Summary
Här beskriver vi isoleringen av vuxen mus cardiomyoctyes med en Langendorff perfusion-systemet. De resulterande cellerna är Ca2 +-tolerant, elektriskt vilande och kan odlas och transfekterade med adeno-eller lentivirus att manipulera genuttryck. Deras funktion kan också analyseras med hjälp av MMSYS systemet och patch clamp teknik.
Abstract
Användningen av primära kardiomyocyter (CMS) i kultur har gett ett kraftfullt komplement till musmodeller av hjärtsjukdom i att öka kunskaperna om hjärtsjukdomar. I synnerhet har förmågan att studera jon homeostas, jonkanal funktion, cellulär retbarhet och excitation-kontraktion koppling och deras förändringar i sjuka förhållanden och av sjukdomsframkallande mutationer lett till betydande insikter i hjärtsjukdomar. Dessutom har avsaknaden av en adekvat odödlig cellinje för att härma vuxna CM, och begränsningarna för neonatal CM (som saknar många av de strukturella och funktionella biomekanik karakteristisk för vuxna CMS) i kultur försvårat vår förståelse av det komplexa samspelet mellan signalvägar, jonkanaler och kontraktila egenskaper i den vuxna hjärtat stärker vikten av att studera vuxna isolerade hjärtmuskelceller. Här presenterar vi metoder för isolering, kultur, manipulation av genuttryck genom adenovirus-expressed proteiner och efterföljande funktionell analys av hjärtmuskelceller från vuxen mus. Användningen av dessa tekniker kommer att hjälpa till att utveckla mekanistiska inblick i signalvägar som reglerar cellulär retbarhet, Ca 2 + dynamik och kontraktilitet och ger en mycket mer fysiologiskt relevant karakterisering av hjärt-kärlsjukdom.
Introduction
Musmodeller av hjärt-och kärlsjukdomar har fungerat som effektiva verktyg för att belysa mekanismerna grundläggande sjukdoms 1,2 samt för att identifiera potentiella terapeutiska mål 1,3. Framför allt har användningen av både musmodeller av förvärvad hjärtsjukdom (såsom tryck-överbelastning) 4,5 och transgena musmodeller avancerade vår förståelse av hjärtsjukdom 6-8. Användningen av cellodlingsteknik för att studera signalkaskader 3,9,10 och förändringar i enskilda proteiner som ligger bakom cellulär retbarhet och excitation-kontraktion koppling i hjärtat 11-13 i nivå med den enda cell har kompletterat de vivo-modeller i mus. Däremot har bristen på lämpliga cellinjer som speglar vuxen CM struktur och funktion varit en betydande begränsning. Forskare har försökt att övervinna detta genom att studera individuella proteiner, såsom jonkanaler, i heterologa expressionssystem
Primära neonatala råttventrikulära hjärtmuskelceller (NRVMs) är relativt lätt att kultur kan vara infekterade med adenovirus och lentivirus att manipulera genuttryck 15, ennd har därför använts framgångsrikt 1, men har begränsningar i sin egen. Även om de ger en fysiologisk mikromiljö 1 och har varit arbetshästen i fältet signalering, avsevärda skillnader mellan morfologi och subcellulära organisation av NRVMs och vuxna cardiomyoctyes gör dem en otillräcklig modell för utredning av joniska flöden och excitation-kontraktion koppling i den vuxna hjärtat . Notably NRVMs saknar en slutgiltig t-rörformiga delsystemet 4. Eftersom Ca2 + flöde och dynamik är kritiskt beroende av mogna t-tubulär och sarko retiklet (SR) struktur 6, Ca 2 + dynamik och funktionella studier av hjärtkontraktiliteten i NRVMs är inte en korrekt bild av dessa kritiska processer hos vuxna hjärtmuskelceller. Vidare, vissa komponenter i signalvägar skiljer mellan neonatala och vuxna möss 9, vilket ger en annan begränsning för att studera sjukdomsprocesser och deras iMPACT på cellulär retbarhet och kontraktilitet i NRVMs. Slutligen, fördelningen av den kontraktila maskiner leder till flera riktningar och olikformig cell förkortning begränsar noggrannheten hos mätningarna kontraktila.
Användningen av isolerade vuxna cardiomyocytes tillhandahåller därför en mer exakt in vitro modellsystem. Den extra tillväxt av kunskap som möjliggjorts genom genetisk manipulation av möss understryker betydelsen av att få funktionella isolerade hjärtmuskelceller från möss. I själva verket har karakterisering av vuxna CM isolerade från musmodeller belysa många biologiska och patologiska händelser. Isolerade CM från transgena musmodeller har tillåtet för studier av vinst eller förlust av funktion av proteiner på de kontraktila egenskaperna hos enskilda celler 2,16 och livskraft i sjukdomsmodeller såsom ischemi / reperfusion 17,18, därmed komplettera information som erhålls från i vivo-studier påse-möss. Användning av isolerade vuxen CM från musmodeller av förvärvad hjärtsjukdom 3,19,20 (t.ex. tvärgående aorta sammandragning-inducerad tryck överbelastning, som härmar hypertoni eller aortaklaffen stenos) eller motion 5,21 (för modellering fysiologisk hypertrofi) möjliggör undersökning av samverkan av signaleringskaskader som blandas in i dessa processer med cellulär retbarhet och excitation-kontraktion koppling vid nivån för en enda cell. Dessutom, förmågan att manipulera genuttryck med hjälp av adenovirus-driven genuttryck i vuxen CM ger oss möjlighet att dissekera de komponenter i komplexa signaleringsvägar.
Ur en elektrofysiologisk synvinkel, har hel-cellspänning och Tång experiment på isolerade vuxna CM varit avgörande för att belysa den typ av joniska flöden vid baslinjen och i olika sjukdomstillstånd. På grund av den komplexa strukturen av det cellulära membranet och differential protei byggnadsställningar strukturer mellan vuxen CMS och NRVMs eller heterologa cellinjer, förmågan att lappa vuxna celler ger en mycket bättre bild av effekterna av vissa membranproteiner, strukturella proteiner och jonkanal samverkande partners på de elektrofysiologiska komponenterna i den vuxna hjärtat.
Trots dessa framträdande fördelarna i att studera vuxna murina hjärtmuskelceller, isolera och odla vuxna möss hjärtmuskelceller har varit utmanande, manar behovet av en systematisk och noggrann beskrivning av den metod för att isolera livskraftiga mus cardiomyocytes och bevara dem i kultur för att möjliggöra ytterligare genetisk manipulation med hjälp av viral vektorer. Tidigare studier har använt antingen akut isolerad mus vuxen CMS eller odlade rått vuxen CM. De senare är lättare att odla än vuxen mus CM, och de flesta experiment manipulera genuttryck in vitro har använt råtta vuxen CM. Få studier har framgångsrikt förändrat och undersökt functiOnal genuttryck i mus vuxen CM, presentera en stor begränsning i tillämpningsområdet för experiment. Därför, här presenterar vi i detalj sådana metoder, modifierade från tidigare undersökningar, för isolering 7,8,22, kultur 3,10,15,23, adenoviral infektion 11-13,15, och funktionsanalys av vuxen mus ventrikulära cardiomyoctyes. Denna isolering protokoll resultat i Ca2 +-toleranta, hetsiga cardiomyocytes som vi har med framgång odlas i upp till 72 timmar och transient med adenovirus. Funktionaliteten i dessa isolerade celler kan bedömas med hjälp av MMSYS bildsystem 14,24 och patch clamp, som också kommer att diskuteras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cardiomyocyte Isolering
Material (figur 1)
Microdissecting pincett
Vävnads pincett
Ömtåliga hemostatiska pincett
Hemostatiska pincett
Microdissecting, sågtandade, böjda pincett
Rörelse sax, rak
Rörelse sax, böjd
15 ml Falcon-rör (5)
60 mm petriskål
Fosfatbuffrad saltlösning (PBS)
Nylon Mesh - 400 ìm porstorlek
Liten tratt
Vax dragna, flätat silke 4-0, 19 mm, 7-10 cm långa
Icke-injektionsnål, trubbiga änden, 24 G eller kommersiell djur-utfodring nål (24 x 1 i, W/1-1/4)
Heparin natrium
Ketamin / xylazin blandning
Pasteur-pipetter
OptiVision Dissecting Goggles
IonOptix MMSYS systemet
OBS: Om att odla celler, se avsnitt 2 på cellkultur innan detta protokoll.
OBS: Alla möss vårdas ien barriär anläggning och offrade enligt godkänd IACUC regler, rutiner och procedurer.
Obs: Innan du påbörjar proceduren, bör hela systemet förvärmas för att säkerställa att alla delar av Langendorff-systemet (Figur 2A, figur 3) värms till 37 ° C för att möjliggöra en ändamålsenlig och fullständig kollagenas aktivitet.
- Injicera vuxna möss (~ 12 veckor) med 150 USP enheter heparin natrium in i bukhålan.
- Bedöva med en injektion av en ketamin / xylazin-blandning vid en vikt-beroende dos (tabell 1).
- 80:12 mg / kg ketamin: xylazin recept: 2,6 ml ketamin (100 mg / ml) + 0,4 ml xylazin (100 mg / ml) + 37 ml PBS. Final: ketamin = 6,5 mg / ml, xylazin = 1 mg / ml
- Säkra sövd musen till operativsystemet pad, skära ut hjärtat, och lägg i en skål i rumstemperatur PBS eller 0,9% saltlösning (figur 1J). Physiologic saltlösning gör det intakta hjärtat att ingå avtal om bättre extrudering av blod i kammaren och enkel identifiering av aorta före steg 1.6. Möss kontrolleras så att de är djupt sövda via förlust av bakbenen tå nypa reflex och avtagande av andningsfrekvens före uppkomsten av torakotomi.
- Använd OptiVision dissekera glasögon (Figur 1A) för att identifiera och avslöja stora kroppspulsådern. Borttagning av vävnad runt aortan, även om den gör det lättare att visualisera kärlet, inte är nödvändig för optimering av cellisolering om aortaroten syns tydligt.
- Fylla pumpen med perfusionsbuffert (tabell 2). Temperaturen bör hållas vid 37 ° C under längden av det förfarande med användning av en kontrollerad, cirkulerande vattenbad (figur 2D).
- Montera hjärtat på Langendorff Apparat (Figur 2A). Med hjälp av två mikro-dissekera pincett (figur 1D-E), prIME aortan runt icke-hypodermisk, trubbiga änden snål (24 G) med silikonröret vid den distala spetsen. Alternativt kan en kommersiell djur-matningsnål (24 x 1 i, W/1-1/4) kan användas. Det silikonröret på 24 G nål eller utfodring av djur nålen kommer att tillåta för att säkra suturen över spåret. Placera aorta på nålen som en strumpa. (Figur 2C).
- OBS: Det är viktigt att vara säker på att änden av nålen vilar i aorta ascendens, helst i aortaroten distalt höger innominate, men att det inte sträcker sig genom aortaklaffen in i den vänstra ventrikeln, eftersom detta kommer att allvarligt begränsa möjligheten för buffertar för att effektivt BEGJUTA genom hjärtat via kranskärlen.
- Säkra hjärtat till nålen genom att knyta en liten längd av suture silke (7-10 cm långa) (figur 1K) runt den övre delen av aortan, vilket säkerställer att det försöket är på nivån för den uppstigande aorta, under höger innominate Artery, men över den änden av nålen.
- Sänk hjärtat in i det inre av den koniska glas (figur 2B) för att bidra till att upprätthålla en lämplig omgivningstemperatur.
- BEGJUTA hjärtat med perfusionsbuffert under 5 min vid en hastighet av 1 ml / min och klämma fast glaskammare utflöde för att tillåta perfusatet samlas i den koniska glas och kuvert hjärtat. Den schematiska för att digerera hjärtat visas i figur 3.
- Nu bör du se volymen på hjärtat ökar. Dessutom kommer blod i hjärtvävnad ersättas av perfusat, vilket orsakar vävnads blekhet.
- Släpp utflöde klämman rinna perfusatet. Stoppa pumpen för att flytta slangen från perfusionsbuffert behållaren till enzymbuffert behållare (Figur 2E). Starta om pumpen för att börja BEGJUTA hjärtat med enzymbuffert (tabell 2) vid 1 ml / min. Kläm utflödet igen för att enzymet buffert för att innesluta denhjärta.
- Här, som enzymet perfusion av hjärtat och uppslutning av bindväv, kommer hjärtat bli blekare och den strukturella integriteten minskar.
- För att avgöra när man ska skära ventriklarna från den smälta hjärtan, lyft hjärtat ur den koniska glas, försiktigt pressa hjärtat med pincett och samla några droppar perfusatet i en liten petriskål och kontrollera huruvida enstaka celler sjunker .
- För nybörjare är det bra att ansluta perfusion linje med en manometer. När hjärtat är att få smälta trycket kommer snabbt minska, eftersom bindväven inte håller motståndet. Manometern är också användbart för nybörjare att säkerställa att positionen för nålen är ovanför aortaklaffen och inte i ventrikeln. Lågt tryck kommer att indikera att nålen är i det ventrikulära kammaren och högt tryck indikerat att nålen kommer i kontakt med ventilen.
- Skär ventriklarna från hjärtat i en skålfull av överföringsbuffert (A) (Tabell 2) när kammartrycket börjar sjunka dramatiskt eller när du har möjlighet att se enstaka celler i perfusatet. Det tar vanligtvis ~ 7-10 min.
- Återigen med hjälp av mikro-dissekera pincett (Figur 1C), finhacka ventriklarna i små bitar för att dissociera. En lyckad matsmältning lämnar nästan inga fasta bitar av vävnad efter malning, med de flesta av vävnaden blir amorfa vid dissociation.
- För att ytterligare dissociera vävnaden, pipettera lösningen in / ut med hjälp av en plast pasteurpipett (figur 4) från vilken spetsen hade skurits till en ~ 45 ° vinkel. Modifieringen tjänar till att öka den inre diametriska utrymme av pipettspetsen sålunda minska mängden skjuvspänning på cellerna som vävnaden finfördelas.
- Innan dissekera vävnaden med pincett är det möjligt att separera de enskilda kamrarna och för sig ta avstånd förmak, vänster kammare eller right kammarceller.
- Säkra kvadrat mesh (figur 1M) till en liten tratt (figur 1L) med hjälp av klämmor och placera denna filtreringsapparat i en 15 ml Falcon rör (figur 1I).
- Använd den modifierade pasteurpipett för avlägsnande av cellösningen från skålen och filtrera lösningen i Falcon-rör.
- Låt de levande cellerna att sedimentera till botten av röret (levande cellsedimentering bör ta 2-4 min).
- Alikvot 2,5 ml av vardera av de fyra lösningar av kalcium (tabell 3) i fyra separata 15 ml Falcon-rör.
- Återigen med användning av en standard Pasteurpipett försiktigt bort cellpelleten från botten av röret och överföra celler till den första av de kalciumlösningar.
- Låt cellerna att sedimentera till botten av röret och upprepa steg 1,17 i de efterföljande kalciumlösningar tills cellerna är i den sista lösningen.
- Låt inte cellerna bosätta sig i fourth kalciumlösning. Förslut röret och vrid den på sin sida.
2. Cellodling
- Före isolering, plattan 1 ug / ml naturlig muslaminin på glastäckglas och inkubera under åtminstone 1 h vid 37 ° C och 2% CO2. Också låta din plätering och odlingsmedia (tabell 4) för att värma i inkubator vid 37 ° C och 2% CO2. Detta medger att upplöst CO2 i media för att ekvilibrera.
- Ta inte bort toppen från media. Helt enkelt lossa toppen för att undvika kontaminering.
- Låt de isolerade cellerna för att pelletera vid botten av Falcon-rör.
- Avlägsna pelletten med en vanlig plast pasteurpipett och återsuspendera i den lämpliga mängden av plätering medier.
- Plate cellerna på laminin-belagda täckglas i lämplig storlek skålen och inkubera i 37 ° C och 2% CO2 under åtminstone 30 till 60 min för att tillåta cellerna att vidhäfta till täckglasen.
- ** Om transfektion med adenovirus, späd viruset i en lämplig mängd plätering media och ersätta plätering media i skålen med virusinnehållande media. Låt viruset inkubera på cellerna under 2 h i 37 ° C och 2% CO2. **
- Ta av bordläggningen media från skålen och ersätta med odlingsmedier.
- Ändra försiktigt odlingsmedia varje dag för att inte störa cellerna på täckglas.
Med användning av detta förfarande, celler har framgångsrikt odlades i upp till 72 timmar. Bilder av odlade och GFP-transfekterade celler kan hittas i figur 5.
3. MMSYS System
- Driva MMSYS som säkerställer att båglampan initieras först.
- Anslut rören från pumpen till ett lämpligt inlopp och utlopp av MMSYS kammare (figur 6).
- Prime systemet med kalciumbuffert (B) (tabell 2).
- Placera en caopriately storlek täckglas in i kammaren och fäst (figur 6E). De flesta MMSYS kammare använda antingen 22 mm eller 25 mm kvadratiska täckglas. Rådgör med din MMSYS instruktionsbok för att bestämma lämplig täckglas för din kammare.
- Överför 500 | il av cellösningen till ett litet Eppendorfrör.
- Tillsätt 0,5 pl fura2-AM (stamlösning av 1 ng / | il) till litet rör av celler och tillåta dem att inkubera i mörker vid RT i 5-7 min. Detta gör att fura2-AM att "ladda" in i cellerna genom snabb passiv diffusion genom cellmembranet.
- Låt Fura-2 laddade celler pelletera till botten av röret, och tvätta överskottet Fura med 500 | il av kalcium buffert B.
- Stäng av rummet ljus.
- Med en vanlig pasteurpipett, drop 1-2 droppar (beroende av cellkoncentrationen) av "laddad" cell lösningen i centrum av kammaren (figur 6C) och tillåta cellerna to sedimentera på täckglas för 5 min.
- Densiteten av cellerna i kammaren bör vara sådan att enkel icke-överlappande celler lätt kan ses i MMSYS datainsamlings plattform.
- Börja försiktigt flöda kalcium buffert (B) genom kammaren.
- Ökning kammartemperaturen till 37 ° C.
- VIKTIGT: Stäng inte på värmeapparaten tills flödet har inletts. Detta kan allvarligt skada feedback termoelement (figur 6A).
- Se till att kammaren är förbunden med MyoPacer via anslutningstrådar (figur 6b) och börjar att stimulera cellerna 5 Hz vid 1.5x stimuleringströskeln för cellerna.
- Välj en cell som slår på den korrekta frekvensen och flytta den i utformningen öppningen.
- Justera kamera-och inramning bländar dimensioner så att hela cellen är i mitten av fönstret, riktad horisontellt, med sarkomerer apförälder.
- För cell längd justera rött och grönt (höger och vänster) fotodiodindikatorer till kanten av cellen. Justera kontrasten för att optimera den svart / vit kontrast vid kanterna av cellen. Läs i Ionoptix handboken för ytterligare information.
- Placera lådan i ett område av cellen som innehåller väldefinierade sarkomerer och justera fokus att optimera toppen av kraftspektrum (röd). Justera även ljusstyrkan i mikroskop för att optimera den blå utjämning fönstret och svart kontrastinformation.
- Justera gröna tröskellisterna för att fånga så mycket av den röda kraftspektrum (topp) och så lite bakgrund som möjligt.
- Börja inspelningen.
- Efter tillräckligt med data har spelats in, klicka på "Paus" för att tillfälligt stoppa inspelningen, och se till att varken fokus eller dimensioner av fönstret ändras, flytta mikroskop scen till ett område av täckglas där inga celler eller cellmaterial kan vara sett. Length av inspelningen varierar beroende på utredarens experimentella protokollet.
- Notera: Genom att klicka på "Stop" kommer att avsluta inspelningen och ingen bakgrund kommer att kunna registreras för denna cell.
- Klicka på "Fortsätt" för att spela in en bakgrundsmätning.
- Efter tillräcklig bakgrund har spelats in på "Stop" för att avsluta inspelningen.
- Klicka på "File >> Save" för att spara alla spår för den cellen i en enda. ZPT fil.
- Upprepa steg från 3,12 till 3,20, tills tillräckligt många celler har registrerats.
- Konsultera IonOptix-MMSYS Bruksanvisning 12 för instruktioner om analys av de registrerade uppgifterna. Karakteristiska inspelade data för vildtyp cardiomyocytes visas i i figur 7.
4. Patch Clamp
Patch fastspänning av olika celltyper har väl beskrivits tidigare i denna tidskrift 25-28. Vi fokuserar därför på vissa kritikeral parametrar för lyckad lapp fastspänning av vuxna hjärtmuskelceller isoleras med hjälp av våra protokoll beskrivs.
- Med användning av en pipett avdragare och borosilikatglas (med fila: OD 1,5 mm, ID 0,86 mm - 10 cm längd) dra en pipett som uppvisar ~ 2,0-3,0 MQ när de fylls med pipett lösning (tabell 5).
- Brand-polish pipettspetsen försiktigt med en Narishige eller annan vertikal brand polermaskin. Motståndet av plåstret pipetten bör vara 2-4 MO efter brand polering.
- Slå på datorn, förstärkare (Axopatch 200B), AD-omvandlare (Digidata 1440A, Axon Instruments) och mikromanipulator (MP-285). För hela cell patch fastspänning, börjar vi med standardparametrar som tidigare beskrivits.
- För odlade vuxen CM, ta bort dem från inkubatorn och försiktigt tvätta täckglas som CMS är pläterade med PBS vid rumstemperatur.
- Ta försiktigt bort täckglas och placera den i perfusion kammare på den inverterat mikroskop (Nikon TE 2000).
- Kontrollera att inloppet för perfusionssystemet och utlopp (för sugning) är precis ovanför ytan av täckglas.
- Börja perfusion med den lämpliga extracellulära lösningen (tabell 5).
- För nyligen dissocierade vuxen CM, placera en kollagenbelagda täckglas i perfusionssystemet enligt ovan.
- Eftersom cellerna kommer att vara i lösning, svagt ersätta lösningen med extracellulär buffert.
- Med hjälp av den modifierade pasteurpipett (Figur 4), försiktigt resuspendera cellerna i den extracellulära buffert, ta en portion och placera den på täckglas.
- Låt cellerna fäster för 10-15 min innan perfusion som i 4.4.
- Back-fylla hela cell patch pipett med intracellulär buffert med hjälp av en Microfil (World precisionsinstrument, 28 G) nål. Se till att det inte finns några luftbubblor i spetsen på pipetten, knacka försiktigt för att låta luftbubblor flyter upp till surface av lösningen.
- Fäst fylld fläckpipetten till pipetten-hållaren, vilket säkerställer att det inte finns kontakt mellan mikroelektrod och den inre lösningen.
- Vi använder silverkloridelektroder, men ta hand om "chloriding" silvertrådar åtminstone en gång i veckan genom att sänka ner över natten i blekmedel.
- Sänk försiktigt ned pipetten i badet, se till att badet är nedsänkt hela tiden i badet / extracellulära lösning. Offset någon vätska junction potentialer vid denna tid. Stora junction potentialer kan vara ett tecken på försämrade silverklorid på elektroderna.
- Friska cylindriska vuxna CMs identifieras i mikroskop och centrerad i synfältet. Såsom tidigare beskrivits, en kombination av rörliga mikromanipulator och justering av fokus medger närhet av patch-pipetten och ytan av GH.
- När de är i samma fokalplanet, använder vi en kombination av visuellsering av cellen och testpulsen (finns i Axopatch 200B).
- När resistansen hos pipetten minskningar i halv (vilket tyder på att pipetten är i kontakt med ytan hos cellen), och cellen fortsätter att se cylindrisk, etablera vi gigaohm tätningen med varsam sugning.
- För CMS, föredrar vi mun sug att etablera undertryck. Om en gigatätning framgångsrikt erhållas, återigen använder vi mild rytmisk mun sug till "break-in" till cellen att etablera hela cell patch-läge.
- Typiska vila potentialer friska CMs är i storleksordningen -85 till -90 mV. När en gigatätning erhålls, mäta vila membranpotential med hjälp av strömtång med I = 0 pA.
- Om den vilande membranpotentialen depolariseras detta kan indikera en skadad cell eller en dålig tätning.
- Eftersom CMS är stora celler med mycket yta, kräver noggrann uppmärksamhet ägnas åt kapacitans ersättning, speciellt whöna snabbt aktivera strömmar såsom natriumkanalen behöver studeras. Om inte kan erhållas tillräcklig kapacitans ersättning med hjälp av den inbyggda ersättnings inställningar på pulsgenerator, prepulses på sub-tröskelspänning och motsatt polaritet kan behöva tillämpas och den resulterande ström subtraheras från den inspelade signalen. Ett sådant protokoll är enkelt programmeras i Axopatch.
- När hela cell patch läget har fastställts, vänta 15 minuter för att möjliggöra jämvikt och för att säkerställa stabiliteten i tätningen före början spänning eller Tångprotokoll. Vi använder standardprotokoll som har beskrivits tidigare i denna och andra tidskrifter, och kommer inte att utvecklas vidare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isoleringen av vuxna cardiomyoctyes resultat i stavformade, strimmig, och vilande (icke spontant slående)-celler (Figur 5A). Döda celler kommer att se rundade och inga strimmor kommer att närvara. Vilande celler kan odlas och transfekteras med adenovirus för att manipulera genuttrycket (fig. 5B och 5C). Efter 24 h av kulturen, inte morfologin hos levande celler inte att förändras, är de fortfarande Ca2 +-tolerant, och de kan stimuleras genom fältstimulering. Med det föreslagna förfarandet, kan uppnås en avkastning på 80-90% levande celler.
För att mäta cellens kontraktilitet, tar systemprogramvaran MMSYS fasinformationen från mikroskopet antingen rapportera förändringarna i sarcomere eller cell längd. Visas i (Figur 7A) är en representativ kontraktilitet spår via sarcomere längdmätning av en vild typ C57BL6 mus. För friska vuxna mus myocyter frånse-möss, är baslinjen sarcomere längd ~ 1,7-1,9 um. Den MMSYS systemprogramvaran är kapabel att samtidigt mäta kontraktilitet och kalciumhantering genom att mäta förhållandet av det bundna till de obundna formerna av kalciumaktiverade färgämnet fura2-AM. Medan förhållandet åtgärder kan variera något mellan inställningar, för friska celler, är förhållandet vanligen mellan 1,5-2,5 (Figur 7B). Om MMSYS systemet har kalibrerats för kalcium, kan detta förhållande sedan översättas till ett absolut mått på den intracellulära kalciumkoncentrationen. För att analysera de data som genereras från kontraktilitet och kalcium spår, måste de spår som medelvärdet för att skapa en karakteristisk kurva för den cellen (figur 7C och 7D). De karakteristiska spår är sedan föremål för en monotransient dataanalys algoritm från MMSYS systemprogram som sedan genererar parametrar för systoliska och diastoliska funktion. Ytterligare detaljer finns i IonOptix manual.
Vuxen mus cardiomyocytes var också föremål för hela cell patch clamp experiment där aktionspotentialen spelades in i strömtång läge (Figur 8).
| Kroppsvikt (g) | Ketamin / xylazin (ml) |
| 15 | 0,18 |
| 20 | 0,25 |
| 25 | 0,31 |
| 30 | 0,37 |
| 35 | 0,43 |
| 40 | 0,49 |
| 45 | 0,55 |
| 50 | 0,62 |
Tabell 1. Vuxen mus Vikt beroende ketamin / xylazin Dosering (80:12).
| Lösning | Recept |
| Tyrodes buffert * (PH 7,4) | 1 L DDH 2 O 137 mM NaCl 4 mM KCl 1 mM MgCb 10 mM HEPES 0,33 mM NaH 2 PO 4 |
| Perfusionsbuffert * (PH 7,4) | 500 ml Tyrode buffert 10 mM D-(+)-glukos, minsta 5 mM taurin 10 mM butandion monoxim (BDM) |
| Enzym Buffer * | 50 ml perfusionsbuffert 0,024 g Kollagenas D (Typ IV) 0,018 g kollagenas B (typ II) 0,003 g Proteas XIV från Streptomyces griseus |
| Överföringsbuffert (A) | 45 ml perfusionsbuffert 5 ml bovint serumalbumin (från 5 mg / ml stamlösning) |
| Kalcium buffert (B) | 1 L Tyrode buffert 1,2 mM CaCb 5,5 mM D-(+)-glukos, minsta |
Tabell 2. Sex Cardiomyocyte Isolering Buffer recept.
| [CaCl] | Överföringsbuffert (A) | Kalcium buffert (B) |
| 0,06 mM Ca 2 + | 9,5 ml | 0,5 ml |
| 0,24 mM Ca2 + | 8,0 ml | 2,0 ml |
| 0,60 mM Ca2 + | 5,0 ml | 5,0 ml |
| 1.20 mM Ca2 + | 0 ml | 10 ml |
Tabell 3.Calcium titreringslösningen recept.
| Plätering Medium | Odlingsmedium |
|
|
Tabell 4. Bordläggningen och Kultur Media recept.
| Pipett Lösning | Bath Solution |
|
|
Tabell 5. Patch Clamp Solutions (lösningar som visas är för mätning av natriumströmmar).
Figur 1. .. Vuxen cardiomyocyte isolering instrument A) OptiVisor optiskt glas kikare förstoringsglas B) Vävnads tång, 5,5 i, 1x2 tänder -. Roboz Scientific C) Moloney pincett - 4.5 i (11,5 cm) lång svag kurva, tandad -. Roboz Scientific DE) Dumont # 3 Tång, Dumostar, spets storlek 0,17 x 0,10 mm. F) Packer Mosquito Tång 5 i Straight Flat -. Roboz Scientific G) Micro dissekera sax 4.5 i Böjd Sharp / Sharp -. Roboz Scientific H) Micro dissekera sax 3.5 i Straight Sharp / Sharp 20 mm -. Roboz Scientific I) 15 ml Falcon rör - Thermo -Fisher Scientific J) 60 mm petriskål med PBS K) Softsilk: Wax belagd flätat silke, 19 mm - Covidien L) Plast tratt, 6,0 cm i diameter M) nylonnät - 400 um porstorlek.....
Figur 2. Langendorff Apparatus. A) Hela Langendorff perfusion system som används för vuxen cardiomyocyte isolering. B) förstorad vy av den ihåliga, koniska glas uppsamlingstratt användes för att värma den kanylerade hjärta. C) Förstorad bild av icke-hypodermisk kanyle nål. (Åter Feeding nålar (24 G, rak, rund spets, 25 mm lång, Fine Science Tools Inc. punkt 18.061-24). D) Cirkulerande vattenbad E) Vattenbad för ruvning perfusion, enzym-och överföringsbuffertar.
Figur 3. Ett detaljerat schema av perfusionssystemet.
Figur 4. Modifierad pasteurpipett. Pipetten modifierades genom skärning av spetsen på en ca 45 ° vinkel. Detta möjliggör en större yta och skapar mindre skjuvspänning på cellerna eftersom de håller på att skiljas. Den infällda bilden visar en närmare bild av den modifierade spetsen.
Figur 5. Odlade och GFP transfekterade hjärtmuskelceller. A) Färskt isolat ed vuxna cardiomyocytes från en C57BL6 mus på 12 veckor. Pilarna pekar på döda eller döende celler. Dessa celler är mer rundad än den friska, stavformade vuxen CMS. B) GFP-transfekterade vuxen mus cardiomyoctyes efter 24 timmar av kultur. C) Odlade vuxen mus hjärtmuskelceller efter 24 tim. Infällda bilden visar ökad förstoring av odlade muskelceller.
Figur 6. . MMSYS systemet kammar Blå pilar representerar flödet av perfusion buffert (buffert B) A) Enkel, rak lösning värmare -... Warner Instrument Corporation B) Ansluta kablarna från MMSYS systemet kammaren till MyoPacer fältet stimulator C) Platina elektroder för fältstimulering ligger i centrum av kammaren. D) Utflöde reservoar. E) Chamber klämmor i öppet läge.
Figur 7. Representativa MMSYS systemdata registreras för vild typ C57BL6 möss erhållna från Jackson Labs. A) MMSYS bas kontraktilitet spår. B) Kvoten av Ca2 +-bundet till Ca 2 inspelade +-obundna fura2-AM generera bas kalcium spår. Dessa spår motsvarar kontraktilitet mätningar i A). C) Genomsnittlig bas kontraktilitet spår som sammanställts av systemprogramvaran MMSYS i en karakteristisk kontraktilitet spår. D) Karaktäristisk kalcium spår sammanställts från basen spår i B). Analys av sammansatta spår gör det möjligt för forskare att generera surrogatparametrar för systoliska och diastoliska funktion. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 8. Patch clamp trace visar aktionspotentialen av en vildtyp vuxen mus cardiomyocyte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna rapport har vi beskrivit de tekniker som behövs för lyckad isolering och odling av vuxen CM från musen hjärta. Vår teknik medger efterföljande studie av CM-funktionen och retbarhet med användning av de ovan beskrivna metoderna. Den kritiska parametern för att studera funktionen hos vuxna CMS är hälsa och kvaliteten på den isolerade CM. Såsom beskrivits ovan är våra tekniker möjliggör för ett högt utbyte av funktionella celler som är mottagliga för manipulering av genuttryck med användning av adenovirala / lentivirala infektioner i odling och analys av cellulär retbarhet och kontraktil funktion.
En av de viktigaste parametrarna för isolering av funktionella vuxen mus CMS är exakt och snabb kanylering av hjärtat på den icke-injektionsnålen. Försiktighet måste säkerställas att aortan fäst till vänster kammare dissekeras till en tillräcklig längd för att möjliggöra enklare och snabbare kanylering av hjärtat. När kanyle than hjärta, är det också väsentligt att nålspetsen kvar i aorta ascendens och inte sträcker sig förbi aortaklaffen i vänster kammare för att möjliggöra effektiv perfusion av vävnaden via kranskärlen. I nästa avgörande steg är att säkra aortan till skaftet av nålen genom att använda en silkessutur. Suturen bör bindas på den uppstigande aorta, så att perfusionsbuffert flödar retrogradely i kranskärlen och vänster kammares kavitet men flödar inte antegradely ut genom den distala änden av det dissekerade aortan eller de stora kärlen.
Vissa forskare vara till hjälp att skapa en tryckmätare för att bedöma kvaliteten på den kanyle och efterföljande perfusion av enzymet. Vid användning av en tryckmätare, bör den initiala vänsterkammartrycket vara ~ 80 - 100 cm H2O, och efter perfusion med enzymet, kommer trycket att minska till ~ 40-50 cmH 2 O. När kammartrycket når denna punkt, är detmest sannolikt redo att vara som skall skäras från nålen. För att säkerställa att kamrarna är väl smält, kan några droppar av genomflödet samlas underifrån hjärtat i en petriskål och kontrolleras för att se om några levande, vilande celler är närvarande.
De resulterande isolerade celler från detta förfarande lämpar sig väl för immunocytokemi. Behövs ibland för att bilden cytosoliska proteiner eller proteinstrukturer De kan fästas med vanliga fästmetoder 29 (dvs. formalin, paraformaldehyd, iskall metanol eller aceton), men en högre nivå av permeabilisering än används normalt för neonatal cardiomyoctyes (dvs. alfa- sarkomeriskt aktin-, beta-myosin). Slutligen kan cellerna odlas och därefter infekterade med adeno-eller lentivirus att manipulera genuttryck, eller användas för funktionella analyser av cell kontraktila apparaten.
Kultur av vuxen mus CM har länge beskrivits somutmanande. Med hjälp av den teknik som beskrivs här, kan vi rutinmässigt kultur dessa celler för upp till 72 timmar, även om avkastningen av funktionella celler minskar markant efter 36 timmar. Vid odling av cellerna, är det viktigt att cellerna pläteras vid 37 ° C i 2% CO2. Detta skiljer sig från neonatal CM, som föredrar att odlas vid 10% CO2 för den första 24 timmar och sedan bytte till 5% CO2, eller neonatal hjärt fibroblaster, som också föredrar 5% CO2. Pläteringen och odlingsmedia kan jämviktad så att den upplösta CO 2 är 2%.
Cellerna utströks på laminin-belagda täckglas, så att de inte lyfta från glaset när mediet byts. Men de hjärtmuskelceller inte bifoga mycket säkert att glaset även med laminin beläggning. Det är därför mycket viktigt att försiktighet iakttas vid byte av odlingsmedium, med hjälp av sterila pipetter, och inte en vakuumutsugningssystem. När cellens är pläterade, kan de transfekteras med adenovirus genom inkubering av viruset i högst två timmar. Tidpunkten beror på titer av viruset och proteinet är överuttryckt, så vi rekommenderar att genomföra preliminära experiment för att bestämma LD50 och ED50 för viruset. I de flesta fall använder vi en MOI av 20 till 100 för adenovirus. När cellerna har inkuberats med virus, tar uttrycket av målgenen (ar) typiskt ~ 24-36 timmar.
Isolerade celler som stryks ut på täckglas av lämplig storlek för MMSYS systemet kammaren kan också analyseras för kontraktilitet och kalciumhantering använder MMSYS avbildningssystem. Dessa täckglas direkt kan placeras in i kammaren, och odlingsmediet kan avlägsnas genom att vrida på perfusionssystemet. Om cellerna inte är som odlas och används för analys direkt efter isolering, kan de tillsättas direkt till kammaren när ett täckglas har placerats. Medanär det inte nödvändigt att i förväg belägga täckglas med laminin vid analys av nyligen isolerade celler, enligt vår erfarenhet, laminin hjälper cellerna bättre hålla sig till täckglas. Med hjälp av ett långsamt flöde för MMSYS enheten dessutom ser till att cellerna förblir fäst på täckglas. Slutligen måste optiken i mikroskop, särskilt objektiv vara noggrant rengöras före varje experiment för att möjliggöra noggrann visualisering av sarkomerer som behövs för bedömning av kontraktilitet.
Den mest avgörande komponenten i MMSYS systemet är den enda in-line vätskevärmare som värmer perfusionsbuffert (B) som rinner in i kammaren. Den termogena inslag i denna del av utrustningen är utformad för att utbyta värme med passerande vätska genom konvektiv värmeöverföring, så om flödet är frånvarande, kommer växlaren överhettas och kan ohjälpligt skada systemet. Det är därför viktigt att värmaren slås på först efter det att flödet initieras.
Andra metoder för att analysera den kontraktila apparaten i vuxna cardiomyocytes har tidigare beskrivits, inklusive sofistikerade metoder med användning av atomkraftsmikroskopi 30-32. Några av dessa metoder innebär en mer sofistikerad mätning av lokaliserad kontraktila kraften och egenskaper såsom Youngs modul, vilket gör dem mer lämpade för mätning av oregelbundet formade celler eller celler utan tydliga sarkomeriskt system såsom CMs härledda från inducerade pluripotenta stamceller. Dessa tekniker kan vara lika enkelt användas på isolerade vuxna CM. Fördelen med MMSYS system är den relativt lätt att mäta kontraktilitet och förmågan att mäta ett stort antal celler i en kort tidsperiod i celler med klart definierade sarkomerer. Dessutom är mjuk-kant-och sarcomere analyssystem som kan mäta längden på cellen eller längden mellan sarkomerer respektive möjliggöra två olika (men rupprymd) metoder för att mäta kontraktilitet. Den datainsamling programvara i kombination med den avancerade, användarvänliga analys programvara gör systemet lätt att lära sig och använda. Slutligen har förmågan att mäta kalcium dynamik samtidigt möjliggör korrelation mellan kontraktilitet och kalciumhomeostas, vilket inte är möjligt med atomkraftsmikroskopi. Också, eftersom datautgången är en ratiometrisk mått på en kalcium-aktiverad färgämne (fura2-AM), med rätt kalibrering, absoluta mått på interna kalciumkoncentrationer kan samlas.
Framgångsrik registrering av jon kanalsignaler från vuxna cardiomyocytes kräver cellerna vara i optimalt skick. Omedelbart efter isolering och plätering av cellerna de inte är vidhäftande och kommer att flyta i lösning, i detta skede kan de inte läsas. Inom några timmar de kommer att hålla sig till ett belagt täckglas och det är på denna punkt att de kan studeras. Enligt vår erfarenhet lappning inom några få timmar efterbordläggningen ger ett optimalt resultat, så att vänta för länge negativt påverkar cellerna. Som beskrivits ovan, testa vila membranpotential efter upprättande av en gigaohm tätning och bryta in i cellen, liksom förmågan att etablera en gigaohm tätning i sig är två parametrar som beskriver hur friska cellerna vid tiden för lappning. Även om det är lättare att lappa på celler som inte är upphandlande, detta är inte en förutsättning, lämpliga tätningar kan erhållas på att slå celler också. De protokoll som används vid denna punkt beror på målen för patchkläm studien, med hjälp av Tångtekniker, kan spelas in spontana eller inducerade aktionspotentialer. Alternativt kan spänningslås användas för att studera specifika jonkanaler. Med tanke på den uppsjö av kanaler i membranet är sådana inspelningar utförs vanligtvis i närvaro av jon-kanalblockerare. Tetrodotoxin (TTX), är nisoldipin och cesium ofta används för att blockera natrium-, kalcium-och kaliumkanaler respektive although en mängd olika läkemedel har använts, och detaljer om deras användning har publicerats i stor omfattning. De flesta metoder innebär antingen inspelning strömmar före och efter tillämpningen av jon kanalblockerare och subtrahera strömmarna, och / eller blockerar bakgrundskanaler med lämpliga blockerare före inspelning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
| D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
| Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
| Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
| Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Tissue forceps, 5.5", 1x2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Forceps 5" Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Micro Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
References
- Chlopcikova, S., Psotová, J. Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart. Biomedical Papers. , (2001).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Ballou, L. M., Lin, R. Z. Rapamycin and mTOR kinase inhibitors. J. Chem. Biol. 1, 27-36 (2008).
- Brette, F., Orchard, C. T-Tubule Function in Mammalian Cardiac Myocytes. Circ Res. , (2003).
- Sakata, Y., Hoit, B., Liggett, S., Walsh, R. Decompensation of pressure-overload hypertrophy in G?q-overexpressing mice. Circulation. , (1998).
- Lieu, D. K., et al. Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).
- Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition. J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).
- Muthuchamy, M., et al. Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction. Circ. Res. 85, 47-56 (1999).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).
- Epstein, F., Hunter, J. Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure. New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).
- Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes. Cell Calcium. , (2007).
- Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).
- Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O'Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure. Circ. Res. 78 (2), (1996).
- Splawski, I., et al. Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia. Science. 297, 1333-1336 (2002).
- Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).
- Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition. Science. , (1998).
- Heinzel, F. R., et al. Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice. Circ. Res. 97, 583-586 (2005).
- Li, X., Heinzel, F. R., Boengler, K., Schulz, R., Heusch, G. Role of connexin 43 in ischemic preconditioning does not involve intercellular communication through gap junctions. J. Mol. Cell. Cardiol. 36, 161-163 (2004).
- Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
- Nakamura, A., Rokosh, D. LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).
- Boström, P., et al. A PGC1-?-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis. Nature. 481, 463-468 (2012).
- Liao, R., Jain, M. Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes. Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).
- Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture. J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).
- Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. -S. Methods in Molecular Biology. 689, Humana Press. 205-214 (2010).
- Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269 (2011).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936 (2008).
- Arman, A. C., Sampath, A. P. Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation. J. Vis. Exp. (43), e2107 (2010).
- Wen, H., Brehm, P. Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish. J. Vis. Exp. (45), e2351 (2010).
- Maier, S., Westenbroek, R. An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).
- Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy. Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).
- Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope. European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).
- Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Grütter, P. Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist. Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).
