Summary
우리는 우리의 마우스 이식 arteriosclerois (GA) 같은 근친 교배 균주의받는 사람에 마우스 선박 세그먼트의 개재를 포함 모델에 대한 프로토콜을 설명합니다. 용기 기증자에 추가 유전자 변화를 교잡에 의해, 모델은 GA에 특정 유전자의 효과를 평가할 수 있습니다.
Abstract
또한, 이식 혈관라고 이식 arteriosclerois (GA)은 전체 이식 혈관 트리의 확산, 원주 협착을 특징으로 장기 이식의 수 개월에서 수 년에 걸쳐 개발 병리학 적 병변이다. 조지아 발병의 가장 중요한 구성 요소는 내막에서 부드러운 근육과 같은 세포의 증식이다. 인간의 관상 동맥 세그먼트 면역 결핍 생쥐의 인프라 신장 aortae에 개재 될 때 intimas은 동맥 기증자 또는 외인성 인간 IFN-γ 인간 T 세포의 부재합니다.에 동종 adoptively 전송 인간의 T 세포에 대한 응답으로 확장 될 수있다 이 마우스 모델에서 급성 세포 성 거부 반응이 완전히, 둘, 셋 내에 이식에서 모든 기증자 파생 된 혈관 세포를 제거하기 때문에 다른 마우스 긴장 수신자로 한 긴장에서 마우스 대동맥의 개재는 인간의 만성 거부 반응에 대한 모델로 제한됩니다 주. 우리는 최근 두 개의 새로운 M을 개발했습니다이러한 문제를 회피하기 위해 모델을 여러개. 첫 번째 모델은 남성 마우스에서 동일한 근친 변형 (C57BL/6J)의 여성받는 사람에 혈관 세그먼트의 개재을 포함한다. 이 경우 이식 거부는 Y 염색체 (남성에 존재하지만 여성되지 않음) 몇 주 동안 기증자 파생 된 평활근 세포를 유지하기 위해 충분히 나태한입니다 벌어진다 것을 거부 반응에 의해 인코딩 된 작은 조직 적합성 항원에 대해서만 전달됩니다. 두 번째 모델에 대한 수용체 부족 같은 긴장과 성별의 호스트 마우스로 야생 유형 C57BL/6J 마우스 기증자로부터 동맥 세그먼트를 개재 포함 IFN을-γ 마우스의 투여에 의해 다음 IFN-γ (마우스의 감염을 통해 전달 아데노 바이러스 벡터 간. 기증자와받는 사람의 쥐가 모두 동일한 변형 및 성별 있지만 호스트 유래 세포에 대한 수용체가 부족한 상태 기증자 평활근 세포는 사이토 카인에 대한 응답으로 증식이 경우에는 거절이 없습니다이 사이토 카인은 응답이다. 용기 기증자에 추가 유전자 변화를 교잡으로 두 모델은 GA의 진행에 특정 유전자의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에, 우리는 우리의 마우스 GA 모델에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.
Introduction
또한, 이식 혈관라고 이식 arteriosclerois (GA)은 전체 이식 혈관 나무 7의 확산, 원주 협착을 특징으로 장기 이식의 수 개월에서 수 년에 걸쳐 개발 병리학 적 병변이다. 초기 단계에 따라서 더 밀접하게 기존의 죽상 동맥 경화증에서 볼 협착을 닮은 동맥에서보다 분명 편심 및 초점 협착의 원인이 될 수 있습니다. 때문에 호스트 T 세포와 대 식세포의 침윤에 특히 세포 외 기질의 축적과 부드러운 세포가 근육처럼에 내막 확대에 이식 혈관 결과의 루멘 손실이 부적절하게 보상 이식, 호스트 또는 둘 모두 5, 13, 19, 유래 외부 혈관 리모델링 있습니다. 심장 이식에서 가장 임상 적으로 중요한 병변은 심 외막 및 심근 내 관상 동맥에있는 사람입니다. 궁극적으로, 관상 동맥의 GA는 허혈성 심장 고장의 원인이 될 수 있습니다. GA 늦게 심장 GR의 주요 원인입니다선미 손실. GA의 협착 강하게 그 병인에 이식 alloantigens에 대한 호스트 응답을 고발하고 우리가 만성 거부 3의 형태로 GA를 분류하는 선도 봉합 라인을 중지합니다. 그러나 동맥 손상의 다른 형태의 손상의 순 부담 증가를 통해 또는 강화 및 / 또는 동종 응답 변조에 의해 하나, GA의 위험을 증가시킬 수 있습니다. 이식 동맥의 내피 세포 (EC) 안감은 인간 GA에 보존 EC 안감에 인접한 내막의 가장 피상적 지역은 가장 많이 IFN-γ 생산 T 세포와 대 식세포 11 호스트 파생에 의해 침투 사이트입니다;에 GA는 이식 EC 16 만 배에 바인딩 기증자 별 동종 항체의 개발과 관련된 일부 환자는 급성 항체 매개 성 거부 반응 11의 특징 인 섬유 양 괴사의 증거를 보여줍니다.
조지아 발병의 가장 중요한 구성 요소입니다내막에서 부드러운 근육과 같은 세포의 증식,이 과정을 체포 할 수있는 경우, GA는 진행하지 않을 수 있습니다. 우리 그룹의 이전 작업은 인간의 관상 동맥 세그먼트의 intimas은 면역 결핍 생쥐는이 과정 동맥 기증자 동종 adoptively 전송 인간의 T 세포에 대한 응답으로 그 확장의 인프라 신장 aortae에 개재하는 표시했다 인간의 중화에 의해 억제 될 수 IFN을 γ 18. 또한 외생 인간 IFN-γ (그리고 중간) 인간의 T 세포 15, 17의 부재에서 이러한 동맥 이식 혈관 평활근 세포 (VSMC)이 증식 내막이 발생할 수 있습니다. (그것은주의하는 것이 중요합니다 인간 및 마우스 IFN-γ가.이 실험 시스템에서 마우스 호스트에 간접적 영향을 배제 종을 통과하지 않음) 이러한 인간화 마우스 모델은 인간의 T 세포 / 혈관 세포 상호 작용을 요약표의 이점을 가지고 내막 병변은 주로 인간 (즉, 이식 - 파생) 세포로 구성되어있다로 임상 검체에서 관찰되었다, 그러나 임상 이식 병변에 관련된 호스트 대식 그리고 아마도 다른 세포 유형의 역할을 무시하기 때문에 그들은 완전히 임상 상황을 요점을 되풀이하지 않습니다. 이 과정에서 기존의 마우스 모델은 이론적으로 완전한 호스트 면역 체계를 포함하고 조지아에 적용 할 수있는 마우스 유전자 접근 방식의 전원을 허용하는 추가적인 이점을 제공함으로써 인간 답게 된 모형의 한계를 보완,이 문제를 해결 할 수 있습니다. 두 가지 가장 널리 사용되는 마우스 모델은 이소성 심장 이식과 동소 동맥 이식 1을 포함하고 있습니다. 인간의 심장 이식에있는 동맥의 내막 세포가 이식 기원 5, 13, 19 주로 반면 이소성 심장 이식의 동맥에서 발전 병변은 크게 골수 유래의 가능성이 숙주 세포의 구성됩니다. 이것은 우리가 다른 마우스 모델을 개발하게되었다 중요한 구별이다. 의 개재이 마우스 모델에서 급성 세포 성 거부 반응이 완전히, 둘, 셋 내에 이식에서 모든 기증자 파생 된 혈관 세포를 제거하기 때문에 다른 마우스 긴장 수신자로 한 긴장에서 마우스 대동맥은 인간의 만성 거부 반응에 대한 모델로 더 제한되는 주 19. 따라서, 개재 혈관 세그먼트에서 본 이후의 변경은 병원에서 발생하는 이식 혈관의 변화에 대한 모델로 제한된 관련성이 높은 인공적인 상황을 만들어 decellularized 용기 발판을 채워가 숙주 세포의 유일 반응이다. 우리는 최근에 이러한 문제에게 21을 회피하기 위해 두 개의 새 마우스 모델을 개발했습니다. 첫 번째 모델은 남성 마우스에서 동일한 근친 변형 (C57BL/6J)의 여성받는 사람에 혈관 세그먼트의 개재을 포함한다. 두 번째 모델은 REC 부족 같은 긴장과 성별의 호스트 마우스로 야생 유형 C57BL/6J 마우스 기증자로부터 동맥 세그먼트를 개재 포함에 대한 eptor IFN-γ (IFN-γR-KO)는 마우스의 투여에 의해 다음 IFN-γ (아데노 바이러스 벡터와 마우스 간 감염을 통해 전달했다. 여기, 우리는 상세한 프로토콜과 우리의 마우스 GA 모델의 장점을 설명합니다.
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Protocol
마우스 이식 및 동계 이식 이식 모델
모든 동물 연구는 예일 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 동종 모델, 남성 4-5 주 이전 WT (C57BL/6J) 또는 IFN-γR-KO 생쥐에서 흉부 대동맥의 세그먼트는 엔드 - 투 사용하여 여성 수신자 8-12 주 오래된 WT의 복부 대동맥에 개재되었다 엔드 미세 문합 기술 (자세한 내용은 다음을 참조하십시오). 동계 이식 모델, 남성 4-5 주 오래된 WT 생쥐에서 흉부 aortae의 세그먼트가 남성의 복부 aortae에 개재 된 오래된 8~12주는 IFN-γR1-KO는 엔드 - 투 - 엔드 미세 문합 기술을 사용. 수술 후 1 주, 동물은 1 × 10 9 PFU에서 Ad5.CMV 마우스 IFN-γ 또는 Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene)와 IV를 접종 하였다. 혈청 마우스 IFN-γ 농도가 1에서 ELISA (eBioscience)로 측정되었고, 오주 아데노 바이러스 투여 후. 일부 동물은 BrdU의를 받았다희생로부터 2 주 (시그마 - 알드리치) 100에서 MG / kg SC.
엔드 - 투 - 엔드 미세 문합 기술 (비디오가이 부분에 대해 수행됩니다) :
1. 기증 절차
- 케타민 (50 mg / kg)과 xylazine (10 MG / kg)를 복강 내 주사 기증자 마우스를 마취.
- 적절한 마취를 확인한 후 앙와위에서 트레이 X8-30 배율에서 운영 현미경 기증자 마우스를 배치하고 가슴 벽 준비를 위해 요오드 준비 패드 알코올 준비 패드를 사용합니다.
- 갈비와 마음을 노출하는 격막을 통해 전방 흉벽을 절개.
- 우심방을 열고, 25 게이지 바늘로 10 ML 주사기를 사용하여 마우스를 플러시 좌심실로 헤파린의 10 ㎖ (100 U / ML) 생리 식염수를 주입.
- 흉부 대동맥의 전체 길이를 노출하는 심장과 폐를 절제.
- 직접 외상, 간편하게 조절할를 최소화하기 위해 조심스럽게 흉부 대동맥 해부전자 식별, 결찰 및 대동맥 근처 11-0 봉합사를 사용하여 목재 가지를 나눕니다.
- 일단 흉부 대동맥 주위 조직 이식에 대한 소비세 전체 흉부 대동맥에서 무료입니다.
- (100 U / ML) 헤파린 생리 식염수와 기증자의 대동맥의 단면을 세척하고, 이식까지 얼음에 동일한 솔루션 (최대 6 시간)에 저장합니다.
2. 받는 절차
- 진통제의 IP 케토 프로 펜 (5 ㎎ / ㎏)를받는 쥐를 주입, 및 IP 케타민 (50 mg / kg)과 xylazine (10 MG / kg)과 쥐를 thenanesthetize. 받는 사람 마우스는 60 ~ 90 분의 시간을 10 분 안에 깊이 마취 있습니다. 수술 중 마취의 수준은 집게를 사용하여 전방 복부 벽이나 발을 곤란하게하여 매 15 분을 평가합니다. 동물이 수술하는 동안 언제든지 유해 자극에 반응하는 경우 마취제와 xylazine (1 / 4 또는 1 / 3 원래 용량)의 추가 투여가 SC 또는 IM에 의해 관리 될 것입니다
- 적절한 마취를 확인한 후, 전기 면도기를 사용하여 전방 복벽에 모피를 면도, 요오드 준비 패드 알코올 준비 패드를 사용하여 피부를 깨끗하게 안과 연고를 사용하여 눈을 포함한다. 수술하는 동안 다음과 같은 무균 기술은 10 % 표백제로 운영 테이블을 청소 멸균 장갑을 착용하고 멸균 미세 악기 (작업의 시작을위한 증기 멸균 악기, 그 뜨거운 유리 구슬 소독 사용 등의 작업에 사용됩니다 여러 작업 등) 사이에 악기.
- 앙와위에서 트레이 X8-30의 배율 운영 현미경받는 마우스를 놓습니다.
- xyphoid에서 치골에 정중선에서 복부 벽을 절개하고 복강을 노출 마이크로 견인기를 사용하여 분리 복벽을 확산.
- 우량 내장을 철회하고 거즈로 감싸은 생리 식염수에 적신. 받는 생쥐 헬스의 손실에 의해 냉각 될외부화 된 창자를 통해 t. 그것은 동물의 따뜻함을 유지하는 것이 중요합니다. 겸손 저체온 대동맥 혈류의 폐색뿐만 아니라 마우스 본체의 아래쪽에 결석 혈액의 흐름이 비효율적 인 열전달이 중 척추 부상을 방지하는 효과입니다 그러나, 가열 보드는 수술 중에 사용되지 않습니다.
- , 하측 생식 기관을 이동 식염수 솔루션 적신 거즈로받는 생쥐의 복부 영역을 래핑하고, 복부의 오른쪽에 직장을 철회하는 데 사용합니다. 노출 된 조직을 이식하는 동안 식염수 주기적으로 관개하고 있습니다.
- 원심 퉁명스럽게 신장 근위 혈관과 대동맥 분기 사이 infrarenal 대동맥의 세그먼트를 해부하고 신중하게 대정맥 (IVC)에서 분리합니다.
- 식별 및 11-0 폴리 아미드 모노 필라멘트 봉합사를 사용하여 복부 대동맥의이 세그먼트에서 발생하는 작은 가지를 모두 결찰.
- 의 교차 클램프 고립 된 세그먼트떨어져 proximately 5mm, 각 끝에서 두 가지 혈관 클램프를 사용하여 bdominal 대동맥.
- 문합 사이트를 만들 날카로운 마이크로 가위를 사용하여 클램프 사이의 복부 대동맥을 절개.
- 기증자의 대동맥 이식을 수용 할 수 그었받는 사람 대동맥의 한 단면에서 복부 대동맥 (길이 최대 0.4 mm)의 작은 부분을 잘라 내다.
- 잔여 혈액을 제거하는 헤파린 생리 식염수를 사용하여 클램프 사이의 대동맥 세그먼트를 세척합니다. 클램프 및 기증자의 대동맥 이식편 사이의 대동맥 세그먼트는 문합 동안 헤파린 (100 U / ML) 생리 식염수 (40 ML / kg)를 정기적으로 관개하고 있습니다.
- 이식을위한 길이 2.5 mm의 세그먼트 이식을 만드는 날카로운 마이크로 가위로 기증자의 대동맥의 양쪽을 절개.
- 최종 T로, 각각 동소 위치, 복부 대동맥받는 사람의 근위 및 원위 단면에 합한다 기증자 이식의 근위부와 말단부에 기증자의 대동맥 이식을 배치11-0 폴리 아미드 모노 필라멘트 봉합사를 사용하여 O 엔드 패턴입니다.
- 연속 봉합의 경우, 숙박 3에서 봉합 첫째 9시 위치를 배치합니다. 이식의 각 측면에 두 개의 숙박 봉합 사이에 합한다 컷 실행 봉합을 사용하여 3-4 바늘의 가장자리, 둘 다 두 배 매듭 봉합을 유지하는 실행 봉합을 묶어. 폐쇄 두 층이 연속이기 때문에, 열개의 위험이 증가합니다. 기증자의 대동맥 이식은 복부 대동맥받는 사람의 근위 및 원위 단면을 연결하는 적당한 길이에 있어야합니다.
- 중단 된 봉합사를 들어, 3 4 개의 문합을 구성하고 첫째 이식의 양쪽의 9시 방향과 이식의 각 측면에 두 개의 숙박 봉합 사이 3-4 바늘을 모두 잘라 가장자리를 합한다.
- 이식에 역행 흐름을 허용하는 말초 클램프를 풀고 출혈이 사이트를 식별 3 분 이내에 추가로 바늘을합니다.
- 만족 지혈을 판명 한 후, 근위 클램프를 해제.
- 복부 대동맥 및 하부 장간막 동맥의 원위부 인접 분절에 특히 이식 활발한 맥동의 존재와 네이티브 복부 대동맥의 근위 인접 분절에 의해 이식 개통을 확인합니다. 맥동 혈류 복원 후 몇 분 이내에 감소하는 경우 문 합부 사이트에 혈전증을 고려하십시오.
- 복강 내장을 반환합니다.
- 각각의 근육 층과 피부 층에 5-0 나일론 봉합사를 사용하여 복벽을 닫습니다 봉합.
- 가열 패드의 상단에 깨끗한 케이지에받는 마우스를 놓고 의식을 회복하고 마취에서 회복하기 위해 마우스 1-2 시간을 기다립니다. 그것은 복구하는 동안 동물의 적절한 온기를 유지하는 것이 중요합니다. 마취에서 동물 웨이크 전에 따뜻하고 건조 케이지의 쥐를 유지합니다.
- 마우스 복구 후, 다시 두 번째 날 뒷다리의 운동 기능을 평가합니다. 성공적인 이식 수술이 확인 될 것입니다 IF 뒷다리의 어떠한 장애는 두 번째 날에받는 생쥐에서 관찰되지 않습니다.
- 마시는 물 케토 프로 펜과받는 사람의 쥐를 관리 (5 ㎎ / ㎏ / D = 27 UG / 마시는 물에 ML) 48 시간 동안. 신랑, 이상 모여서 자세 등으로 이동성, 실패의 손실에 의해 입증받는 사람 마우스는 수술 후 진통제에 의해 누그러 통증으로 고생하는 경우, 그들은 안락사 될 것입니다. 동물 1-60일 후 미리 정의 된 엔드 포인트에서 안락사 될 것입니다.
이식 분석
이식에있는 동맥 이식은 (5 주 바이러스 감염 후) 육주 후 수술이었다 동계 이식 모델 4 주 및 이식에서 조달하고 Elastica 밴 Gieson (EVG) 염색, 헤 마톡 실린과 에오신 (HE) 표준 조직 학적 기법으로 분석 하였다 염색 및 면역 형광 염색법. 사진은 면역 형광 현미경 시스템 (혈구)를 사용하여 촬영 하였다. 긍정적 인 면역 염색으로 둘러싸인 핵의 세포 계산이 수행되었다높은 배율에 따라 ED와 각 접목을위한 5 단면에서 평균. 루멘 (내피 이내), 내막 (내피와 내부 탄성 얇은 판 사이 IEL), 미디어 (IEL와 외부 탄성 얇은 판 사이 EEL), 두께 (내피와 외부 탄성 얇은 판) 사이의 이식 면적 측정 및 전체 용기 (EEL 이내) 컴퓨터를 이용한 영상 분석 및 NIH 이미지 1.60 (사용하여 각 이식을 위해 떨어져 5 시리얼 크로스 섹션, 150 μM에서 계산 된 http://rsbweb.nih.gov/nih-image을 ).
통계 분석
모든 자료는 평균 ± SEM을로 표현됩니다. 양측, 쌍 t 테스트와 양방향 ANOVA 분석은 프리즘 소프트웨어 프로그램 (GraphPad 소프트웨어)를 사용하여 수행 하였다. P <0.05로 차이는 통계적으로 유의을 나타내는 것으로 간주 하였다.
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Representative Results
마우스를 이식 동맥 경화증 (GA) 모델 :이 모델에서는 남성 기증자의 대동맥 호스트에 표현 사소한 Y 항원 (남성 특정 작은 조직 적합성 항원 HY)에 alloreactive T 세포 매개 동종 반응을 유도하도록 여성의받는 사람에 이식되어 이식 12 차례 차례로 T 다른 동종 이식 모델 2에서 관찰로 IFN-γ 드라이브 VSMC 확산 20, 6, 8-10, 14 셀 생산. 기증자 남성의 흉부 대동맥의 세그먼트는 수술 여성받는 사람의 복부 대동맥에 개재되고, 대동맥은 사주 이식 후 (그림 1A)에서 수확했다. 동맥 이식의 조직 학적 분석은 Elastica 밴 Gieson (EVG), H & E에 의해 수행 VSMC 마커 SMA 및 팬 백혈구 마커 CD45과 면역 염색 하였다. 더 이식 거부는 대동맥 이식 C57BL/6J 수컷 생쥐 사이에서 관찰되지 않았다. 여성 transplantat 남성백혈구와 VSMC의 축적 (그림 1B)와 평활근 형성의 침윤을 특징으로 이온에 의한 GA. WT 또는 IFN-γR-KO 생쥐 GA, 대동맥에서 IFN-γ 신호의 역할을 결정하는 것은 WT 여성의받는 사람에 이식 하였다. 기증자 이식에 IFN-γR의 삭제는 WT (미도시)에 비해 SMA 양성 세포의 감소와 백혈구 및 평활근 형성의 감소 침투를 보였다. 이전 인간화 마우스 이종 이식 모델 4, 15, 17, 18에서 관찰 이러한 결과는 GA 진행에서 IFN-γ 신호를위한 중요한 역할을 지원합니다.
IFN-γ에 의한 이식 동맥 경화 : 그것은 IFN-γalone는 인간화 마우스 GA 모델 15, 17 평활근의 형성을 유도하기에 충분한 것이 설립되었습니다. 여기에서 우리는 IFN-γ-매개 마우스 동계 이식 동맥 경화 모델을 설립했다. 이 모델에서, WT 남성의 대동맥을 이식 하였다마우스를 인코딩 IFN-γ 유전자 (광고 IFN-γ) 또는 제어 LacZ 유전자 (광고 LacZ) (그림 2A). 복제 결핍 아데노 바이러스의 정맥 주사 한 다음 IFN-γR 결핍받는 생쥐에 광고 LacZ의 간 감염 및 간 유전자 발현은 광고 LacZ 그룹에서 X-GAL 염색에 의해 확인 만하지 않기 광고 IFN-γ 그룹은 이전 17 설명했다. 의 전신 발현 IFN-γ는 혈청 120-150 NG / 일 3 ML의 수준에서 감지되고의 5 주까지 유지 광고 IFN-γ하지만 LacZ 군합니다. 대동맥은 오주 학적 분석과 동맥 이식 내막, 미디어, 루멘 및 혈관 영역의 형태 학적 평가를위한 아데노 바이러스의 후 분사에 수확 하였다. 의 발현 IFN-γ,하지만 LacZ 제어, 유도 내막 형성. 백혈구의 명백한 침투가 이식 모델 (그림 2B)에 비해 검출되지 않았다. 이 자료는 이전과 일치혼자 IFN-γ는 평활근의 형성 15, 17를 유도하기에 충분한 것이 인간화 마우스 이종 이식 모델에서 관찰.
그림 1. 그림 및 마우스 동종 동맥 이식 모델의 구조. 동종 이식 절차의 대답입니다. 기증자 남성 흉부 대동맥의 세그먼트는 수술 여성의받는 사람으로 복부 대동맥에 개재되었다. 대동맥은 사주 후 이식에서 수확했다. 컨트롤로, 남성 기증자 흉부 대동맥의 세그먼트는 수술 남성받는 사람의 복부 대동맥에 개재되었다. B는. Elastica 밴 Gieson (EVG), H & E 및 안티-SMA 및 안티 CD45에 면역 염색에 의한 동맥 이식의 조직 학적 분석. 대표 현미경 사진이 표시됩니다. 화살촉 미디어의 내막을 묘사하는 내부 탄성 얇은 판 표시합니다. 규모막대기 : 50mm. 더 이식 동맥 경화증은 남성 그룹 남성에서 관찰되지 않았다.
그림 2. IFN-γ에 의한 마우스 동계 동맥 이식 모델. A. IFN-γ에 의한 마우스 동계 모델의 구조. 남성 기증자 흉부 동맥 남성받는 사람 IFN-γR KO 마우스의 해부 및 복부 대동맥에 이식되었다. 일주일 후 수술은, 1X10 9 PFU 광고 mIFN-γ 또는 광고 LacZ가 정맥을 통해받는 생쥐에 주입했다. 혈청은 3 일, 7, 35 IFN-γ 측정을위한 바이러스의 주입 후에서 수집되었다. 이식은 형태 학적 평가에서 6 주 수확 하였다. B는. 안티-SMA 및 안티 CD45에 면역 염색에 의한 동맥 이식의 조직 학적 분석. 대표 현미경 사진이 표시됩니다. 화살촉 미디어의 내막을 묘사하는 내부 탄성 얇은 판 표시합니다. 규모 나AR : 50mm. 더 이식 동맥 경화는 LacZ 그룹에서 관찰되었다.
| 단계 | 문제 | 가능한 이유 | 해결 |
| 2.17 | 심한 출혈 | 간격 (두 바늘 사이의 거리)는 중단 봉합 특히 너무 큽니다. | 매 2 바늘 사이의 거리 문합 동안 균일해야한다. 사이트를 출혈에 하나의 스티치를 추가합니다. |
| 만 외막을 물렸다. | 식별 및 전체 대동맥 벽 바느질 | ||
| Unligated 목재 가지 | 목재 가지를 결찰 | ||
| 너무 많은 헤파린을 사용하여 | 4까지 사용0 ML / kg 헤파린 (100 U / ML) 문합 동안 수술 필드를 관개하기 위하여 생리 식염수. | ||
| 2.19 | 혈전증 | 루멘 연속 봉합의, 특히 문합 사이트에서 너무 좁은 것입니다. | 각 스티치에 너무 많은 대동맥 벽 anastomosing하지 마십시오. 쥐의 대동맥의 크기가 매우 작습니다. 문합 동안 스티치에 너무 많은 대동맥 벽 그러나, 스티치 너무 적은 대동맥 벽에 심한 출혈이 발생합니다, 루멘 좁은 혈전증의 원인이됩니다. |
| 반대편에서 대동맥 벽을 통해 봉합 전달합니다. | 대동맥 벽을 확인하고 바늘을 만들기. 그 일이 일어 났을 경우, 운영자는이 사이트에 봉합 매듭을 다시 스티치를 차단해야합니다. | ||
| 내피 세포는 문합 중에 부상하고 있습니다. | 문합을위한 숙박 봉합을 사용하여. 용에 의해 전체 arotic 벽을 짜 / 잡지 마십시오문합에 대한 산새. | ||
| 헤파린은 문합 동안 사용되지 않습니다. | 쥐의 대동맥의 크기가 매우 작습니다. 그것은 문합 후 이식편의 혈전 형성에 매우 간단합니다. 수술 필드를 관개하기 위해 헤파린을주는 것은 혈전증을 감소시키기를 위해 매우 중요합니다. 생쥐의 혈관 이식의 성공률은 헤파린을 사용하지 않고 50 % 헤파린를 사용하여 95~100%입니다. 혈전증은 몇 분 이내에 발견되면 혈액의 흐름, 혈전을 제거하는 다른 방법으로 복원 후에 IVC를 통해 30-50 UL heparinied 생리 식염수 (100 U / ML)를 주입하는 것입니다. 다만 심한 출혈의 경우 너무 많은 헤파린을 주입하지 마십시오. | ||
| 2.23 | 이식 실패 | 지연 출혈과 혈전증, 또는 다른 사람 | 쥐의 대동맥 크기가 매우 작에 대한 생쥐의 혈관 이식은 매우 어려운 수술입니다. 세 가지 주요 POI가있다성공적인 수술을위한 NTS : 1) 호스트와 기증자의 대동맥 벽이 단지 심한 출혈의 경우에는 분명히 차이없이 함께 문합되어 있는지 확인합니다, 그냥 혈전증의 경우, 문 합부 사이트에서 충분한 루멘 공간을 유지 2), 3)을 사용 문합 동안 오른쪽 선량 헤파린, 혈전증, 심한 출혈 단지의 경우. 이 프로토콜에 따라, 저자의 성공률은 95 % 이상이다. |
표 1. 테이블을 문제 해결.
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Discussion
설명 프로토콜은 마우스 GA 모델에 초점을 맞추고있다. 절차는 다른 이식 이식 모델에 적용 할 수 있습니다. 이러한 모델은 인간 답게 이종 이식 (즉, 인간의 관상 동맥 세그먼트 면역 결핍 생쥐의 인프라 신장 aortae에 개재), 그리고 급성 거부 마우스 GA 모델 (즉, 다른 유전자 변형 수신자로 한 유전자 변형에서 마우스 대동맥) 이용하실 수 있습니다. 우리의 기술 마우스 모델은 인간 GA 병변을 닫으 더 있습니다. 첫 번째 모델은 남성 마우스에서 동일한 근친 변형 (C57BL/6J)의 여성받는 사람에 혈관 세그먼트의 개재을 포함한다. 이 경우 이식 거부는 Y 염색체 (남성에 존재하지만 여성되지 않음) 몇 주 2, 6을위한 기증자 파생 된 평활근 세포를 보존하기 위해 충분히 나태한입니다 벌어진다 것을 거부 반응에 의해 인코딩 된 작은 조직 적합성 항원에 대해서만 감독 , 8-10, 12, 14. 두 번째 모델은 동맥 segme을 개재 포함IFN-γ (IFN-γR-KO)에 대한 수용체를 부족 같은 긴장과 성별의 호스트 마우스에 야생 유형 C57BL/6J 마우스 기증자 NT는 마우스의 투여에 의해 다음 IFN-γ (마우스의 감염을 통해 전달 아데노 바이러스 벡터 간.)가 기증자와받는 사람의 쥐가 모두 동일한 변형 및 성별 있지만 호스트 유래 세포,이 사이토 카인에 대한 수용체가 부족한 상태 기증자 평활근 세포는 사이토 카인에 대한 응답으로 증식이 경우에는 거부하지 않습니다, 21 응답입니다. 또한, 용기 기증자에 추가 유전자 변화를 교잡하여, 두 모델은 IFN-γ 중심 평활근 세포의 증식과 GA의 진행에 특정 유전자의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
마우스 GA 모델에서 IFN-γ의 역할은 잘 확립되지 않았습니다. 우리 두 마우스 모델 마우스 GA에서 IFN-γ의 역할을 확인했습니다. 첫 번째 모델에서, 남성 기증자의 대동맥 여성의받는 사람에 이식되어호스트는 이식 12에 표현 남성 특정 작은 조직 적합성 항원 HY에 alloreactive T 세포 매개 동종 반응을 유도하도록. 사실, C57BL/6J 여성의 이식에 의한 GA에 WT (C57BL/6J) 남성, 백혈구 및 VSMC 축적과 평활근 형성의 침투에 의해 특징. 반면, 남성 대동맥 이식 남성 GA를 유도하지 않습니다. 우리의 역할을 결정 IFN-γ를 WT 여성의받는 사람에 이식 기증자 이식으로 IFN-γR-KO를 사용하여 혈관 세포에서 신호. 기증자 이식에 IFN-γR의 삭제는 평활근에서 백혈구 침윤 VSMC 축적을 무디게. 따라서, 현재의 마우스 모델에서 IFN-γ의 역할은 인간 답게 된 마우스 이종 이식 이식 모델과 일치입니다 IFN-γ 이식에 신호하는 GA 진행 4, 15, 17, 18 중요합니다. IFN-γ 형은 IFN-γ-메디을 작성하여 평활근의 형성을 유도하기에 충분한 경우에 우리는 결정ated 마우스 동계 이식 동맥 경화 모델. 이 모델에서, 남성 대동맥 남성 IFN-γR-KO받는 사람 동물에 이식되는 마우스 IFN-γ 후 체계적으로 IFN-γ 유전자 (광고 IFN-γ 마우스를 인코딩 복제 결핍 아데노 바이러스의 정맥 주사에 의해 표현된다 ). 우리는 IFN-γ,하지만 LacZ 제어, 유도 내막 형성의 발현을 관찰 하였다. 이 모델에서 백혈구의 명백한 침투는 동종 모델에 비해 혼자 혈관 IFN-γ 신호는 백혈구의 부재에서 평활근의 형성을 유도하기에 충분있는 인간의 동맥 SCID 마우스 이식 모델에서 이전 관측과 일치 검출되지 15, 17.
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Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 작품은 WM과 LY에 AHA 9320033N에 NIH 보조금 R01 HL109420에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks) |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml) |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml) |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml) |
| Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) | CareFusion | AL4109 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | To prepare the anesthetic |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Microscope | Leica | MZ95 | |
| Micro Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5693 | |
| Spring Scissors | F.S.T | 15009-08 | To transect the aorta of donor or recipient |
| Extra Narrow Scissors | F.S.T | 14088-10 | |
| Needle Holder/Forceps | MICRINS | MI1542 | To hold the needle |
| Fine Forceps | F.S.T | 11254-20 | |
| Forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Forceps | F.S.T | 13011-12 | |
| LANCASTER Eye Speculum | Zepf Medical Instruments | 42-1209-07 | |
| Micro Vascular Clip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6472 | |
| Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5440 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture | AROSurgical Instruments Corporation | Cat #T4A10Q07 | 10-0 suture, Needle=70 microns |
| Black Monofilament Nylon Suture | Syneture (Covidien) |
SN-1956 | 6-0 suture |
| Non-Woven Songes | McKesson Corp. | Reorder No. 94442000 | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | REF 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 18G 1 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305196 | |
| 25G 7/8, Hypodermic Needle | BD | REF 305124 | |
| 27G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305109 | |
| 30G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305106 | |
| Hearting Pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
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