Summary
التطور الأخير من الأدوات التي تجمع بين علم الأعصاب وعلم الوراثة وعلم البصريات، ووصف "optogenetics"، وتمكن من السيطرة على النشاط الدوائر العصبية مع مستوى غير مسبوق من القرار المكانية والزمانية. هنا نقدم بروتوكول للدمج في تسجيل المجراة مع التلاعب optogenetic من مجموعات فرعية محددة وراثيا من الخلايا العصبية الهرمية الفص الجبهي القشرية ومرفدي.
Abstract
ظهرت أساليب Optogenetic كأداة قوية لتوضيح النشاط العصبي الدائرة الكامنة مجموعة متنوعة من السلوكيات عبر مجموعة واسعة من الأنواع. تتكون أدوات Optogenetic المنشأ الميكروبية للبروتينات غشاء الحساسة للضوء التي هي قادرة على تفعيل (على سبيل المثال، channelrhodopsin-2، ChR2) أو الصمت (على سبيل المثال، halorhodopsin، NpHR) النشاط العصبي أنواع الخلايا المحددة ingenetically الإفراط في الجداول الزمنية سلوكيا ذات الصلة. علينا أن نبرهن أولا مقاربة بسيطة للتسليم بوساطة فيروس الغدة المرتبطة من ChR2 وNpHR الجينات المحورة إلى مرفد الظهرية ومنطقة الحوف من قشرة الفص الجبهي في الفئران. لأن ChR2 وNpHR هي للاستهداف وراثيا، نحن تصف استخدام هذه التكنولوجيا لمراقبة النشاط الكهربائي للسكان محددة من الخلايا العصبية (أي الخلايا العصبية الهرمية) جزءا لا يتجزأ من نسيج غير متجانس مع دقة زمنية عالية. وصفنا هنا الأجهزة والبرامج المخصصةواجهة المستخدم، والإجراءات التي تسمح للتسليم في وقت واحد وتسجيل الضوء الكهربائية من الخلايا العصبية الهرمية transduced في تخدير في إعداد الجسم الحي. توفر هذه الأدوات للضوء استجابة الفرصة لتحديد المساهمات السببية من أنواع مختلفة من الخلايا لمعالجة المعلومات والسلوك.
Introduction
القدرة على تفعيل أو إسكات نوع خلية معينة داخل الدوائر العصبية بطريقة دقيقة زمنيا هو أمر حاسم لفهم كيفية معالجة الدوائر العصبية أنواع مختلفة من المعلومات الكامنة العاطفة والإدراك. السيطرة التجريبية على النشاط العصبي سليمة وقد استخدمت أدوات loss-/gain-of-function (على سبيل المثال، التحفيز الكهربائي والتشكيل الدوائية، الآفة) التي لا توفر المطلوب انتقائي للسيطرة على فئات معينة من السكان من الخلايا العصبية، إما على نطاق والزمانية أو المكانية. معالجة هذه التحديات التكنولوجية مباشرة، وقد مكن تطوير وتطبيق أدوات حساسة للضوء وراثيا encodable علماء الأعصاب للسيطرة على النشاط الكهربائي من أنواع الخلايا حدد خلال الأحداث السلوكية واضحة المعالم. العديد من هذه البروتينات الحساسة للضوء هي من أصل الميكروبية، مع قناة بوابات ضوء الموجبة، channelrhodopsin-2 (ChR2) 1، ومدفوعة ضوء مضخة كلوريد، halorhodopالخطيئة (NpHR) 2،3، في الاستخدام واسع النطاق.
والميزة الرئيسية لoptogenetics هو القدرة على السكان الخلية وراثيا هدف محدد في مناطق الدماغ غير متجانسة ولقد تم تطبيق هذه التقنية بنجاح لعدد من الكائنات نموذج (اللافقاريات إلى الرئيسيات غير البشرية) 4-6. وقد ولدت كثير من الحيوانات المعدلة وراثيا optogenetic ومتاحة تجاريا 7،8، ولكن يمكن إنشاء خطوط المعدلة وراثيا تكون كثيفة العمالة وباهظة التكلفة. نحن هنا وصف بروتوكول للتوسط فيروسي التسليم من ChR2 وNpHR الجينات تحت المروج CaMKIIα في الفئران الحوف القشرة الظهرية ومرفد باستخدام الغدة المرتبطة المؤتلف الفيروس (AAV) المتجه. داخل الدماغ الأمامي، CaMKIIα التعبير هي حصرية لالخلايا العصبية الهرمية الجلوتاميرجي 9. ويستخدم عادة لAAV البحوث الأساسية بسبب السهولة النسبية لإنتاجه وعدم المرضية، وكذلك قوي وPERSIالدعامة التعبير التحوير الذي تم تحقيقه مع هذه النواقل 10. بالإضافة إلى ذلك نحن الخطوط العريضة للخطوات والأجهزة للتسليم الضوء في وقت واحد وتسجيل في الفئران الثابتة الرأس تخدير.
Protocol
1. فيروس التخزين والتحضير
- تمت الموافقة على استخدام ناقلات AAV النسخ المتماثل غير كفء لتقديم الجينات أوبسين إلى الدماغ القوارض للسلامة الأحيائية المستوى 1 (BSL-1) ويتطلب الحماية المناسبة وإجراءات التعامل مع النحو المبين في المنشور حكومة الولايات المتحدة، سلامة الأحيائية في علم الأحياء الدقيقة والمختبرات الطبية الحيوية، وهي متاحة على مراكز السيطرة على الأمراض في الموقع في ( http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm ).
- من أجل تجنب تكرار تجميد أذاب دورات، وفيروس ماصة من القارورة المصنعة في العمل مأخوذة أصغر في الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية.
- قبل الحقن المجسم، تسمح قسامة لذوبان الجليد على الجليد وتدور لفترة وجيزة ثم إلى أسفل مع جهاز للطرد المركزي أعلى مقاعد البدلاء.
- الردم ببطء حقنة هاميلتون الزجاج وإبرة مع كمية صغيرة من السيليكون أو الزيوت المعدنية.تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء مرئية في برميل حقنة. إدراج حقنة في مضخة microinjector وإرفاق مضخة مباشرة إلى الذراع التجسيمي العمودي (أي تتلاعب التجسيمي).
- خفض الذراع التجسيمي حتى غيض من إبرة تلامس قاع الأنبوب قسامة الفيروس. استخدام وحدة تحكم لمضخة microinjector لسحب حجم المطلوب من فيروس (1.5 ميكرولتر لحقن 1 ميكرولتر).
- يجب تطهير جميع المواد والأسطح التي تتلامس مع الفيروس مع مطهر مثل الكلور (10٪).
2. الجراحة وحقن الفيروسات
- تخدير الحيوانات مع الكيتامين (الجرذ، 125 ملغ / كغ، والملكية الفكرية) - زيلازين (الفئران، و 10 مغ / كغ، والملكية الفكرية) كوكتيل. لقياس فعالية التخدير، وتحقق من وجود استجابة منعكس لقرصة أخمص قدميها، وإعطاء جرعات تكميلية من الكيتامين إذا لزم الأمر. باستخدام الطرق الجراحية العقيم القياسية، وضع الحيوان في جهاز التجسيمي (ديفيد كوبف فياألدوات).
- جعل شق خط الوسط من خلال الجلد في أعلى الجمجمة الحيوان مع مقص جراحي صغير أو مشرط. فصل بلطف النسيج الضام وتنظيف الجزء العلوي من الجمجمة مع مكشطة العظام الصغيرة.
- تحقق من أن رأس الحيوان هو مستوى بحيث ض إحداثيات bregma وامدا على قدم المساواة. تحديد الإحداثيات التجسيمي للمنطقة الدماغ الهدف من أطلس الدماغ مثل الجرذ الدماغ في التجسيمي الاحداثيات (جورج Paxinos وتشارلز واطسون، الصحافة الأكاديمية، 2007) أو الماوس الدماغ في التجسيمي الاحداثيات (كيث BJ فرانكلين وجورج Paxinos، مطبعة الأكاديمية ، 2007). بمناسبة موقع المقصود من حقن بالقلم الجراحية.
- رقيقة بعناية الجمجمة فوق المنطقة المستهدفة باستخدام الحفر باليد ووقف عندما يصل لقمة الحفر أسفل الجمجمة. باستخدام زوج من ملقط غرامة اضافية، وإزالة العظام ضعيفة من أجل فضح الجافية.
- وضع إبرة الحقنة أكثر من هدف ولوخفض الإبرة حتى يلمس الجافية واستخدام هذه النقطة لحساب ض تنسيق. خفض ببطء شديد إبرة الحقن في المخ حتى يتم الوصول إلى موقف ض السليم. في هذا البروتوكول، ومنطقة الحوف من قشرة الفص الجبهي الأنسي (2.7 ملم الأمامي إلى bregma، ± 0.5 مم الوحشي على خط الوسط، و-2.2 ملم من الجافية) أو مرفد الظهرية (-6.0 ملم الأمامي إلى bregma، ± 3.0 مم الوحشي إلى خط الوسط، و-2.0 ملم من الجافية) ويستهدف في الكبار سبراغ داولي الفئران الذكور (حوالي 275 غرام).
- حقن الفيروس بمعدل 0.1 ميكرولتر / دقيقة. بعد الانتهاء من حقن الانتظار 10 دقيقة قبل سحب الإبرة لتجنب ارتجاعي الفيروس على سطح الدماغ.
- استخدام إبرة خياطة الخياطة مع المرفقة لختم الجلد وتطبيق المضادات الحيوية على الجرح.
- وبطبيعة الحال سوف وقت ChR2 وNpHR التعبير وظيفية من ناقلات AAV تختلف اعتمادا على التصميم التجريبي وعيار الفيروسية. لهذه التجربة، في الجسم الحي
3. توصيل الضوء وتسجيل في الجسم الحي من ChR2 أو الخلايا العصبية، معربا عن NpHR
- إرفاق القطب التنغستن (~ 1-1.5 MΩ، مجهرية) إلى أنبوب زجاجي الشعرية (فيشر العلمية) باستخدام الغراء عظمى.
- استخدام الألياف تجريد أداة (Thorlabs) لفضح نهاية العارية من الألياف متعددة البصرية (200 ميكرون قطر الأساسية، Thorlabs) والألياف نظيفة طرف مع الايثانول. يسجل طفيفة جدا الألياف طرف مع اسفين على شكل سكين الماس (Thorlabs) وإزالة بعناية الألياف الزائدة (على سبيل المثال مع ملقط غرامة). الألياف يجب أن يلتصق بسهولة في النتيجة.
- ربط الطرف FC من الألياف إلى موصل الكمبيوتر على منفذ إخراج 200 ميغاواط ليزر ديود واحد ( www.Lumiphy.com ) مع الطول الموجي المطلوب. تأكد من أن يلبس النظارات الواقية المناسبة في جميع الأوقات عند التعامل مع أجهزة الليزر.
- قياس لتركثافة في عسير غيض من الألياف البصرية باستخدام السلطة متر الضوئية ( www.Lumiphy.com ). لفي الجسم الحي تسجيلات، يمكن أن شدة الضوء أقل قدر 20-100 ميغاواط / مم 2 استحضار موثوق ChR2 أو تفعيل NpHR بوساطة أو إسكات، على التوالي، من نشاط الخلايا العصبية.
- إدراج الألياف الضوئية في أنبوب شعري. موقف الطرف الألياف حوالي 500 ميكرون أعلاه غيض من التنغستن القطب وربط خيوط الجروح رقيقة مرتين في بضع نقاط بالقرب من الطرف بحيث القطب والألياف هي على التوالي. تأكد من أن المسافة بين غيض من القطب وأقرب عقدة طويلة بما فيه الكفاية لالإدراج إلى المنطقة المستهدفة.
- إعداد الحيوان كما في الخطوات 2.1 و 2.2 أعلاه. استخدام حج القحف الأولية كدليل لجعل نافذة صغيرة نظيفة جديدة في الجمجمة لتحديد المواقع optrode ( www.Lumiphy.com ). إجراء شق صغير في دأورا باستخدام إبرة رفيعة.
- خفض بعناية optrode من خلال نافذة الجمجمة والى الدماغ إلى المنطقة transduced باستخدام مياداة مجهرية (Narishige). ثم دفع optrode ببطء في 10-50 ميكرومتر الخطوات حتى ظهور خلية ضوئية استجابة.
- واجهة المستخدم البرمجيات المخصصة (NeuroLux برو www.Lumiphy.com يستخدم) مكتوبة في ابفيف (الصكوك الوطنية) للسيطرة على ليزر ديود واحد وتصور وتسجيل النشاط العصبي المستمر. يتم التقاط الإشارات المسجلة مع أمثل-20K (Kation العلمي) مكبر للصوت الفرقة تمرير تصفيتها (0،3-8 كيلو هرتز)، والتناظرية الصكوك الوطنية إلى مجلس الرقمية (NI USB-6009). وNeuroLux برو واجهة المستخدم يسمح اختيار مدخلات تناظرية (اختيار قناتين للإشارة العصبية وTTL) والإخراج الرقمي. قد تحدد للمستخدم معدل أخذ العينات (20 كيلو هرتز)، وفترة الأساس (ما قبل الضوء)، وفترة ما بعد الضوء. يمكن للمستخدم تحديد stimulati الليزر TTLعلى عرض النبضة، وتواتر ومدة التحفيز (إذا كان التردد هو 20 هرتز والتحفيز الفترة هو 500 ميللي ثانية، يتم تسليم 10 نبضات الليزر مع عرض النبضة محددة). كما يمكن للمستخدم اختيار التسليم ضوء مستمر (على سبيل المثال، الشكل 1). للحصول على تسجيلات المتكررة، المستخدم أيضا قد تحديد عدد القطارات النبض والفترة الفاصلة بين القطارات. يمكن الحصول على البيانات مع أو بدون تسجيل إلى القرص.
- بعد التسجيل، يتم تخدير الحيوانات مع كوكتيل الكيتامين / زيلازين وperfused transcardially مع المالحة الفسيولوجية وبارافورمالدهيد (4٪) وذلك للتحقق من وضع optrode وأوبسين التعبير.
Representative Results
الشكل 1 يصور لقطة من البرنامج (NeuroLux برو) وضعت في بيئة ابفيف (الصكوك الوطنية) مخصصة تستخدم لتسجيل نشاط الخلايا العصبية في وقت واحد والتحكم المعلمات ضوء نبض (أي تردد النبض، وعرض النبضة، وفترة التحفيز). يرسل برنامج حاسوبي إشارة الأوامر لجهاز اكتساب الرقمية التي تولد نبضات TTL للسيطرة على الصمام الثنائي ليزر واحد. بالإضافة إلى ذلك يعرض برنامج البرنامج ويخزن نشاط الخلايا العصبية المسجلة وإشارات TTL تسليمها. يتم ترقيم هذه الإشارات من خلال جهاز اكتساب بمعدل عينة محددة (على سبيل المثال، 20 كيلو هرتز). يتم حفظ الإشارات كما سجلت مجموعة ومزدوجة الدقة ثنائية الأبعاد في ملف ثنائي.
ويبين الشكل 2 optrode مخصصة تتكون من القطب التنغستن تعلق على الألياف البصرية. يتم إصلاح الألياف البصرية إلى القطب باستخدام رقيقة خيوط الجروح في ثلاثة نقطة. إذا لزم الأمر، الغراء عظمى يمكن استخدامها على الانضمام لهم. ومع ذلك، وتجنب التلاعب في نتائج دائمة الألياف البصرية إلى أنه على الرغم من القطب الكهربائي يمكن إعادة استخدامها عدة مرات، نقل الضوء عبر الألياف سوف تتحلل مع الاستخدام المتكرر، وينبغي المشقوق وتنظيفها أو استبدالها مع كل الإدراج في الدماغ.
لوحات تبقى من الشكل 3 تظهر الصور الفلورسنت المعززة بروتين فلوري الصفراء، مما يدل ChR2 الفعلية وNpHR التعبير. تظهر هذه الصور التعبير NpHR ممثل في الفئران الظهرية مرفد (الشكل 3A) وChR2 التعبير في القشرة الحوف (الشكل 3B). اقتصر التعبير الفيروسية في معظمها إلى مرفد الظهرية والقشرة الحوف (على سبيل المثال لوحظ بعض مضان في التلفيف المسنن (الشكل 3A، يسار)). وقد لوحظت أيضا مسارات القطب (المسار رقيقة، ورأس السهم) والألياف البصرية (المسار سميكة، والسهم).
ويبين ق = "jove_content"> اليسار لوحة من الشكل 4 أن ChR2 يسببها ارتفاعه دقيقة زمنيا في الفئران القشرة الحوف. الشكل 4A هو تتبع سبيل المثال من إمكانات العمل أثار ChR2 في استجابة لتسليم 20 هرتز من 10 ميللي ثانية البقول الضوء الأزرق على الفئران الحوف القشرة. النقطية مؤامرة (الشكل 4B) يبين تفعيل ChR2 التي يسببها الخلايا العصبية في ستة ممثل. أظهر جميع الخلايا العصبية سجلت ارتفاعه أثار ضوء مع الإخلاص الكمال. وعلى النقيض من ChR2، NpHR بسرعة وإسكات عكسية النشاط العفوي في الجسم الحي في الفئران الحوف القشرة (يمين لوحة من الشكل 4). الشكل 4C هو التتبع المستمر سبيل المثال تبين أن 532 نانومتر الإضاءة (10 ثانية) من القشرة الحوف معربا عن NpHR تحت CaMKllα المروج يلغي عفوية النشاط وحدة واحدة في الجسم الحي. لاحظ أن إسكات كاملة من الحوف نشاط الخلايا الهرمية هو 10 ثانية تسليم ضوء مستمر غير الساحلية الوقت. منخفضإيه النقطية مؤامرة (الشكل 4D) يظهر إسكات NpHR التي يسببها الخلايا العصبية في ستة ممثل. سواء في الجسم الحي تسجيلات هي نموذجية من تلك التي حصلنا عليها من الكبار الفئران سبراغ داولي الذي التسليم بوساطة الجينات AAV أوبسين الميكروبية وقعت 18-21 يوما قبل.
ويبين الشكل (5) ونتيجة لتكرار التحفيز ChR2 من الحوف الفئران الهرمي الخلايا العصبية. تم تسليم نبض الضوء الأزرق (10 ميللي ثانية) في 20 هرتز لمدة 5 ثوانى (المجموع 100 البقول). تم الحصول عليها آثار التيار الكهربائي من ضوء ارتفاعه أثار مرارا كل 2 دقيقة خلال جلسة تسجيل 2 ساعة (المجموع 61 التكرار). حتى عند استخدام هذا البروتوكول التحفيز المتكررة، ChR2 يسببها ارتفاعه مستقرة وقوية ردا على إيصال الضوء.
أرقام 6 و 7 تظهر نتائج photoinhibition NpHR التي يسببها وتنشيط ضوئي ChR2 يحركها من الفئران مرفدي نشاط الخلايا العصبية. كما هو الحال في القشرة الحوف، كانت NpHR وChR2 قادرة علىتوسط في تثبيط الناجم عن الضوء غير الساحلية الوقت وتفعيل الخلايا العصبية transduced أوبسين مرفدي مع استنساخ عالية.
الشكل 1. قطة من NeuroLux واجهة البرنامج برو للتسليم في وقت واحد وعلى ضوء تسجيل الكهربية. يظهر أثر في الصورة إسكات NpHR الناجم عن النشاط العفوي من الفئران الخلايا الهرمية الحوف ردا على 10 ثانية من 532 المستمر تسليم ضوء نانومتر. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 2. صورة طاقة عالية من optrode مخصصة. يتم إدخال الألياف البصرية في أنبوب زجاجي الشعرية تعلق على القطب التنغستن والثابتة إلى القطب باستخدام خيوط الجروح. المسافة إلى مركز مركز betwالتابعين طرف القطب وغيض من الألياف هو ما يقرب من 500 ميكرون.
الرقم 3. التعبير الفيروسية والتنسيب optrode. تظهر (يسار) صور التعبير NpHR ممثل في ظهري مرفد (A) وChR2 التعبير في القشرة الحوف (B). (يمين) التخطيطي الذي يمثل الموقع حيث تم أخذ كل صورة. رأس السهم والسهم في كل صورة تشير إلى موقع القطب التنغستن والألياف البصرية، على التوالي. SUB: مرفد، DG: التلفيف المسنن، PL: القشرة الحوف انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 4. في الجسم الحي التسجيلات الكهربية من ChR2 أو NpHR transduced-prelimb الفئرانجيم القشرة. (A) مثال التتبع من إمكانات العمل أثار ChR2 في استجابة لتسليم 20 هرتز من اللون الأزرق (473 نانومتر) نبضات الضوء (10 ميللي ثانية، الشريط الأزرق). (B) مؤامرة النقطية تظهر ارتفاعه ChR2 التي يسببها الخلايا العصبية في ستة ممثل. يتم رسم كل نشاط الوحدة باعتبارها نقطة. (C) مثال أثر لقمع NpHR التي يسببها النشاط العفوي خلال أخضر مستمر (532 نانومتر) إضاءة الضوء (10 ثانية، شريط أخضر). (D) مؤامرة النقطية تظهر إسكات NpHR التي يسببها الخلايا العصبية في ستة ممثل. يتم رسم كل نشاط الوحدة باعتبارها نقطة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الرقم 5. ارتفاعه 20 هرتز المتكررة ChR2 يحركها من الخلايا العصبية الهرمية الحوف الفئران في الجسم الحي. (A) الجهد آثار ارتفاعه أثار الخفيفحصلت في نقاط زمنية 0، 30، 60، 90، 120 دقيقة بعد بداية التسجيلات. (B) مؤامرة النقطية تظهر جميع التكرار 61 (2 دقيقة الفاصل الزمني بين المحاكمة، و 120 دقيقة الكل) من التنشيط التي يسببها الضوء. يتم رسم كل نشاط الوحدة باعتبارها نقطة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الرقم 6. في الجسم الحي التسجيلات الكهربية من NpHR transduced الفئران الظهرية مرفد. (A) مثال التتبع تبين أن 10 ثانية المستمر الإضاءة 532 نانومتر (الشريط الأخضر) من مرفد الظهرية معربا عن NpHR يلغي النشاط العفوي. (ب) متوسط الطول الموجي من الوحدتين المسجلة من التتبع أعلاه. تم استخدام عتبة السعة لتحديد اثنين من الخلايا العصبية متميزة. (C) مؤامرة النقطية تظهر خمسة التكرارق من إسكات NpHR التي يسببها لهذه الوحدات. يتم رسم كل نشاط الوحدة باعتبارها نقطة.
الرقم 7. 20 هرتز المتكررة يحركها CR2 ارتفاعه من الفئران الظهرية مرفدي الخلايا العصبية في الجسم الحي. (A) الجهد آثار ضوء أثار ارتفاعه المكتسبة في نقاط زمنية 0، 30، 60، 90، 120 دقيقة بعد بداية التسجيلات. أقحم: النشاط انفجار نموذجية من هذه الخلية. (B) مؤامرة النقطية تظهر جميع التكرار 61 (2 دقيقة الفاصل الزمني بين المحاكمة، و 120 دقيقة الكل) من التنشيط التي يسببها الضوء. يتم رسم كل نشاط الوحدة باعتبارها نقطة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
Discussion
تتوفر لراثيا استهداف الجينات الميكروبية أوبسين إلى مناطق الدماغ منفصلة في القوارض وهناك مجموعة واسعة من التقنيات. يوفر توصيل الجينات الفيروسية نهج غير مكلفة نسبيا وسريعة للوساطة ChR2 وNpHR التعبير مع خلية من نوع خصوصية. نظم ناقلات AAV هي خيار مشترك للاستخدام في التجارب optogenetic بسبب التتر الإنتاج العالية التي تبقى مستقرة أثناء التخزين، افتقارها إلى المرضية، وقدرتها على إنتاج طويلة الأجل التعبير الجيني 10. العديد من بنيات أوبسين مع المروجين محددة الخلايا من نوع المتاحة تجاريا في مجموعة متنوعة من الأنماط المصلية AAV من المرافق الأساسية مثل ناقلات جامعة بنسلفانيا ( http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore ) أو جامعة من ولاية كارولينا الشمالية في تشابل هيل ( http://genetherapy.unc.edu ). عيب واحد لتكنولوجيا AAV هوقدرة محدودة التعبئة والتغليف (~ 4.7 كيلو بايت)، الأمر الذي يضع قيدا على حجم الكاسيت التحوير التي يمكن استخدامها لاستهداف خلية محددة. كبديل، ناقلات lentiviral، والتي لديها قدرة أكبر التعبئة والتغليف، هي قادرة على استيعاب أوبسين تستهدف تحت سيطرة تسلسل المروج أكبر.
استخدام وسيلة optrode يسمح للكشف عن الإشارات الكهربية يمكن الاعتماد عليها في تركيبة مع تسليم ضوء زمنيا الدقة. كما هو موضح أعلاه، ومع ذلك، هناك حاجة إلى رعاية كافية في بنائه. منذ الألياف البصرية المشقوق لا يزال هشا، وربط خيوط الجروح بإحكام شديد قد يتسبب في الألياف للكسر. على الرغم من أن optrode يمكن استخدامها للحصول على تسجيلات متعددة، يجب تنظيف القطب والألياف البصرية (أو يدويا المشقوق في حالة نهاية العارية الألياف البصرية) قبل الإدراج لأن مقاومة من القطب ونوعية الضوء تسليمها سوف تتحلل مع الاستخدام المتكرر.
خلال ايلىتسجيلات ctrophysiological من المهم أن تكون متقدمة optrode ببطء. وoptrode المستخدمة هنا ما يقرب من 350 ميكرون سمك (التنغستن القطب: 125 ميكرومتر؛ الأساسية للألياف البصرية: 200 ميكرون) وخفض ذلك بسرعة قد يؤدي إلى حركة أنسجة المخ. كما يمكن اعتبار القطع الأثرية التي يسببها الضوء، مع تسجيل خاص وتسليم ضوء مجموعة عمليات 11-12. على الرغم من أن لم نجد أي قطعة أثرية الناجم عن ضوء في حالة تجريبية لدينا، والتسجيلات خارج منطقة الدماغ transduced يمكن أن تستخدم كجهاز تحكم عن التحف الخفيفة. اعتبار آخر أثناء عملية التسجيل هو شدة الضوء اللازمة لمراقبة التغيرات في ChR2 أو NpHR، معربا عن الخلايا العصبية، وخاصة بالنسبة للتسجيلات مدة طويلة. قوية كثافة الليزر والإضاءة الليزر طويلة يمكن أن يؤدي إلى تلف الأنسجة و / أو استجابة لاحقة انخفض ضوء تسليمها 12-13. للتجريب السلوكية مطلوب استخدام ناقل فيروسي التحكم عن eliminatinز أي تأثير بسبب الحرارة تسليمها من الألياف. بالنسبة للعديد من بنيات optogenetic المتاحة تجاريا هناك ثوابت تحكم التكميلية التي تمت إزالة التسلسل الجيني أوبسين.
تجدر الإشارة إلى أن المهندسة ChR2 المتغيرات مع تحسين خصائص وحركية وضعت جنبا إلى جنب مع opsins إسكات الأخرى التي قد تكون أكثر ملاءمة لبعض الأسئلة التجريبية 14-15. على سبيل المثال، وهو البديل ChR2 الجديدة التي أنشئت عن طريق الطفرات المستهدفة، ووصف "ChETA"، يمكن أن تدفع عالية الدقة ارتفاعه العصبية بترددات (حتى لا يقل عن 200 هرتز) أعلاه أن من ChR2 الأصلي 14.
مزيج من الضوء في الجسم الحي تسليم وتسجيل وقت واحد من الاستجابات العصبية هو خطوة حاسمة في إقامة علاقات سببية بين النشاط منقوشة في السكان الخلية المستهدفة وراثيا والأحداث السلوكية المقابلة غير الساحلية الوقت. الإجراءات وهاrdware المذكورة هنا توفير نهج واضحة لتنفيذ optogenetics لفي الجسم الحي تسجيلات الثابتة الرأس في القوارض.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني لتعاطي المخدرات (النداء) منحة R01 DA24040 (DCC)، جامعة كولورادو مبتكرة غرانت البذور (DCC)، والنداء منحة التدريب T32 DA017637 (MVB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl |
| Removable Needle | Hamilton | 7803-03 | 31 gauge, beveled tip |
| Microinjector Pump | World Precision Instruments | UMP3 | |
| Pump Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| Silicone Oil | Alfa Aesar | A12728 | |
| Laser Protective Eyeware | Kentek | KMT-4501 | |
| Multimode Optical Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm diameter core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | Thorlabs | T12S21 | for 200 μm diameter core multimode fiber |
| Optical Power Meter | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
| Photodetector | Newport | 818-SL/DB | |
| Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
| Green Laser (532 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
| Tungsten/Fiber Optrode | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | Lumitrode |
| Glass Capillary Tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
| Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MO-22 | |
| Amplifier | Kation Scientific | ExAmp-20K | |
| Data Acquistion Device | National Instruments | NI USB-6009 | |
| Rodent Head Restraint for Recording | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
| Small Animal Stereotaxic Unit | David Kopf Instruments | Model 963 |
References
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2 (3), e299 (2007).
- Zhang, F., Wang, L. P., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
- Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
- Han, X. Optogenetics in the nonhuman primate. Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).
- Zhao, S., Ting, J. T., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing. Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).
- Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, eg Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system. Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).
- McCown, T. J. Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS. Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).
- Cardin, J. A., Carlen, M., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
- Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).
- Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).
- Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).
- Chow, B. Y., Han, X., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).
