Summary
Здесь мы опишем изоляцию взрослых cardiomyoctyes мыши, используя систему перфузии Лангендорфа. Полученные в результате клетки Ca2 +-терпимым, электрически покоя и можно культивировать и трансфицировали адено-или лентивирусов манипулировать экспрессии генов. Их функциональность также могут быть проанализированы с помощью системы MMSYS и методы патч зажим.
Abstract
Использование первичных кардиомиоцитов (CMS) в культуре дала мощный дополнением к мышиных моделях болезни сердца в продвижении нашего понимания болезни сердца. В частности, способность к обучению ионный гомеостаз, функции ионного канала, сотовой возбудимость и возбуждение-сжатия сцепление и их изменения в болезненных состояниях и болезнетворных мутаций привели к значительным проникновения в сердечных заболеваний. Кроме того, отсутствие адекватной иммортализированной клеточной линии имитировать взрослых CMS, а также ограничения новорожденных КМ (который лишены многих структурной и функциональной биомеханики характеристикой взрослого КМ) в культуре препятствовали наше понимание сложного взаимодействия между сигнальными путями, ионные каналы и сократительные свойства во взрослом сердце укрепление важность изучения взрослых изолированных кардиомиоцитов. Здесь мы представляем методы выделения, культивирования, манипуляции экспрессии генов с помощью аденовирусной-ExpreSSED белки и последующее функциональный анализ кардиомиоцитов из взрослой мыши. Использование этих методов будет способствовать развитию механистической понимание путей, которые регулируют клеточную возбудимость, Ca 2 + динамику и сократимость сигнализации и обеспечивают гораздо более физиологически соответствующие характеристики сердечно-сосудистых заболеваний.
Introduction
Мышиные модели сердечно-сосудистых заболеваний послужили эффективных инструментов для выяснения механизмы, фундаментальной болезни 1,2, а также для идентификации потенциальные терапевтические цели 1,3. В частности, использование обеих мышиных моделей приобретенных пороков сердца (например, давления-перегрузки) 4,5 и трансгенные модели мыши продвинулись наше понимание болезни сердца 6-8. Использование методов культивирования клеток для изучения сигнальных каскадов 3,9,10 и изменения в отдельных белков, которые лежат в основе клеточного возбудимость и возбуждение-сжатия муфту в центре 11-13 на уровне одной клетки дополнили в естественных условиях модели мыши. Тем не менее, отсутствие адекватных клеточных линий, которые отражают структуру взрослых CM и функции значительное ограничение. Исследователи стремились преодолеть эту проблему путем изучения отдельных белков, таких как ионные каналы, в гетерологичных экспрессирующих системах
Первичные новорожденных крыс желудочковая кардиомиоциты (NRVMs) сравнительно легко культуры, могут быть инфицированы аденовирусы и лентивирусы манипулировать экспрессии генов 15,й поэтому были успешно 1 используется, но имеют ограничения своих собственных. Хотя они обеспечивают физиологическую микросреду 1 и были рабочей лошадкой области сигнализации, существенные различия между морфологии и внутриклеточной организации NRVMs и взрослых cardiomyoctyes сделать их неадекватной модели для исследования ионных потоков и возбуждение-сжатия связи в взрослом сердце . В частности NRVMs хватает окончательного т-трубчатые подсистему 4. С Са 2 + поток и динамика критически зависят от зрелой т-трубчатых и саркоплазматического ретикулума (СР) структуры 6, Ca 2 + динамики и функциональных исследований сократительной способности сердечной мышцы в NRVMs не являются точным отражением этих критических процессов у взрослых кардиомиоцитов. Кроме того, некоторые компоненты сигнальных путей различаются новорожденных и взрослых мышей 9, тем самым обеспечивая еще одно ограничение для изучения болезненные процессы и их IMPACT на клеточная возбудимость и сократимость в NRVMs. Наконец, распределение сократительной техники приводит к разнонаправленного и неравномерного сокращения клеток, ограничивающего точность измерений сократительной.
Использование изолированных взрослых кардиомиоцитов предоставляет поэтому более точную систему моделирования в пробирке. Внеочередное рост знаний стало возможным благодаря генетической манипуляции мышей подчеркивает значимость получения функциональных изолированных кардиомиоцитов мышей. На самом деле, характеристика взрослых КМ, выделенных из мышиных моделях пролил свет на многих биологических и патологических событий. Изолированные КМ от трансгенных мышиных моделях позволили для изучения прибыли или потери функции белков на сократительных свойств отдельных клеток 2,16, и жизнеспособности в моделях заболеваний, таких как ишемии / реперфузии 17,18, тем самым дополняя информацию, полученную от в VIVO исследованиямышей SE. Использование изолированных взрослых МС из мышиных моделей приобретенных пороков сердца 3,19,20 (например, поперечной сужением аорты, вызванной перегрузкой давлением, который имитирует гипертонией или аортальный стеноз клапана) или осуществления 5,21 (для моделирования физиологической гипертрофии) позволяет на экспертизу взаимодействия сигнальных каскадов, участвующих в этих процессах с сотовой возбудимости и возбуждение-сжатия муфты на уровне одной клетки. Кроме того, способность манипулировать экспрессии генов с помощью генной экспрессии аденовируса приводом во взрослой КМ дает нам возможность анализировать компоненты сложных сигнальных путей.
С электрофизиологических точки зрения, напряжение цельноклеточная и текущие эксперименты зажим на изолированные взрослого КМ были критически в понимании природы ионных потоков в начале исследования и в различных болезненных состояний. Из-за сложной структуры клеточной мембраны и дифференциального защв строительных лесов структур между взрослой КМ и NRVMs или гетерологичными клеточных линий, способность патч взрослые клетки дает гораздо лучшее представление о последствиях определенных мембранных белков, структурных белков и ионных каналов, взаимодействующих партнеров по электрофизиологических компонентов взрослого сердца.
Несмотря на такие выдающиеся преимущества в изучении взрослых мышиных кардиомиоцитов, выделения и культивирования взрослых мышей кардиомиоциты была сложной, призывая необходимость систематического и точного описания методологии выделения жизнеспособных кардиомиоцитов мыши и поддержания их в культуре, чтобы позволить дальнейшее генетические манипуляции с помощью вирусной векторы. Предыдущие исследования использовали либо остро изолированы мышь взрослых см или культивируют крыса взрослых CMS. Последнее легче культуры, чем взрослых мышей КМ, и большинство экспериментов манипулирования экспрессию генов в пробирке использовали крыс взрослых CMS. В нескольких исследованиях успешно изменен и исследованы functiортогональной экспрессии генов в мышь взрослого МС, представляя большое ограничение в объем экспериментов. Таким образом, здесь мы представляем в деталях таких методологий, модифицированные из предыдущих исследований, для изоляции 7,8,22, культуры 3,10,15,23, аденовирусной инфекции 11-13,15 и функционального анализа взрослых мышей желудочковой cardiomyoctyes. Этот протокол изоляция приводит к Ca 2 +-толерантных, возбудимых кардиомиоцитов, что мы успешно культивировали в течение до 72 часов, а трансфицированы аденовирусом. Функциональность этих изолированных клеток можно оценить с помощью системы визуализации MMSYS 14,24 и патч зажим, который также будет обсуждаться.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Кардиомиоцитов изоляции
Материалы (рис. 1)
Microdissecting щипцы
Хирургический пинцет
Нежные гемостаза щипцы
Кровоостанавливающие щипцы
Microdissecting, зубчатые, изогнутые щипцы
Операционные ножницы, прямые
Операционные ножницы, изогнутые
15 мл Сокол труб (5)
60 мм чашки Петри
Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS)
Сетки нейлона - размер пор 400 мкм
Малый воронки
Воск покрытием, плетеный шелк 4-0, 19 мм, 7-10 см длиной
Номера для подкожных инъекций, тупой конец, 24 G или коммерческой животное вскармливания иглы (24 х 1 в, W/1-1/4)
Гепарин натрия
Кетамин / ксилазина смесь
Пастера Пипетки
OptiVision Пройдя очки
Система IonOptix MMSYS
Примечание: Если культивирования клеток, см. раздел 2 на культуре клеток перед началом этого протокола.
Примечание: Все мыши уход вбарьером объект и жертву в соответствии с утвержденными правилами IACUC, практики и процедур.
Примечание: Перед началом процедуры, вся система должна быть предварительно нагрета для того, чтобы все элементы системы Лангендорфа (рис. 2А, рисунок 3) нагревают до 37 ° С для обеспечения надлежащего и полного активности коллагеназы.
- Введите взрослых мышей (~ 12 недель) с 150 USP единицы гепарина натрия в брюшной полости.
- Обезболить с инъекцией кетамина / ксилазина смеси при массовом зависит от дозы (Таблица 1).
- 80:12 мг / кг кетамина: ксилазина рецепт: 2,6 мл кетамина (100 мг / мл) + 0,4 мл ксилазина (100 мг / мл) + 37 мл PBS. Итоговый: кетамин = 6,5 мг / мл; ксилазина = 1 мг / мл
- Закрепите отключке мышь для операционной площадку, вырезать сердце, и поместите в блюдо при комнатной температуре PBS или 0,9% раствором (рис. 1J). Physiologic солевой позволяет нетронутыми сердце сокращаться для лучшего экструзии крови в камере и легкой идентификации аорты перед стадией 1.6. Мыши были проверены, чтобы гарантировать, что они глубоко под наркозом с помощью потери задних конечностей ног пинч рефлекса и замедлением частоты дыхания до начала торакотомии.
- Используйте OptiVision рассекает очки (рис. 1А) для выявления и разоблачения аорту. Удаление ткани вокруг аорты, хотя он облегчить визуализацию судна, не является необходимым для оптимизации выделения клеток, если корня аорты четко виден.
- Prime насос с перфузии буфером (табл. 2). Температура должна оставаться при 37 ° С для продолжительности процедуры с использованием управляемой, циркулирующих на водяной бане (Рисунок 2D).
- Установите сердце на аппарате Лангендорфа (рис. 2А). С помощью двух микро-диссекции (рис. 1D-E), прIME аорту вокруг не-подкожной, тупым концом иглы (24 G) с силиконовой трубки на дальнем чаевых. В качестве альтернативы коммерческим животных вскармливания иглы (24 х 1 в, W/1-1/4) могут быть использованы. Силиконовые трубки на иглу 24 G или кормов для животных иглы позволит обеспечить шва над канавкой. Поместите аорты на иглу, как носок. (Рис. 2в).
- Примечание: Важно быть уверенным, что конец иглы упирается в восходящей аорты, в идеале в корень аорты дистальнее правой безымянной, но оно не распространяется через аортальный клапан в левый желудочек, так как это повлечет за собой серьезное ограничить способность буферов эффективно заливать через сердце через коронарные артерии.
- Безопасность сердца, чтобы иглы, связывая небольшой длины сшивающего шелка (7-10 см длиной) (рис. 1k) вокруг верхней части аорты, обеспечивая, что связь находится на уровне восходящей аорты, ниже правой подвздошной артерийу, но выше конца иглы.
- Опустить сердце внутрь конического стекла (рис. 2В), чтобы помочь поддерживать подходящую температуру окружающей среды.
- Заливать сердце перфузии буфера в течение 5 мин со скоростью 1 мл / мин и зажим отток стекло камеры, чтобы позволить Перфузат собрать в конической стекла и конверт сердце. Схема для переваривания сердце показано на рисунке 3.
- В этот момент вы должны увидеть объем увеличения сердца. Кроме того, кровь в ткани сердца будет заменен перфузата, в результате чего ткани бледность.
- Отпустите отток зажим для слива перфузата. Выключить насос для перемещения труб из буферного контейнера перфузии в буферную емкость фермента (рис. 2Е). Вновь включить насос, чтобы начать заливать сердце с ферментом буфера (табл. 2) со скоростью 1 мл / мин. Зажмите отток снова, чтобы буфер фермент конвертсердце.
- Здесь, как и фермент перфузии сердце и переваривания соединительной ткани, сердце станет бледнее и структурная целостность будет уменьшаться.
- Чтобы определить, когда, чтобы сократить желудочки от переваренной сердце, поднимите сердце из конической стекла, слегка сжать сердце щипцами и собирать несколько капель перфузата в небольшом чашку Петри и проверить, действительно ли отдельные клетки падают .
- Для новичка это полезно для подключения перфузии линию с помощью манометра. Когда сердце становится переваривается давление будет быстро снижаться, так как соединительная ткань не имеет сопротивление. Манометр также полезно для начинающих, чтобы обеспечить, что положение иглы выше аортального клапана, а не в желудочке. Низкое давление будет указано, что игла находится в камеры желудочка и высокого давления показал, что игла коснется клапан.
- Вырезать желудочки от сердца в блюдополный перевод буфера (А) (табл. 2), когда желудочка давление начинает резко падать или, когда вы находитесь в состоянии видеть отдельные клетки в перфузата. Это обычно занимает ~ 7-10 мин.
- Опять с помощью микро-диссекции (рис. 1С), пропустить через мясорубку желудочки на мелкие кусочки, чтобы отделить. Успешный пищеварение не оставит почти никаких твердых кусков ткани после мясорубки, причем большинство из ткани становится аморфным при диссоциации.
- Для дальнейшего отделить ткани, пипетки раствор в / с использованием пластиковой пипетки Пастера (рис. 4), из которого кончик был сокращен под углом ~ 45 °. Эта модификация служит для увеличения внутреннего пространства диаметральное наконечник пипетки таким образом уменьшая количество напряжения сдвига на клетках как ткань растирают.
- Перед рассмотрением ткани пинцетом можно выделить отдельные камеры и отдельно отделить предсердий, левого желудочка или Рогт желудочковая клетки.
- Закрепите квадрат сетки (рис. 1M) в небольшой воронке (рис. 1 л) с помощью зажимов и поместите эту фильтрации аппарат в 15 мл трубки Сокол (рис. 1и).
- Используйте модифицированный пипетки Пастера Для удаления раствора клеток от блюда и фильтрации раствора в трубки Сокол.
- Разрешить живые клетки оседают на дне пробирки (в живом оседания клеток следует принимать 2-4 мин).
- Аликвоты 2,5 мл каждого из четырех растворов кальция (табл. 3) в 4 отдельных 15 мл пробирки Фалкон.
- Опять же, используя стандартный пипетки Пастера, осторожно удалить осадок клеток из нижней части трубы и передачи клеткам первый из растворов кальция.
- Разрешить клетки оседают на дне пробирки и повторить шаг 1,17 в последующих решений кальция, пока клетки не находятся в последнем растворе.
- Не позволяйте клетки поселиться в FourtРешение ч кальция. Закройте пробирку крышкой и поверните его на бок.
2. Культура клеток
- Перед изоляции, пластина 1 мкг / мл природный мышь ламинин на покровные стекла и инкубировать в течение по крайней мере 1 час при 37 ° С и 2% CO 2. Также позволит вашему покрытие и культура СМИ (табл. 4), чтобы нагреть в инкубаторе при температуре 37 ° С и 2% СО 2. Это позволяет растворенного CO 2 в средствах массовой информации, чтобы уравновесить.
- Не снимайте верхнюю из средств массовой информации. Просто ослабьте верхнюю, чтобы избежать загрязнения.
- Разрешить изолированные клетки для осаждения в нижней части трубки сокола.
- Удаление осадка с использованием стандартного пластиковой пипетки Пастера и ресуспендируют в соответствующем количестве покрытие носитель.
- Пластина клеток на ламинин покрытием покровные в соответствующем тарелка и инкубировать в 37 ° С и 2% СО 2 в течение по крайней мере 30-60 мин, чтобы позволить клеткам прилипать к покровные.
- ** Если трансфекции с аденовируса, разбавленной вирус в соответствующем количестве обшивки сред и заменить носитель металлизации в чашке с содержащей вирус массовой информации. Пусть вирус инкубировать на клетках в течение 2 часов в 37 ° С и 2% CO 2. **
- Снимите обшивки носитель из тарелки и заменить питательных сред.
- Тщательно изменить питательных сред каждый день, чтобы не беспокоить клеток на покровные.
С помощью этой процедуры клетки были успешно культивировали в течение до 72 часов. Изображения культивируемых и GFP трансфицированные клетки могут быть найдены на рисунке 5.
3. MMSYS система
- Питание системы MMSYS обеспечение того, чтобы дуговая лампа инициируется в первую очередь.
- Подключите трубки от насоса к соответствующему выходе и входе камеры MMSYS (рис. 6).
- Prime система с буфером кальция (B) (табл. 2).
- Поставьте проверopriately размера стекло покровное в камеру и закрепите (рис. 6е). Большинство MMSYS камеры использовать либо 22 мм или 25 мм квадратных покровные. Обратитесь к инструкции по эксплуатации MMSYS для определения соответствующего покровное для вашего камере.
- Передача 500 мкл клеточной раствора до небольшого пробирку Эппендорфа.
- Добавить 0,5 мкл fura2-AM (исходный раствор из 1 мкг / мкл) в трубочку клеток и дать им возможность инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 5-7 мин. Это позволяет fura2-AM к "нагрузке" в клетки за счет быстрого пассивной диффузии через клеточную мембрану.
- Пусть Fura-2 нагруженные клетки осаждения на дне пробирки, и мыть избыток Fura с 500 мкл буфера B. кальция
- Выключите свет в комнате.
- Используя стандартный пипетки Пастера, падение 1-2 капли (в зависимости от концентрации клеток) на "загруженного" клеток раствора в центре камеры (рис. 6C) и позволяют клеткам Tо оседают на покровное течение 5 мин.
- Плотность клеток в камере должна быть такой, что отдельные неперекрывающихся клетки можно легко просматривать на платформе сбора данных MMSYS.
- Осторожно начинают течь буфер кальция (B) через камеру.
- Увеличьте температуру в камере до 37 ° C.
- ВАЖНО: Не включайте нагревательного устройства, пока не была начата поток. Это может серьезно повредить обратной thermocoupler (Рисунок 6а).
- Убедитесь, что камера подключена к MyoPacer через соединительных проводов (рис. 6, б) и начать ходить по клеткам 5 Гц в 1,5 раза шагание порогового для клеток.
- Выберите ячейку, бьется с правильной частотой и переместить его в обрамление проема.
- Регулировка размеры апертуры камеры и обрамление, так что весь ячейка находится в центре окна, направлены горизонтально, с точкой доступа саркомерыродитель.
- Для длины ячейки отрегулировать красный и зеленый (справа и слева) показатели фотодиод к краю клетки. Настройте контрастность оптимизировать черный / белый контраст на краях клетки. Обратитесь к руководству Ionoptix для уточнения деталей.
- Поместите коробку в районе ячейке, содержащей четкие саркомеры и настроить фокус, чтобы оптимизировать пик спектра мощности (красный). Также отрегулировать яркость микроскопом оптимизировать синее окно сглаживания и черный информацию контрастности.
- Отрегулируйте зеленые пороговые баров захватить как можно больше спектра красный Мощность (пиковая) и как мало фоне, как это возможно.
- Начните запись.
- После был записан достаточно данных, нажмите «Пауза», чтобы временно остановить запись и, убедившись, что ни в центре внимания, ни размеры окна просмотра меняются, двигаться этап микроскопа к области покровного стекла, в котором ни одна ячейка или клеточный материал не может быть видел. ЛенGTH записи варьируется в зависимости от экспериментального протокола следователя.
- Примечание: При нажатии "Стоп" будет прервать запись и фон не смогут быть записаны для этой ячейки.
- Нажмите кнопку "Продолжить", чтобы записать измерение фона.
- После достаточно фон был записан нажмите "Стоп", чтобы прервать запись.
- Нажмите "File >> Save", чтобы сохранить все следы для этой ячейки в одном. Файл ЗПТ.
- Повторите шаги 3,12 - 3,20 до достаточное количество клеток не зафиксировано.
- Обратитесь к руководству пользователя IonOptix-MMSYS 12 Инструкции по анализу записанных данных. Характерные записанные данные кардиомиоцитов дикого типа показаны в на рисунке 7.
4. Патч зажим
Patch зажима из различных типов клеток были хорошо описаны ранее в этом журнале 25-28. Поэтому мы сосредоточены на какой-то критикаль параметры для успешного фиксации потенциала взрослых кардиомиоцитов выделяют, используя описанный наш протокол.
- С помощью пипетки съемник и боросиликатного стекла (с нити: OD 1,5 мм, ID 0,86 мм - 10 см длина) тянуть пипетки, которая демонстрирует ~ 2,0-3,0 МОм при заполнении пипетки раствора (табл. 5).
- Противопожарные польский пипетки осторожно, используя Narishige или другое вертикальное пожарной полировщик. Сопротивление патч пипетки должно быть 2-4 MO после пожара полировки.
- Включите компьютер, усилитель (Axopatch 200B), АЦП (Digidata 1440A, Axon Instruments) и Микроманипулятор (MP-285). Для целой клетки фиксации потенциала, мы начинаем со стандартными параметрами, как описано выше.
- Для культивируют взрослого КМ, удалить их из инкубатора и аккуратно мыть покровное на которой КМ высевают с PBS при комнатной температуре.
- Аккуратно снимите покровное и поместить его в перфузии камеры на инвертированный микроскоп (Nikon TE 2000).
- Убедитесь, что входное отверстие для системы перфузии и выходе (для всасывания) только над поверхностью покровного стекла.
- Начните перфузии с соответствующим внеклеточного раствора (табл. 5).
- Для недавно в отрыве взрослого КМ, разместить коллагена покрытием покровное в системе перфузии, как указано выше.
- Поскольку клетки будут находиться в растворе, аккуратно заменить раствор с внеклеточной буфера.
- Используя модифицированный пипетки Пастера (рис. 4), мягко ресуспендирования клеток во внеклеточной буфера, принять аликвоты и поместить его на покровное.
- Пусть клетки приложить на 10-15 мин перед началом перфузии как в 4.4.
- Back-заполнить весь клеток патч пипетки с внутриклеточной буфера с помощью Microfil (инструменты Всемирного Precision, 28 G) иглы. Убедитесь, что нет никаких пузырьков воздуха в кончике пипетки; слегка постучите, чтобы пузырьки воздуха всплывать на SurfACE раствора.
- Прикрепите заполненную патч пипетки пипетки держателя, гарантируя, что есть контакт между микроэлектродом и внутреннего решения.
- Мы используем хлорид серебра электродов, но заботиться о "хлорирующим" серебряные провода, по крайней мере один раз в неделю, погружая на ночь в бытовой отбеливатель.
- Осторожно опустите пипетки в ванну, гарантируя, что ванна электрод погружен во все времена в ванной / внеклеточного раствора. Смещение любые электрохимических потенциалов в это время. Большие распределительные потенциалы могут быть признаком ухудшения хлорида серебра на электродах.
- Здоровый цилиндрическая взрослых МС идентифицированы в микроскоп и в центре поля зрения. Как описано выше, сочетание перемещении микроманипулятор и регулировки фокуса позволяет непосредственной близости от патч-пипетки и поверхностью КМ.
- Как только они находятся в той же фокальной плоскости, мы используем комбинацию визуальныхзация клетки и тестового импульса (доступной в Axopatch 200B).
- После того, как сопротивление пипетки уменьшает в два раза (предполагая, что пипетка находится в контакте с поверхностью клетки), и клетка продолжает искать цилиндрические, мы устанавливаем гигаом печать с использованием нежное всасывание.
- Для МС, мы предпочитаем всасывания рот установить отрицательное давление. Если gigaseal успешно получены, мы снова нежный ритмическую всасывания рот, чтобы "Break-In" в клетку, чтобы установить весь режим клеток патч.
- Типичные потенциалы отдыхая здорового КМ в порядке -85 до -90 мВ. После того, как gigaseal получается, измерить мембранный потенциал покоя с помощью токовых клещей с I = 0 Па.
- Если мембранный потенциал покоя деполяризуется это может указывать на поврежденный элемент или плохой печать.
- Поскольку КМ являются крупные клетки с большим количеством площади поверхности, особое внимание должно быть уделено емкости компенсации, особенно сокурица быстро активации токи, такие как натриевый канал должен быть изучен. Если адекватная компенсация емкость не может быть получена с помощью встроенного в установками компенсации на генератор импульсов, предымпульсов на суб-пороговым напряжением и противоположной полярности могут должны применяться, и результирующий ток вычитается из записанного сигнала. Такой протокол легко программируется в Axopatch.
- После того, как вся Режим клеток патч был создан, ждать 15 минут, чтобы обеспечить равновесия и обеспечение стабильности печатью до начала напряжения или тока протоколов зажима. Мы используем стандартные протоколы, которые были описаны ранее в этом и других журналах, а не будут подробно раскрыты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Изоляция взрослых cardiomyoctyes результатов в палочковидных, поперечно-полосатых и покоя (не спонтанно избиение) клеток (рис. 5А). Мертвые клетки будет выглядеть округлые и нет страты не будет присутствовать. Покоя клетки можно культивировать и трансфицировали аденовируса манипулировать экспрессии генов (фиг. 5b и 5с). После 24 ч культуры, морфология живых клеток не меняется, они все еще Ca 2 +-толерантный, и они могут быть темп по полю стимуляции. С предлагаемой процедуры, выход 80-90% жизнеспособных клеток может быть достигнуто.
Для измерения сократительной клетки, системное программное обеспечение MMSYS принимает фазовую информацию от микроскопа, чтобы сообщить либо изменений в саркомера или длины клеток. Показанный в (рис. 7а) является представителем сократимость след через длины саркомера измерения дикого типа C57BL6 мыши. Для здоровых миоцитов взрослых мышей отмыши как таковые, длины базовой линии саркомера составляет ~ 1,7-1,9 мкм. Программное обеспечение системы MMSYS способен одновременно измерять сократимость и обработку кальция путем измерения соотношения привязаны к несвязанных форм красителя fura2-AM кальция-активирован. Хотя меры отношение может отличаться между установками, для здоровых клеток, соотношение обычно составляет от 1,5-2,5 (фиг.7В). Если система MMSYS был откалиброван для кальция, то это соотношение может быть переведен в абсолютной мере внутриклеточной концентрации кальция. Для того чтобы проанализировать данные, которые генерируются из сократимость и кальция следов, следы должны быть усреднены для создания характерный след на этой ячейке (рис. 7С и 7D). Эти характерные следы затем подвергаются алгоритма анализа данных monotransient из системного программного обеспечения, которое MMSYS затем генерирует параметры систолической и диастолической функции. Дальнейшие подробности представлены в ионномOptiX руководство.
Кардиомиоциты взрослой мыши также подвергались целые экспериментах с клеточными патч зажим, в котором Потенциал действия, записанных в текущем режиме зажим (рис. 8).
| Масса (г) | Кетамин / ксилазин (мл) |
| 15 | 0.18 |
| 20 | 0.25 |
| 25 | 0.31 |
| 30 | 0.37 |
| 35 | 0.43 |
| 40 | 0,49 |
| 45 | 0.55 |
| 50 | 0.62 |
Таблица 1. Взрослый мышь Вес зависит от Кетамин / Ксилазин Дозировка (80:12).
| Решение | Рецепт |
| Тироде буфера * (РН 7,4) | 1 л DDH 2 O 137 мМ NaCl 4 мМ KCl 1 мМ MgCl 10 мМ HEPES 0,33 мМ NaH 2 PO 4 |
| Перфузии буфера * (РН 7,4) | 500 мл Тироде буфера 10 мМ D-(+)-глюкозы, минимальное 5 мМ Таурин 10 мМ бутандион Monoxime (BDM) |
| Фермент буфера * | 50 мл перфузии буфера 0,024 г коллагеназы D (тип IV) 0,018 г коллагеназы В (тип II) 0,003 г протеазы XIV от Streptomyces пзеиз |
| Передача буфера (A) | 45 мл перфузии буфера 5 мл бычьего сывороточного альбумина (от 5 мг / мл маточного раствора) |
| Кальций буфера (B) | 1 л Тироде буфера 1,2 ммоль CaCl 5,5 мМ D-(+)-глюкозы, минимальное |
Таблица 2. Взрослый кардиомиоцитов изоляции буфера Рецепты.
| [CaCl] | Передача буфера (A) | Кальций буфера (B) |
| 0,06 мм Са 2 + | 9,5 мл | 0,5 мл |
| 0,24 мМ Са 2 + | 8,0 мл | 2,0 мл |
| 0,60 мм Са 2 + | 5,0 мл | 5,0 мл |
| 1.20 мМ Са 2 + | 0 мл | 10 мл |
Таблица 3.Calcium титрования Решение Рецепты.
| Покрытие Средний | Культура Средний |
|
|
Таблица 4. Покрытие и культура СМИ Рецепты.
| Добавление раствора | Ванна Решение |
|
|
Таблица 5. Патч зажим Solutions (решения приведены для измерения токов натрия).
Рисунок 1. .. Взрослых кардиомиоцитов изоляции инструменты) OptiVisor оптического стекла бинокулярное лупа B) Пинцет хирургический, 5.5 в, 1x2 зубы -. Roboz Научно C) Молони щипцов - 4,5 в (11,5 см) в длину небольшим изгибом, зубчатые -. Roboz Научно DE) Дюмон # 3 Пинцет, Dumostar, размер чаевых 0,17 х 0,10 мм. F) Пакер Mosquito Пинцет 5 в прямой плоским -. Roboz Научные G) Micro рассекает ножницы 4,5 в Изогнутые Sharp / Sharp -. Roboz Научно Н) Micro рассекает ножницы 3.5 в прямой Sharp / Sharp 20 мм -. Roboz Научно Я) 15 мл трубки сокола - Thermo -Fisher Scientific J) 60 мм чашку Петри, содержащую PBS K) Softsilk: Воск покрытием плетеный шелк, 19 мм - Covidien L) Пластиковые воронки, 6,0 см в диаметре М) нейлон сетки - 400 мкм размер пор.....
Рисунок 2. Langendorff Аппарат.) Вся система перфузии Langendorff используется для изоляции кардиомиоцитов взрослого. B) увеличенный вид полого, конической сбора стекла воронку, используемой для обогрева канюлированной сердце. C) увеличенное изображение без подкожной катетеризации иглы. (Многоразовый Feedinг Иглы (24 G, прямой, круглый наконечник, длиной 25 мм; Изысканные Наука Инструменты Инк Пункт 18061-24). D) Циркуляционный водяной бане Е) Водяная баня для инкубации перфузии, ферментов и передачи буферов.
Рисунок 3. Подробную схему системы перфузии.
Рисунок 4. Изменения пипетки Пастера. Пипетки была изменена за счет сокращения наконечника на примерно под углом 45 °. Это дает возможность большей площади поверхности и создает меньшую нагрузку на сдвиг на клетки по мере их диссоциированной. На вставке показана более близкое представление модифицированного чаевых.
Рисунок 5. Искусственный и GFP трансфецировали кардиомиоциты.) Свежая изолированный ред взрослых кардиомиоцитов от C57BL6 мыши 12 недель. Стрелки указывают на мертвых или умирающих клеток. Эти клетки являются более округлые, чем здоровой, в форме стержня взрослого КМ. Б) GFP-трансфецировали cardiomyoctyes взрослых мышей после 24 часов культуры. C) Искусственный кардиомиоциты взрослых мышей после 24 часов. На врезке показано повышенное увеличение культивируемых миоцитов.
Рисунок 6. . Система MMSYS камерные Синие стрелки показывают поток буфера перфузии (буфер В)) Одноместный, рядный решение обогреватель -... Warner Instrument Corporation B) Соединительные провода от системной камеры MMSYS к MyoPacer поля стимулятора C) Платина электроды для поля стимуляции находится в центре камеры. D) Отток водохранилище. Е) палата зажимы в открытом положении.
Рисунок 7. Системные данные Представительства MMSYS записаны для дикого типа C57BL6 мышей, полученных от Jackson Labs. А) MMSYS база сократимости следы. B) Соотношение Са 2 + с привязкой к Ca 2 +-несвязанный fura2-АМ записал для генерации следы база кальция. Эти следы соответствуют измерениям сократительной в А). C) Среднемесячная базовая сократимости следы составленные системного программного обеспечения MMSYS в характерную сократимости следа. D) Характеристика следов кальция составлен на основе базовых следов в B). Анализ составных следов позволит исследователю создавать суррогатные параметры для систолического и диастолического функции. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 8. Патч зажим след, показывающий потенциал действия дикого типа взрослых мышей кардиомиоцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом докладе, мы описали методов, необходимых для успешного выделения и культуры взрослого КМ от сердца мыши. Наша методика позволяет последующим изучением функции см и возбудимости использованием способов, описанных выше. Критическим параметром для изучения функциональности взрослого КМ является здоровье и качество изолированной КМ. Как описано выше, наши методы позволяют с высоким выходом функциональных клеток, которые поддаются манипуляции экспрессии генов с помощью аденовирусных / лентивирусные инфекции в культуре и анализ клеточная возбудимость и сократительную функцию.
Одним из наиболее важных параметров для выделения функциональный взрослых мышей МС точное и быстрое катетеризации сердца на не-иглы для подкожных инъекций. Необходимо обеспечить, чтобы аорта прикреплен к левого желудочка рассечена в достаточной длины, чтобы обеспечить более легкое и более быстрого катетеризации сердца. Когда cannulating тон сердце, важно также, чтобы кончик иглы остается в восходящей аорте и не выходит за аортального клапана в левый желудочек, чтобы обеспечить эффективное перфузии ткани через коронарных артерий. Следующий важный шаг является обеспечение аорту к стеблю иглы с помощью шелковой нити. Шов должен быть привязан на восходящей аорты, так что буфер перфузии потоков ретроградно в коронарные артерии и полости левого желудочка, но не течет antegradely наружу через дистальный конец рассеченной аорты или крупных сосудов.
Некоторые исследователи считают полезным установить манометр для оценки качества катетеризации и последующей перфузии фермента. При использовании манометр, начальное давление левого желудочка должна быть ~ 80 - 100 КМЗ 2 O, и после перфузии с ферментом, давление снизится до ~ 40-50 CMH 2 O. Когда желудочка давление достигает этой точки, тоскорее всего готов к быть вырезаны из иглы. Чтобы убедиться, что желудочки хорошо усваивается, несколько капель проточной могут быть собраны из под сердцем в чашку Петри и проверяется на любые живые, покоящиеся клетки присутствуют.
Полученные изолированные клетки из этой процедуры хорошо поддаются иммуноцитохимии. Они могут быть зафиксированы с помощью регулярных методов крепления 29 (то есть формалина, параформальдегид, ледяной метанола или ацетона), но более высокий уровень проницаемости, чем обычно используется для новорожденных cardiomyoctyes иногда необходимо, чтобы изображения цитозольными белков или белковых структур (т.е. альфа- саркомера актина, бета миозина). Наконец, клетки могут быть культивированы и затем инфицировали адено-или лентивирусов манипулировать экспрессии гена, или используется для функциональных анализов сократительного аппарата сотовой.
Культура взрослых мышей МС уже давно описаны каксложной задачей. Используя методы, описанные здесь, мы можем регулярно культуры этих клеток на срок до 72 часов, хотя выход функциональных клеток заметно уменьшается после 36 часов. При культивировании клеток, крайне важно, чтобы клетки быть покрыты при 37 ° С в 2% CO 2. Это отличается от новорожденных CMS, которые предпочитают быть культивировали при 10% CO 2 в течение первых 24 часов, а затем переключился на 5% CO 2, или неонатальных сердечных фибробластов, которые также предпочитают 5% СО 2. Покрытие и культуральные среды может быть уравновешена, так что растворенный CO 2 составляет 2%.
Клетки высевали на ламинина покрытием покровные так, что они не отрываться стекла, когда носитель будет изменен. Тем не менее, кардиомиоциты не придают очень надежно к стеклу даже с ламинином покрытия. Поэтому очень важно, что осторожность соблюдать осторожность при изменении питательных сред, используя стерильные пипетки, а не система вакуумной аспирации. Как только клеткас высевают, они могут быть трансфицировали аденовируса путем инкубации вирус не более чем 2 часов. Сроки зависит от титра вируса и белка, являющегося сверхэкспрессируется, поэтому мы рекомендуем проведение предварительных экспериментов для определения LD 50 и ED 50 для вируса. В большинстве случаев мы используем МВД 20-100 для аденовируса. Как только клетки были инкубированы с вирусом, выражение гена-мишени (ы) обычно занимает ~ 24-36 часов.
Изолированные клетки, которые высевают на покровные стекла подходящего размера для системы камеры MMSYS также могут быть проанализированы для сократимости и обработки кальция с использованием системы формирования изображения MMSYS. Эти покровные может быть помещено в камеру, и культуральную среду могут быть удалены путем включения системы перфузии. Если клетки не быть культивированы и используются для анализа непосредственно после выделения, они могут быть добавлены непосредственно в камере сразу покровное был помещен. В то время какэто не необходимо предварительное покрытие покровные с ламинином при анализе недавно выделенные клетки, по нашему опыту, ламинин действительно помогает клетки лучше придерживаться покровного стекла. Использование медленную скорость потока для блока MMSYS дополнительно гарантирует, что клетки остаются прикреплены к покровным. Наконец, оптика микроскопа, в частности объектива должны неукоснительно очищены перед каждым экспериментом, для обеспечения точного визуализации саркомеров, необходимых для оценки сократительной.
Наиболее важным компонентом системы MMSYS является единственным нагреватель жидкости в линию, которая нагревает буфер перфузии (В), как она течет в камеру. Термодженик элементом этой части оборудования предназначен для теплообмена с прохождением жидкости через конвективного теплообмена, поэтому если поток отсутствует, обменник перегреется и может непоправимо повредить систему. Поэтому крайне важно, что нагреватель включен только после того, поток инициируется.
Другие методы анализа сократительного аппарата кардиомиоцитов взрослых были ранее описаны, в том числе с использованием сложных методов атомно-силовой микроскопии 30-32. Некоторые из этих методов позволит более сложные измерения локализованного сократительной способности и свойств, таких как модуль Юнга, что делает их более подходит для измерения неправильной формы клеток или клеток без четко определенных саркомера систем, таких как МС, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Эти методы могут быть столь же легко использовать на изолированном взрослого CMS. Преимущество системы MMSYS является относительная легкость измерения сократимость и возможность измерения большое количество клеток в течение короткого периода времени в клетках с четко определенными саркомеров. Кроме того, мягкие края и анализа саркомер системы, которые могут измерить длину ячейки или длину между саркомеров соответственно позволяют двух различных (но гОкрыленный) методы измерения сократимость. Программное обеспечение сбора данных в сочетании с передовой, удобного программного обеспечения анализа делает эту систему легко изучать и использовать. Наконец, способность измерять динамику кальция одновременно позволяет корреляции между сократимость и кальциевого гомеостаза, что не представляется возможным с атомно-силовой микроскопии. Кроме того, поскольку выходные данные пропорциональный мера активированных кальцием красителя (fura2-AM), с правильной калибровки, может быть собрана абсолютные показатели внутренних концентрации кальция.
Успешная запись сигналов ионного канала от взрослых кардиомиоцитов требуется клетки быть в оптимальном состоянии. Сразу же после выделения и покрытие клеток они не являются прилипший и будет плавать в растворе; на этой стадии они не могут быть изучены. В течение нескольких часов они будут придерживаться покровным покрытием, и это на данный момент, что они могут быть изучены. По нашему опыту локализационный в течение нескольких часовпокрытие дает оптимальный результат, как ждать слишком долго негативно влияет на клетки. Как описано выше, тестирование мембранный потенциал покоя после установления гигаом печать и нарушая в клетку, а также возможность создать гигаом печать сама два параметра, которые отражают, насколько здоровый клетки во время исправления. Хотя это проще пропатчить на клетки, которые не являются договаривающимися, это не является обязательным условием, адекватные уплотнения можно получить на избиение клеток, а также. Протоколы, используемые в этой точке зависит от целей патч зажима исследования; используя современные методы зажим, самопроизвольные и искусственные потенциалы действия могут быть записаны. С другой стороны, фиксацию напряжения можно использовать для изучения конкретных ионные каналы. Учитывая арсенал каналов в мембране, такие записи, как правило, выполняется в присутствии блокаторы ионных каналов. Тетродотоксин (ТТХ), нисолдипин, и цезий часто используются, чтобы блокировать натрий, кальций и калиевые каналы соответственно, AlthouGH различные лекарства были использованы, и детали их использования были опубликованы широко. Большинство подходов связаны либо записи токов до и после применения блокаторов ионных каналов и вычитания токи, и / или блокирования фоновые каналы с соответствующими блокаторов до записи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
| D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
| Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
| Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
| Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Tissue forceps, 5.5", 1x2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Forceps 5" Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Micro Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
References
- Chlopcikova, S., Psotová, J. Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart. Biomedical Papers. , (2001).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Ballou, L. M., Lin, R. Z. Rapamycin and mTOR kinase inhibitors. J. Chem. Biol. 1, 27-36 (2008).
- Brette, F., Orchard, C. T-Tubule Function in Mammalian Cardiac Myocytes. Circ Res. , (2003).
- Sakata, Y., Hoit, B., Liggett, S., Walsh, R. Decompensation of pressure-overload hypertrophy in G?q-overexpressing mice. Circulation. , (1998).
- Lieu, D. K., et al. Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).
- Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition. J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).
- Muthuchamy, M., et al. Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction. Circ. Res. 85, 47-56 (1999).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).
- Epstein, F., Hunter, J. Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure. New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).
- Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes. Cell Calcium. , (2007).
- Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).
- Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O'Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure. Circ. Res. 78 (2), (1996).
- Splawski, I., et al. Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia. Science. 297, 1333-1336 (2002).
- Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).
- Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition. Science. , (1998).
- Heinzel, F. R., et al. Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice. Circ. Res. 97, 583-586 (2005).
- Li, X., Heinzel, F. R., Boengler, K., Schulz, R., Heusch, G. Role of connexin 43 in ischemic preconditioning does not involve intercellular communication through gap junctions. J. Mol. Cell. Cardiol. 36, 161-163 (2004).
- Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
- Nakamura, A., Rokosh, D. LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).
- Boström, P., et al. A PGC1-?-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis. Nature. 481, 463-468 (2012).
- Liao, R., Jain, M. Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes. Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).
- Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture. J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).
- Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. -S. Methods in Molecular Biology. 689, Humana Press. 205-214 (2010).
- Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269 (2011).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936 (2008).
- Arman, A. C., Sampath, A. P. Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation. J. Vis. Exp. (43), e2107 (2010).
- Wen, H., Brehm, P. Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish. J. Vis. Exp. (45), e2351 (2010).
- Maier, S., Westenbroek, R. An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).
- Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy. Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).
- Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope. European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).
- Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Grütter, P. Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist. Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).
