Summary
Aquí se describe el aislamiento de cardiomyoctyes adultas de ratón utilizando un sistema de perfusión Langendorff. Las células resultantes son de Ca2 +-tolerante, eléctricamente en reposo y pueden ser cultivadas y transfectadas con adeno-o lentivirus para manipular la expresión génica. Su funcionalidad también puede ser analizado usando el sistema de MMSYS y técnicas de patch clamp.
Abstract
El uso de los cardiomiocitos primarios (CM) en la cultura ha proporcionado un poderoso complemento de los modelos murinos de enfermedad cardíaca en el avance de nuestra comprensión de las enfermedades del corazón. En particular, la capacidad para estudiar la homeostasis de iones, la función del canal de iones, la excitabilidad celular y el acoplamiento excitación-contracción y sus alteraciones en condiciones de enfermedad y por mutaciones causantes de enfermedades han conducido a una mejor aproximación a las enfermedades cardíacas. Por otra parte, la falta de una línea celular inmortalizada adecuada para imitar adultos CM, y las limitaciones de los CM neonatal (que carecen de muchas de las biomecánica característica estructural y funcional de los adultos CM) en la cultura han dificultado la comprensión de la compleja interacción entre las vías de señalización, canales iónicos y las propiedades contráctiles del corazón adulto fortalecer la importancia del estudio de cardiomiocitos adultos aislados. A continuación, presentamos los métodos para el aislamiento, cultivo, manipulación de la expresión génica mediante adenovirus-expreproteínas ssed, y posterior análisis funcional de los cardiomiocitos de ratón adulto. El uso de estas técnicas ayudará a desarrollar una visión mecanicista en las vías de señalización que regulan la excitabilidad celular, Ca 2 + dinámica y la contractilidad y ofrecer una caracterización mucho más fisiológicamente relevantes de la enfermedad cardiovascular.
Introduction
Los modelos murinos de enfermedad cardiovascular han servido como herramientas eficaces para la aclaración de los mecanismos fundamentales de la enfermedad 1,2, así como para la identificación de dianas terapéuticas potenciales 1,3. En particular, el uso de ambos modelos murinos de enfermedad cardíaca adquirida (tales como presión de la sobrecarga) 4,5 y modelos de ratones transgénicos han avanzado nuestra comprensión de la enfermedad cardíaca 6-8. El uso de técnicas de cultivo celular para estudiar las cascadas de señalización 3,9,10 y alteraciones en las proteínas individuales que subyacen en la excitabilidad celular y el acoplamiento excitación-contracción en el corazón 11-13 en el nivel de la célula individual han complementado los in vivo en modelos de ratón. Sin embargo, la falta de líneas celulares adecuadas que reflejan la estructura y función CM adultos ha sido una limitación significativa. Los investigadores han intentado superar esta mediante el estudio de proteínas individuales, tales como canales de iones, en sistemas de expresión heterólogos
Cardiomiocitos ventriculares de rata neonatales primarios (NRVMs) son relativamente fáciles de cultivar, pueden ser infectados con adenovirus y lentivirus de manipular la expresión génica 15, unapor lo tanto, ND se han utilizado con éxito 1, pero tienen limitaciones de su propia. A pesar de que proporcionan un microambiente fisiológico 1 y han sido el caballo de batalla del campo de la señalización, las diferencias sustanciales entre la morfología y la organización subcelular de NRVMs y cardiomyoctyes adultos les hacen un modelo inadecuado para la investigación de los flujos iónicos y acoplamiento excitación-contracción en el corazón adulto . Más notablemente NRVMs carecen de un-t tubular subsistema definitiva 4. Desde Ca 2 + flujo y la dinámica son críticamente dependientes madura t-tubular y retículo sarcoplásmico (SR) Estructura 6, Ca 2 + y la dinámica de los estudios funcionales de la contractilidad cardíaca en NRVMs no son un reflejo exacto de estos procesos críticos en cardiomiocitos adultos. Además, algunos componentes de las vías de señalización diferentes entre ratones recién nacidos y adultos 9, proporcionando así otra limitación para el estudio de los procesos de enfermedad y de su impact en la excitabilidad celular y la contractilidad en NRVMs. Finalmente, la distribución de la maquinaria contráctil conduce a multidireccional y no uniforme acortamiento celular limitar la exactitud de las mediciones contráctiles.
El uso de aislados cardiomiocitos adultos ofrece, por tanto, un sistema de modelado más preciso in vitro. El extraordinario crecimiento del conocimiento posible gracias a la manipulación genética de los ratones subraya la importancia de la obtención de cardiomiocitos aislados funcionales de los ratones. De hecho, la caracterización de los CM adultas aisladas de modelos de ratón ha arrojado luz sobre muchos eventos biológicos y patológicos. CM aisladas de modelos de ratones transgénicos han permitido estudios de la ganancia o pérdida de la función de las proteínas en las propiedades contráctiles de las células individuales 2,16, y la viabilidad de modelos de enfermedades, como la isquemia / reperfusión 17,18, complementando así la información obtenida a partir de Estudios in vivo sobre lalos ratones se. El uso de aislados adultos CM de modelos murinos de enfermedad cardiaca adquirida 3,19,20 (como transversal sobrecarga de presión inducida por la constricción aórtica, que imita la hipertensión o estenosis de la válvula aórtica) o el ejercicio 5,21 (para el modelado de la hipertrofia fisiológica) permite un examen de la interacción de las cascadas de señalización implicadas en estos procesos con la excitabilidad celular y el acoplamiento excitación-contracción en el nivel de la célula individual. Además, la capacidad de manipular la expresión génica utilizando la expresión génica adenoviral impulsada en adultos CM nos proporciona la oportunidad de diseccionar los componentes de las vías de señalización complejos.
Desde una perspectiva electrofisiológico, voltaje de células enteras y los experimentos de fijación actuales en aislados adulto CM han sido fundamentales en el esclarecimiento de la naturaleza de los flujos iónicos al inicio del estudio y en varios estados de la enfermedad. Debido a la compleja estructura de la membrana celular y la protección de bi diferencialen las estructuras de andamiaje entre el adulto y los CM NRVMs o líneas celulares heterólogos, la capacidad para reparar las células adultas da una mejor representación de los efectos de ciertas proteínas de membrana, proteínas estructurales, y socios de canales iónicos que interactúan sobre los componentes electrofisiológicas del corazón adulto.
A pesar de estas ventajas importantes en el estudio de adultos cardiomiocitos murinos, aislamiento y cultivo de cardiomiocitos ratones adultos ha sido un reto, instando a la necesidad de una descripción sistemática y precisa de la metodología para aislar cardiomiocitos viables de ratón y de mantenerlas en cultivo para permitir su posterior manipulación genética utilizando viral vectores. Estudios previos han utilizado ya sea de forma aguda aislada de ratón adulto CM o cultivados de rata adulta CM. Estos últimos son más fáciles de cultivar que los CM ratón adulto, y la mayoría de los experimentos de manipulación de la expresión génica in vitro han utilizado ratas adultas CM. Pocos estudios se han alterado con éxito e investigado functila expresión de genes onal en ratón adulto CM, presentando una gran limitación en el alcance de los experimentos. Por lo tanto, aquí presentamos en detalle tales metodologías, modificado a partir de investigaciones anteriores, para el aislamiento 7,8,22, cultura 3,10,15,23, infección adenoviral 11-13,15, y el análisis funcional de cardiomyoctyes ventriculares de ratón adulto. Este protocolo de aislamiento resultados en Ca 2 +, cardiomiocitos excitables tolerantes que tenemos cultivadas con éxito durante un máximo de 72 horas y transitoriamente transfectadas con adenovirus. La funcionalidad de estas células aisladas se puede evaluar utilizando el sistema de imágenes MMSYS 14,24 y de patch clamp, que también será discutido.
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Protocol
1. El aislamiento de los cardiomiocitos
Materiales (figura 1)
Microdissecting fórceps
Fórceps del tejido
Pinzas hemostáticas Delicadas
Pinzas hemostáticas
Microdissecting, dentadas, pinzas curvas
Tijeras de funcionamiento, recto
Tijeras de funcionamiento, curvado
15 ml tubos Falcon (5)
60 mm placa de Petri
Tampón fosfato salino (PBS)
Nylon Mesh - tamaño de poro de 400 micras
Pequeño embudo
Cera recubierto, seda trenzada 4-0, 19 mm, 7-10 cm de largo
Aguja hipodérmica no, extremo romo, 24 G o aguja alimentación de los animales comerciales (24 x 1 in, W/1-1/4)
La heparina de sodio
Mezcla de ketamina / xilazina
Pipetas Pasteur
OptiVision Dissecting Goggles
Sistema IonOptix MMSYS
Nota: Si el cultivo de células, ver sección 2 en cultivo celular antes de iniciar este protocolo.
Nota: Todos los ratones fueron atendidos enuna instalación de barrera y sacrificado de acuerdo con los reglamentos aprobados IACUC, prácticas y procedimientos.
Nota: Antes de comenzar el procedimiento, todo el sistema debe ser precalentado para asegurar que todos los elementos del sistema de Langendorff (Figura 2A, Figura 3) se calientan a 37 ° C para permitir para la actividad adecuada y completa colagenasa.
- Inyectar ratones adultos (~ 12 semanas) con 150 unidades USP de heparina sódica en el espacio abdominal.
- Se anestesia con una inyección de una mezcla de ketamina / xilazina en una dosis dependiente de peso (Tabla 1).
- 80:12 mg / kg de ketamina: xilazina receta: 2,6 ml de ketamina (100 mg / ml) + 0,4 ml de xilazina (100 mg / ml) + 37 ml de PBS. Final: ketamina = 6,5 mg / ml; xilazina = 1 mg / ml
- Asegure el ratón sedado a la plataforma de funcionamiento, cortar el corazón, y colocar en un plato de la temperatura ambiente PBS o solución salina 0,9% (Figura 1J). Physalina siologic permite que el corazón se contraiga intacta para una mejor extrusión de sangre en la cámara y la fácil identificación de la aorta antes de la etapa 1.6. Los ratones fueron evaluados para verificar que están profundamente anestesiados mediante la pérdida de la extremidad trasera toe reflejo del pellizco y disminución de la frecuencia respiratoria antes de la aparición de la toracotomía.
- Utilice OptiVision gafas de disección (Figura 1A) para identificar y exponer la aorta. Extracción del tejido alrededor de la aorta, aunque sí facilitar la visualización del vaso, no es necesario para la optimización de la aislamiento de células si la raíz aórtica es claramente visible.
- Cebado de la bomba con tampón de perfusión (Tabla 2). La temperatura debe mantenerse a 37 ° C para la duración del procedimiento mediante una controlada, baño de agua circulante (Figura 2D).
- Monte el corazón sobre el aparato Langendorff (Figura 2A). El uso de dos pinzas de micro-disección (Figuras 1D-E), prIme la aorta alrededor del, aguja punta roma no hipodérmica (24 G) con tubo de silicona en la punta distal. Alternativamente, una aguja de alimentación de los animales comercial (24 x 1 en, W/1-1/4) se puede utilizar. El tubo de silicona en la aguja 24 G o la aguja de alimentación de los animales permitirá para fijar la sutura a través de la ranura. Coloque la aorta en la aguja como un calcetín. (Figura 2 C).
- Nota: Es importante asegurarse de que el extremo de la aguja se apoya en la aorta ascendente, idealmente en la raíz de la aorta distal al hueso coxal derecho, pero que no se extiende a través de la válvula aórtica en el ventrículo izquierdo, ya que esto será severamente limitar la capacidad de los tampones para perfundir de manera efectiva a través del corazón a través de las arterias coronarias.
- Asegure el corazón a la aguja mediante la vinculación de una pequeña longitud de sutura de seda (7-10 cm de largo) (Figura 1K) alrededor de la parte superior de la aorta, asegurándose de que el lazo está en el nivel de la aorta ascendente, por debajo de la Arter innominada derechaY, pero está por encima del extremo de la aguja.
- Bajar el corazón en el interior de la copa cónica (Figura 2B) para ayudar a mantener una temperatura ambiente adecuada.
- Perfundir el corazón con tampón de perfusión durante 5 min a una velocidad de 1 ml / min y sujetar el flujo de salida cámara de vidrio para permitir que el líquido de perfusión para recoger en el vidrio cónico y el sobre el corazón. El esquema para digerir el corazón se muestra en la Figura 3.
- En este momento debería ver el volumen del aumento corazón. Además, la sangre en el tejido cardíaco se sustituye por perfusión, causando palidez tejido.
- Suelte la abrazadera de salida para drenar el líquido de perfusión. Parar la bomba para mover el tubo desde el contenedor de tampón de perfusión para el contenedor de tampón de enzima (Figura 2E). Reiniciar la bomba para comenzar a perfundir el corazón con tampón de enzima (Tabla 2) a 1 ml / min. Fije la salida de nuevo para permitir que el tampón de la enzima en Sobre lacorazón.
- Aquí, como la enzima se perfunde el corazón y la digestión del tejido conectivo, el corazón se volverá más pálido y la integridad estructural disminuirá.
- Para determinar cuándo cortar los ventrículos del corazón digerido, levante el corazón de la copa cónica, apriete suavemente el corazón con unas pinzas y recoger unas cuantas gotas de líquido de perfusión en una pequeña placa de Petri y comprobar para ver si las células individuales están cayendo .
- Para el principiante, es útil para conectar la línea de perfusión con un manómetro. Cuando el corazón está siendo digerida la presión disminuirá rápidamente, ya que el tejido conectivo no se mantiene la resistencia. El manómetro es también útil para el principiante para garantizar que la posición de la aguja está por encima de la válvula aórtica y no en el ventrículo. Baja presión indicará que la aguja está en la cámara ventricular y alta presión indicó que la aguja toque la válvula.
- Cortar los ventrículos del corazón en un platollena de tampón de transferencia (A) (tabla 2) cuando la presión ventricular empieza a disminuir drásticamente o cuando usted es capaz de ver las células individuales en el perfundido. Esto usualmente toma ~ 7-10 min.
- Una vez más el uso de fórceps micro-disección (Figura 1C), pelos en los ventrículos en trozos pequeños para disociar. Una digestión exitosa dejará casi no hay trozos sólidos de tejido después del picado, con la mayor parte del tejido convertirse en amorfo después de la disociación.
- Para disociar aún más el tejido, una pipeta la solución de entrada / salida utilizando una pipeta Pasteur de plástico (Figura 4) de la que la punta había sido cortada en un ángulo de ~ 45 °. Esta modificación sirve para aumentar el espacio diametral interior de la punta de la pipeta disminuyendo así la cantidad de esfuerzo de cizallamiento en las células como el tejido se tritura.
- Antes de la disección del tejido con las pinzas es posible separar las cámaras individuales y por separado disociar auricular, ventricular izquierda o derecho de propocélulas ventriculares t.
- Asegure la malla cuadrado (Figura 1M) para un pequeño embudo (Figura 1 l) con abrazaderas y coloque este aparato de filtración en un tubo Falcon de 15 ml (Figura 1I).
- Utilice la pipeta Pasteur modificado para eliminar la solución de células de la placa y filtrar la solución en el tubo Falcon.
- Permita que las células vivas se depositen en el fondo del tubo (sedimentación de células vivas debería tomar 2-4 min).
- Alícuota de 2,5 ml de cada una de las cuatro soluciones de calcio (Tabla 3) en 4 tubos Falcon de 15 ml separados.
- Una vez más utilizando una pipeta Pasteur estándar, quitar cuidadosamente el sedimento celular a partir de la parte inferior del tubo y transferir las células a la primera de las soluciones de calcio.
- Permitir que las células se depositan en el fondo del tubo y repita el paso 1.17 en las soluciones de calcio posteriores hasta que las células están en la última solución.
- No dejes que las células se asientan en el fourth solución de calcio. Tapar el tubo y convertirlo en su lado.
2. Cultivo Celular
- Antes de que el aislamiento, la placa 1 ug / ml de laminina natural del ratón sobre cubreobjetos de vidrio y se incuba durante al menos 1 hora a 37 ° C y 2% de CO 2. También permiten que su cubierta metálica y medios de cultivo (Tabla 4) para calentar en la incubadora a 37 ° C y 2% de CO 2. Esto permite que el CO2 disuelto en los medios de comunicación se equilibre.
- No quite la parte superior de los medios de comunicación. Simplemente afloje la parte superior para evitar la contaminación.
- Permitir que las células aisladas para sedimentar en el fondo del tubo Falcon.
- Retire el sedimento usando una pipeta Pasteur de plástico estándar y resuspender en la cantidad apropiada de chapado medios de comunicación.
- Placa de las células sobre los cubreobjetos recubiertas con laminina en el plato de tamaño apropiado y se incuban en 37 ° C y 2% de CO 2 durante al menos 30-60 minutos para permitir que las células se adhieran a los cubreobjetos.
- ** Si la transfección con adenovirus, diluir el virus en una cantidad apropiada de medio de siembra y reemplazar el medio de siembra en el plato con los medios de comunicación que contiene el virus. Deje que el virus se incuba en las células durante 2 horas en 37 ° C y 2% de CO 2. **
- Retire el papel de recubrimiento de la placa y reemplazar con medios de cultivo.
- Cambie cuidadosamente los medios de cultivo de cada día con el fin de no molestar a las células sobre los cubreobjetos.
Usando este procedimiento, las células se han cultivado con éxito durante un máximo de 72 h. Imágenes de células cultivadas y transfectadas GFP se pueden encontrar en la Figura 5.
3. Sistema MMSYS
- Encienda el sistema MMSYS asegurar que la lámpara de arco se inicia en primer lugar.
- Conectar los tubos de la bomba a la entrada y salidas apropiadas de la cámara de MMSYS (Figura 6).
- Primer el sistema con tampón de calcio (B) (Tabla 2).
- Coloque un aprcubreobjetos opriately tamaño en la cámara y atar (Figura 6E). La mayoría de las cámaras de MMSYS utilizan ya sea 22 mm o 25 mm cubreobjetos cuadrados. Consulte el manual de usuario MMSYS para determinar el cubreobjetos apropiado para su cámara.
- Transferir 500 l de la solución de células a un pequeño tubo de Eppendorf.
- Añadir 0,5 l Fura2-AM (solución madre de 1 mg / l) para el tubo pequeño de las células y permitir que se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente durante 5-7 min. Esto permite que el Fura2-AM a "carga" en las células a través de una rápida difusión pasiva a través de la membrana celular.
- Deje que las células cargadas Fura-2 de pellets a la parte inferior del tubo, y se lava el exceso de Fura con 500 l de tampón de calcio B.
- Apague las luces de la habitación.
- Utilizando una pipeta Pasteur estándar, deje caer 1-2 gotas (dependiendo de la concentración celular) de la solución de células "cargado" en el centro de la cámara (Figura 6C) y permitir que las células To asentarse en el cubreobjetos durante 5 min.
- La densidad de las células en la cámara debe ser tal que las células individuales que no se solapan se pueden ver fácilmente en la plataforma de adquisición de datos MMSYS.
- Con cuidado, comienzan a fluir tampón de calcio (B) a través de la cámara.
- Aumente la temperatura de la cámara a 37 ° C.
- IMPORTANTE: No encienda el aparato de calentamiento hasta que se haya iniciado el flujo. Esto puede dañar seriamente el termistor de retroalimentación (Figura 6A).
- Asegúrese de que la cámara está conectada a la MyoPacer a través de los cables de conexión (Figura 6B) y comenzar a caminar de las células 5 Hz a 1,5 veces el umbral de estimulación de las células.
- Elija una célula que está latiendo en la frecuencia correcta y moverlo en la abertura enmarcar.
- Ajustar la cámara y de encuadre dimensiones de abertura de modo que toda la célula se encuentra en el centro de la ventana, dirigido horizontalmente, con la sarcómeros APpadre.
- Para ajustar la longitud de la célula roja y verde (derecha e izquierda) indicadores de fotodiodos para el borde de la celda. Ajuste el contraste para optimizar el contraste negro / blanco en los bordes de la celda. Consulte el manual de Ionoptix para más detalles.
- Colocar la caja en una superficie de la celda que contiene sarcómeros bien definidos y ajustar el enfoque para optimizar el pico del espectro de potencia (rojo). También ajuste el brillo del microscopio para optimizar la ventana de suavizado azul y contrastar información negro.
- Ajuste las barras de umbral verdes para captar la mayor cantidad de la potencia del espectro rojo (pico) y la menor cantidad de fondo posible.
- Comience a grabar.
- Después de suficientes datos ha sido registrado, haga clic en "Pausa" para detener temporalmente la grabación y, asegurar que ni el enfoque ni las dimensiones de la ventana de visualización se alteran, mover etapa del microscopio a un área del cubreobjetos en la que no hay células o material celular pueden ser visto. Length de grabación varía dependiendo del protocolo experimental del investigador.
- Nota: Al hacer clic en "Stop" terminará la grabación y ningún fondo podrá ser grabado para esa celda.
- Haga clic en "Continuar" para grabar una medición de fondo.
- Después de suficientes antecedentes ha sido registrado haz clic en "Stop" para terminar la grabación.
- Haga clic en "File >> Save" para guardar todos los rastros de esa celda en una sola. Zpt archivo.
- Repita los pasos 03.12 a 03.20 hasta que se hayan registrado suficientes células.
- Consulte el manual del usuario IonOptix-MMSYS 12 para obtener instrucciones sobre el análisis de los datos registrados. Datos grabados característicos de los cardiomiocitos de tipo salvaje se muestran en la en la Figura 7.
4. Patch Clamp
Sujeción Parche de diferentes tipos de células han sido bien descrito previamente en esta revista 25-28. Por lo tanto, nos centramos en algún críticoparámetros de Al para éxito patch clamp de cardiomiocitos adultos aislados utilizando el protocolo descrito.
- El uso de un extractor de pipeta y vidrio de borosilicato (con filamento: OD 1,5 mm, ID 0,86 mm - 10 cm de longitud) tire de una pipeta que exhibe ~ 2,0-3,0 MΩ cuando se llena con solución de la pipeta (Tabla 5).
- Fuego-pulir la punta de la pipeta suavemente con un Narishige u otro pulidor de fuego vertical. La resistencia de la pipeta parche debe ser de 2-4 meses después de pulido al fuego.
- Encienda el ordenador, amplificador (Axopatch 200B), convertidor AD (Digidata 1440A, Axon Instruments) y Micromanipulador (MP-285). Para el conjunto de patch clamp de células, comenzamos con los parámetros estándar como se describe anteriormente.
- Para culta adulto CM, sacarlos de la incubadora y suavemente lavar el portaobjetos en el que los CM están chapados en PBS a temperatura ambiente.
- Retire con cuidado el cubreobjetos y colocarlo en la cámara de perfusión en el microscopio invertido (Nikon TE 2000).
- Asegúrese de que la entrada para el sistema de perfusión y de salida (de succión) se encuentran justo encima de la superficie del cubreobjetos.
- Iniciar la perfusión con la solución extra-celular apropiada (Tabla 5).
- Para el adulto recién disociada CM, coloque un cubreobjetos recubierto de colágeno en el sistema de perfusión que el anterior.
- Dado que las células serán en solución, vuelva a colocar suavemente la solución con tampón extracelular.
- Mediante la pipeta Pasteur modificado (Figura 4), resuspender suavemente las células en el tampón extracelular, tomar una alícuota y colocarlo en el cubreobjetos.
- Deje que las células se adhieren durante 10-15 minutos antes de iniciar la perfusión como en 4.4.
- Back-llenar toda la pipeta parche de células con tampón intracelular utilizando un Microfil (World Precision Instruments, 28 G) de la aguja. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la punta de la pipeta; golpee suavemente para permitir que las burbujas de aire que flotan en la surfaCE de la solución.
- Conecte el parche pipeta llena hasta la pipeta titular, asegurando que existe un contacto entre el microelectrodo y la solución interna.
- Utilizamos electrodos de cloruro de plata, pero nos encargamos de 'cloruración' los alambres de plata por lo menos una vez a la semana por inmersión durante la noche en lejía de uso doméstico.
- Baje suavemente la pipeta en el baño, lo que garantiza que el electrodo de baño se encuentra inmersa en todo momento en la solución del baño / extra-celular. Offset cualquier potenciales de unión líquida en este momento. Las grandes potenciales de unión pueden ser un signo de deterioro de cloruro de plata en los electrodos.
- Saludable adulto cilíndrica CM se identifican en el microscopio y se centra en el campo de visión. Como se ha descrito anteriormente, una combinación de mover el micromanipulador y ajustar el enfoque permite una estrecha proximidad de la pipeta de parche y la superficie de la CM.
- Una vez que están en el mismo plano focal, se utiliza una combinación de visualción de la célula y el pulso de prueba (disponible en el Axopatch 200B).
- Una vez que la resistencia de la pipeta disminuye en un medio (lo que sugiere que la pipeta está en contacto con la superficie de la célula), y la célula continúa buscando cilíndrica, establecemos sello gigaohmio usando una succión suave.
- Para MC, preferimos la boca de aspiración de establecer una presión negativa. Si se obtiene éxito un gigaseal, usamos de nuevo suave succión boca rítmica para 'break-in "a la celda para establecer el modo de parches de células enteras.
- Potenciales de reposo típicos de los CM saludable están en el orden de -85 a -90 mV. Una vez que se obtiene una gigaseal, medir el potencial de membrana en reposo utilizando la pinza de corriente con I = 0 pA.
- Si el potencial de membrana en reposo se despolariza esto puede indicar una célula dañada o un sello pobre.
- Debido a que los CM son células grandes con una gran cantidad de superficie, requiere una cuidadosa atención debe prestarse a la capacidad de compensación, especialmente wgallina activar rápidamente corrientes tales como el canal de sodio debe ser estudiado. Si la compensación de capacitancia adecuada no se puede obtener utilizando el construido en los ajustes de compensación en el generador de impulsos, prepulsos a la tensión de sub-umbral y polaridad opuesta puede tener que ser aplicado y la corriente resultante se resta de la señal grabada. Tal protocolo se programa fácilmente en Axopatch.
- Una vez que se ha establecido el modo de parches de células enteras, esperar 15 minutos para permitir el equilibrio y garantizar la estabilidad de la junta antes de la tensión de principio o protocolos de corriente con la pinza. Utilizamos protocolos estándar que han sido descritos anteriormente en esta y otras revistas y no se elaborará sobre.
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Representative Results
El aislamiento de los adultos cardiomyoctyes resultados en las células en forma de barra, estriados y de reposo (no de forma espontánea de latir) (Figura 5A). Las células muertas se verá redondeado y sin estrías estarán presentes. Las células quiescentes pueden ser cultivadas y transfectadas con adenovirus para manipular la expresión génica (figuras 5B y 5C). Después de 24 horas de cultivo, la morfología de las células vivas no cambia, siguen siendo Ca 2 +-tolerante, y pueden ser paseaban por la estimulación de campo. Con el procedimiento propuesto, un rendimiento del 80-90% de células viables se puede lograr.
Para medir la contractilidad de la célula, el software del sistema MMSYS toma la información de fase desde el microscopio para reportar cualquiera de los cambios en sarcómero o longitud de la célula. Se muestra en la (Figura 7A) es una traza de la contractilidad del representante a través de la medición de longitud del sarcómero de un C57BL6 ratón de tipo salvaje. Para los miocitos de ratones adultos sanos de lalos ratones se, la longitud del sarcómero línea de base es ~ 1.7 a 1.9 micras. El software del sistema MMSYS es capaz de medir simultáneamente la contractilidad y la manipulación de calcio mediante la medición de la relación de la cota a las formas no unidas de colorante Fura2-AM de calcio activados. Mientras que las medidas de relación puede variar ligeramente entre las configuraciones, para las células sanas, la relación es típicamente entre 1.5 a 2.5 (Figura 7B). Si el sistema de MMSYS ha sido calibrado para el calcio, a continuación, esta relación se puede traducir en una medida absoluta de la concentración de calcio intracelular. Con el fin de analizar los datos que se genera a partir de las trazas de la contractilidad y de calcio, los restos deben ser promediados para crear una traza característico para esa célula (Figuras 7C y 7D). Esos restos característicos son luego sometidos a un algoritmo de análisis de datos monotransient desde el software del sistema MMSYS que entonces genera los parámetros de la función sistólica y diastólica. Más detalles están presentes en el ionManual Optix.
Cardiomiocitos de ratones adultos también estaban sujetos a experimentos enteras patch clamp de células en las que el potencial de acción se registró en el modo de pinza de corriente (Figura 8).
| Peso corporal (g) | La ketamina / xilazina (ml) |
| 15 | 0.18 |
| 20 | 0.25 |
| 25 | 0.31 |
| 30 | 0.37 |
| 35 | 0.43 |
| 40 | 0.49 |
| 45 | 0.55 |
| 50 | 0.62 |
Tabla 1. Adultos Mouse Peso dependiente de ketamina / xilazina Dosificación (80:12).
| Solución | Receta |
| Tyrode buffer * (PH 7,4) | 1 L ddH2O 137 mM NaCl 4 mM de KCl 1 mM de MgCl 10 mM de HEPES 0,33 mM NaH 2 PO 4 |
| Perfusión Buffer * (PH 7,4) | 500 ml de tampón de Tyrode 10 mM D-(+)-glucosa, mínimo 5 mM Taurina 10 mM de Butanedione monoxima (BDM) |
| Enzyme Buffer * | 50 ml de perfusión Buffer 0,024 g de colagenasa D (tipo IV) 0,018 g de colagenasa B (Tipo II) 0,003 g de la proteasa de Streptomyces griseus XIV |
| Transfer Buffer (A) | 45 ml de perfusión Buffer 5 ml de albúmina de suero bovino (de la solución 5 mg / ml de solución madre) |
| Calcium Buffer (B) | 1 L de tampón de Tyrode 1,2 mM de CaCl 5,5 mM D-(+)-glucosa, mínimo |
Tabla 2. Adultos aislamiento cardiomiocitos Recetas Buffer.
| [De CaCl] | Transfer Buffer (A) | Calcium Buffer (B) |
| MM Ca 2 + 0.06 | 9,5 ml | 0,5 ml |
| MM Ca 2 + 0.24 | 8,0 ml | 2,0 ml |
| MM Ca 2 + 0.60 | 5,0 ml | 5,0 ml |
| MM Ca 2 + 1.20 | 0 ml | 10 ml |
Tabla 3.Calcium Titulación Solución Recetas.
| Plating Medium | Medio de Cultivo |
|
|
Tabla 4. Plating y Cultura Recetas Medios.
| Solución de la pipeta | Solución Bath |
|
|
Tabla 5. Patch Clamp Solutions (soluciones mostradas son para la medición de las corrientes de sodio).
Figura 1. .. Instrumentos de aislamiento de cardiomiocitos adultos A) OptiVisor vidrio óptico de la lupa binocular B) pinzas de tejido, en 5,5, 1x2 dientes -. Roboz Científico C) fórceps Moloney - 4.5 in (11,5 cm) de largo ligera curva dentada, -. Roboz Científico DE) Dumont # 3 Pinzas, Dumostar, tamaño de la punta 0,17 x 0,10 mm. F) Packer Mosqui Pinzas 5 en Derecho Flat -. Roboz Científicas G) Micro Tijeras de disección 4,5 en Curva de Sharp / Sharp -. Roboz Científico H) Micro Tijeras de disección 3,5 en Derecho de Sharp / Sharp 20 mm -. Roboz Científica I) 15 ml tubo Falcon - Thermo -Fisher Scientific J) 60 mm placa de Petri que contiene PBS K) Softsilk: seda trenzado recubierto de cera, 19 mm - Covidien L) Embudo de plástico, 6,0 cm de diámetro M) de malla de nylon - 400μm tamaño de los poros.....
Figura 2. Langendorff aparato. A) Todo el sistema de perfusión Langendorff utilizado para el aislamiento de cardiomiocitos adultos. B) Vista ampliada de la hondonada, embudo cónico de recogida de vidrio usado para calentar el corazón canulado. C) Vista ampliada de la aguja de la canalización no hipodérmica. (Feedin reutilizableg Agujas (24 G, recta, punta redonda, 25 mm de largo; Fine Ciencia Herramientas Inc. Artículo 18061-24). D) Circulación baño de agua E) Baño de agua para la incubación de perfusión, enzimas y tampones de transferencia.
Figura 3. Un esquema detallado del sistema de perfusión.
Figura 4. Modificado pipeta Pasteur. La pipeta se modificó mediante la reducción de la punta en un ángulo de aproximadamente 45 °. Esto permite una mayor área de superficie y crea menos tensión de cizalladura en las células a medida que se disocian. El recuadro muestra una vista más cercana de la punta modificada.
Figura 5. Cardiomiocitos cultivados y GFP transfectadas. A) Recién isolat ed cardiomiocitos adultos de un ratón C57BL6 de 12 semanas. Las flechas apuntan a las células muertas o moribundas. Estas células son más redondeadas que el, adulto en forma de barra saludable. CM B) cardiomyoctyes ratón adulto GFP transfectadas después de 24 horas de cultivo. C) cardiomiocitos cultivados de ratón adulto después de 24 horas. El recuadro muestra una mayor ampliación de los miocitos en cultivo.
Figura 6. . Cámara de sistema MMSYS flechas azules representan el flujo del tampón de perfusión (Tampón B) A) Individual, calentador en línea solución -... Warner Instrument Corporation B) Conexión de los cables de la cámara de sistema MMSYS al estimulador campo MyoPacer C) Platino electrodos para la estimulación de campo situada en el centro de la cámara. D) del depósito de salida. E) Cámara abrazaderas en la posición abierta.
Figura 7. Datos del sistema MMSYS representativos registrados por tipo salvaje ratones C57BL6 obtenidos de Jackson Labs. A) los rastros de la contractilidad de base MMSYS. B) Relación de Ca 2 +-ligado a Ca 2 +-sin consolidar Fura2-AM se registró para generar trazas de calcio base. Estos vestigios corresponden a las mediciones de contractilidad en A). C) con un promedio de contractilidad rastros de base compilados por el software del sistema MMSYS en un rastro de la contractilidad característico. D) traza calcio Característica compilado a partir de los restos de bases de B). El análisis de los restos de material compuesto permite al investigador para generar parámetros de sustitución de la función sistólica y diastólica. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 8. Patch clamp traza que muestra el potencial de acción de un tipo salvaje de cardiomiocitos de ratón adulto.
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Discussion
En este informe, hemos descrito las técnicas necesarias para el éxito en el aislamiento y la cultura de los adultos los CM del corazón de ratón. Nuestra técnica permite para el estudio posterior de la función de CM y la excitabilidad usando los métodos descritos anteriormente. El parámetro crítico para el estudio de la funcionalidad de adultos CM es la salud y la calidad de los CM aislado. Como se describió anteriormente, nuestras técnicas permiten un alto rendimiento de células funcionales que son susceptibles a la manipulación de la expresión génica utilizando las infecciones adenovirales / lentivirales en cultivo, y el análisis de la excitabilidad celular y la función contráctil.
Uno de los parámetros más importantes para el aislamiento de ratón adulto funcional CMS es preciso y rápido canulación del corazón en la aguja hipodérmica no. Se debe garantizarse que la aorta unida al ventrículo izquierdo se diseccionó a una longitud suficiente para permitir la canulación rápida más fácil y más del corazón. Cuando cannulating tél corazón, también es esencial que la punta de la aguja permanece en la aorta ascendente y no se extiende más allá de la válvula aórtica en el ventrículo izquierdo para permitir la perfusión eficiente del tejido a través de las arterias coronarias. El siguiente paso crucial es asegurar la aorta para el vástago de la aguja utilizando una sutura de seda. La sutura debe ser atado en la aorta ascendente, de modo que el tampón de perfusión retrógrada fluye en las arterias coronarias y de la cavidad ventricular izquierda, pero no fluye de forma anterógrada a través del extremo distal de la aorta disecada o los grandes vasos.
Algunos investigadores encuentran que es útil para establecer un indicador de presión para evaluar la calidad de la canalización y posterior perfusión de la enzima. Cuando se utiliza un medidor de presión, la presión ventricular izquierda inicial debe ser de ~ 80 a 100 cm de H 2 O, y sobre la perfusión con la enzima, la presión disminuirá hasta ~ 40-50 cm H 2 O. Cuando la presión del ventrículo llega a este punto, esmás probable listo para ser a ser cortado de la aguja. Para garantizar que los ventrículos son bien digeridos, unas gotas de flujo pasante se pueden recoger desde debajo del corazón en una placa de Petri y se comprueban para ver si contiene células vivas, quiescentes están presentes.
Las células aisladas resultantes de este procedimiento se prestan bien para inmunocitoquímica. Pueden ser fijos utilizando métodos de fijación regulares 29 (es decir, la formalina, paraformaldehído, helado de metanol o acetona), pero un mayor nivel de permeabilización que se utiliza normalmente para cardiomyoctyes neonatal es a veces necesaria para obtener imágenes de las proteínas citosólicas o estructuras de proteínas (es decir, alfa- actina sarcomérica, beta miosina). Finalmente, las células pueden ser cultivadas y posteriormente infectadas con adeno-o lentivirus para manipular la expresión de genes, o se utilizan para análisis funcionales del aparato contráctil celular.
Cultura de ratón adulto CM durante mucho tiempo ha sido descrita comodesafiante. Usando las técnicas descritas aquí, podemos cultura rutinariamente estas células para hasta 72 horas, aunque el rendimiento de las células funcionales disminuye notablemente después de 36 hr. Cuando el cultivo de las células, es imperativo que las células se colocaron en placas a 37 ° C en 2% de CO 2. Esto es diferente de los CM neonatal, que prefieren ser cultivado a 10% de CO2 durante las primeras 24 horas y luego se cambió a 5% de CO 2, o los fibroblastos cardiacos neonatales, que también prefieren 5% de CO 2. El medio de siembra y la cultura puede ser equilibrada para que el CO2 disuelto es del 2%.
Las células se sembraron en cubreobjetos recubiertos con laminina a fin de que no se despegan del vidrio cuando se cambia los medios de comunicación. Sin embargo, los cardiomiocitos no se adhieren muy firmemente a la de vidrio, incluso con el recubrimiento de la laminina. Por eso es muy importante que se tomen precauciones al cambiar el medio de cultivo, utilizando pipetas estériles, y no un sistema de aspiración por vacío. Una vez que la células se siembran, que pueden ser transfectadas con adenovirus mediante la incubación del virus por no más de 2 horas. El momento depende del título del virus y la proteína de ser sobre-expresado, lo que se recomienda la realización de experimentos preliminares para determinar LD 50 y ED 50 para el virus. En la mayoría de los casos, se utiliza un MDI, de 20 a 100 para el adenovirus. Una vez que las células han sido incubadas con el virus, la expresión del gen objetivo (s) toma típicamente ~ 24-36 h.
Las células aisladas que se extendieron en placas sobre cubreobjetos de un tamaño adecuado para la cámara de sistema de MMSYS también se pueden analizar para la contractilidad y la manipulación de calcio usando el sistema de imágenes MMSYS. Estos cubreobjetos se pueden colocar directamente en la cámara, y el medio de cultivo se pueden quitar girando en el sistema de perfusión. Si las células no están siendo cultivadas y están siendo utilizados para el análisis directamente después del aislamiento, se pueden añadir directamente a la cámara una vez al cubreobjetos se ha colocado. Mientrasno es necesario pre-coat los cubreobjetos con laminina en el análisis de las células recién aisladas, en nuestra experiencia, laminina sí ayuda a que las células se adhieren a la mejor cubreobjetos. Utilizando un caudal lento para la unidad MMSYS además asegura que las células permanecen unidas a la cubreobjetos. Por último, la óptica del microscopio, en particular la lente del objetivo deben ser limpiados escrupulosamente antes de cada experimento, para permitir la visualización precisa de sarcómeros necesarios para la evaluación de la contractilidad.
El componente más importante del sistema MMSYS es el calentador solo en-línea de fluido que calienta el tampón de perfusión (B), que desemboca en la cámara. El elemento termogénico de este equipo está diseñado para el intercambio de calor con el fluido que pasa a través de la transferencia de calor por convección, por lo que si el flujo está ausente, el intercambiador se recalentará y podría dañar irreparablemente el sistema. Por lo tanto, es imperativo que el calentador está encendido sólo después de que se inicia el flujo.
Otros métodos de analizar el aparato contráctil de los cardiomiocitos adultos se han descrito anteriormente, incluyendo métodos sofisticados utilizando microscopía de fuerza atómica 30-32. Algunos de estos métodos permiten una medición más sofisticada de localizada fuerza y propiedades tales como el módulo de Young contráctil, haciéndolos más adecuados para la medición de las células de forma irregular o células sin sistemas de sarcoméricas claramente definidos, tales como los CM derivadas de células madre pluripotentes inducidas. Estas técnicas pueden ser tan fácilmente utilizado en el adulto aislado CM. La ventaja del sistema de MMSYS es la relativa facilidad de la medición de la contractilidad y la capacidad de medir un gran número de células en un corto período de tiempo en las células con sarcómeros claramente definidos. Además, los sistemas de soft de última generación y análisis de sarcómero que pueden medir la longitud de la celda o la longitud entre sarcómeros permiten, respectivamente, para dos diferentes (pero r) métodos eufóricos para medir la contractilidad. El software de adquisición de datos combinada con la avanzada, el software de análisis de fácil uso hace que este sistema sea fácil de aprender y usar. Por último, la capacidad de medir la dinámica del calcio simultáneamente permite la correlación entre la contractilidad y la homeostasis del calcio, lo que no es factible con microscopía de fuerza atómica. También, debido a que la salida de datos es una medida radiométrica de un colorante activado por calcio (Fura2-AM), con la calibración correcta, se pueden recoger las medidas absolutas de las concentraciones de calcio internos.
Grabación exitosa de las señales de los canales iónicos de cardiomiocitos adultos requiere que las celdas estén en óptimas condiciones. Inmediatamente después del aislamiento y de las planchas de las células que no son adherentes y flotará en solución; en esta etapa que no pueden ser estudiados. A las pocas horas que se adhieren a un cubreobjetos recubierto y es en este punto que pueden ser estudiados. En nuestra experiencia de parches dentro de unas pocas horas dechapado de producir el resultado óptimo, como esperar demasiado negativamente afecta a las células. Como se describió anteriormente, probar el potencial de membrana en reposo después de establecer un sello gigaohmio y rompiendo en la célula, así como la capacidad de establecer un sello gigaohmio en sí son dos parámetros que reflejan la forma saludable las células están en el momento de la instalación del parche. Si bien es más fácil de parchear en células que no se están contrayendo, esto no es un requisito previo, los sellos adecuados se pueden obtener a vencer a las células así. Los protocolos que se utilizan en este punto depende de los objetivos del estudio patch clamp, utilizando técnicas de corriente con la pinza, los potenciales de acción espontáneos o inducidos se pueden grabar. Alternativamente, de fijación de tensión puede ser usado para estudiar canales de iones específicos. Dada la panoplia de canales en la membrana, tales grabaciones se realizan generalmente en presencia de bloqueadores de los canales de iones. La tetrodotoxina (TTX), nisoldipina, y cesio se utilizan a menudo para bloquear sodio, calcio y potasio, respectivamente, canales, although una variedad de medicamentos han sido usados, y los detalles de su uso se han publicado extensamente. La mayoría de los planteamientos obedecen bien a las corrientes de grabación antes y después de la aplicación de los bloqueadores de los canales de iones y la sustracción de los corrientes, y / o el bloqueo de los canales de fondo con los bloqueadores adecuados antes de la grabación.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
| D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
| Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
| Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
| Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Tissue forceps, 5.5", 1x2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Forceps 5" Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Micro Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
References
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