、顕微鏡、特に対物レンズの光学系は、綿密に収縮性の評価のために必要とされる筋節の正確な可視化を可能にするために、各実験の前に洗浄しなければならない。
MMSYSシステムの最も重要な要素は、それがチャンバに流入するように灌流液（B）を加熱する単一のインライン流体ヒータである。機器のこの作品の熱発生要素は、対流熱伝達を経由して流体を通過させると熱交換するように設計されているので、流れが存在しない場合は、交換機が過熱し、修復不可能なシステムを損傷する恐れがあります。なお、ヒータ流が開始された後にのみオンになっていることが不可欠である。
成人の心筋細胞の収縮装置を分析する他の方法は、以前に、原子間力顕微鏡を用いて30〜32洗練された方法を含む、記載されている。これらの方法のいくつかは、誘導多能性幹細胞由来のCMのような明確に定義されたサルコメアシステムなしで不規則な形状の細胞または細胞の測定のためにそれらをより適してい局所的収縮力とヤング率などの特性のより洗練された測定を可能にする。これらの技術は、同じように簡単に分離され、成人、CMSで使用することができます。 MMSYSシステムの利点は、収縮性および明確に定義されたサルコメアを有する細胞で短時間に多数のセルを測定する能力を測定することが比較的容易である。さらに、セルの長さや筋節間の長さを測定することができ、ソフトエッジとサルコメア分析システムは、それぞれ二つの異なる（ただし、Rを可能に高揚）メソッド収縮性を測定する。先進的な、ユーザーフレンドリーな解析ソフトウェアと組み合わせたデータ収集ソフトウェアは、習得して使用するには、このシステムが容易になります。最後に、同時にカルシウム動態を測定する能力は、収縮性および原子間力顕微鏡では不可能であるカルシウム恒常性との相関関係を可能にする。データ出力は、カルシウム - 活性化染料（たFura2-AM）のレシオメトリック測定値であるため、また、正確なキャリブレーションにより、内部カルシウム濃度の絶対尺度を収集することができる。
成人の心筋細胞からのイオンチャネル信号の成功した記録は、細胞が最適な状態であることが必要である。すぐにそれらが付着しておらず、溶液中に浮遊する細胞の単離およびめっきの後、この段階で、それらを研究することができない。数時間以内に、彼らは、コーティングされたカバーグラスに付着し、それは彼らが研究され得ることを、この時点である。我々の経験では数時間以内にパッチを適用するめっきは、最適な結果が得悪影響が長すぎる待っているように、細胞に影響を与えます。ギガオームのシールを確立し、細胞に侵入後の静止膜電位、ならびにそれ自体は、細胞がパッチ適用時にどのように反映する健康な二つのパラメータであるギガオームのシールを確立する能力を試験することは、上述したように。それが収縮していない細胞にパッチを適用する方が簡単ですが、これは必須条件ではありません。十分なシールは、同様の細胞を破っに得ることができる。この時点で使用されるプロトコルは、パッチクランプ研究の目的に依存し、電流クランプ技術を使用して、自発的または誘導性活動電位を記録することができる。代替的に、電圧クランプは、特定のイオンチャネルを研究するために使用することができる。膜内のチャネルのそろいを考えると、そのような記録は、通常、イオンチャネルブロッカーの存在下で行われる。テトロドトキシン（TTX）、ニソルジピン、およびセシウムは、しばしばalthou、それぞれナトリウム、カルシウム及びカリウムチャネルを遮断するために使用されるGH薬の様々な使用されており、それらの使用の詳細は広く公開されている。ほとんどのアプローチは、いずれかのイオンチャネル遮断薬の適用前と後の電流を記録した電流を減算し、及び/又は記録前に適切なブロッカー背景チャネルを遮断することを含む。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
| D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
| Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
| Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
| Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Tissue forceps, 5.5", 1x2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Forceps 5" Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Micro Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
References
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