Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

En metod för High Fidelity Optogenetic kontroll av enskilda pyramidala nervceller doi: 10.3791/50291 Published: September 2, 2013
* These authors contributed equally

Summary

Den senaste tidens utveckling i neurovetenskap verktyg som kombinerar genetik och optik, benämnd "optogenetics", möjliggör kontroll över neural krets aktivitet med en oöverträffad nivå av tidsmässiga och geografiska. Här ger vi ett protokoll för att integrera in vivo-inspelning med optogenetic manipulation av genetiskt definierade undergrupper av prefrontala kortikala och subicular pyramidala nervceller.

Abstract

Optogenetic metoder har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att belysa neural krets aktivitet som ligger bakom en mångfald av beteenden inom ett brett spektrum av arter. Optogenetic bearbetar av mikrobiellt ursprung består av ljuskänsliga membranproteiner som är i stånd att aktivera (t.ex. channelrhodopsin-2, ChR2) eller tystnad (t.ex. halorhodopsin, NpHR) neural aktivitet ingenetically definierade celltyper över behaviorally-relevanta tidsskalor. Vi visar först en enkel metod för adeno-associerat virus-förmedlad leverans av ChR2 och NpHR transgener till den dorsala subiculum och prelimbic regionen hos prefrontala cortex i råtta. Eftersom ChR2 och NpHR är genetiskt inriktningsbar beskriver vi användandet av denna teknik för att styra den elektriska aktiviteten i specifika populationer av nervceller (dvs pyramidala neuroner) inbäddade i heterogena vävnad med hög tidsmässig precision. Vi beskriver häri hårdvara, anpassade programanvändargränssnitt, och rutiner som möjliggör samtidig ljus leverans och elektrisk inspelning från omvandlade pyramidala nervceller i en bedövad in vivo-förberedelser. Dessa ljus lyhörd verktyg ger möjlighet till att identifiera de kausala bidrag av olika celltyper till behandling och beteendeinformation.

Introduction

Förmågan att aktivera eller tysta en viss celltyp i en neural krets i en tidsmässigt exakt sätt är avgörande för att förstå hur nervbanor bearbetar olika typer av information underliggande känslor och kognition. Experimentell kontroll över intakt neural aktivitet har anställt loss-/gain-of-function verktyg (t.ex. elektrisk stimulering, farmakologisk modulering, skada) som inte ger önskad selektivt för att styra specifika populationer av nervceller, antingen på en temporal eller rumslig skala. Direkt ta itu med dessa tekniska utmaningar, har utvecklingen och tillämpningen av genetiskt-kodningsbara ljuskänsliga verktyg aktiverade neuroforskare för att styra den elektriska aktiviteten i utvalda celltyper under väldefinierade beteende händelser. Många av dessa ljuskänsliga proteiner är av mikrobiellt ursprung, med ljuskänsliga katjon kanal channelrhodopsin-2 (ChR2) 1, och den ljusdrivna klorid pump, halorhodopsin (NpHR) 2,3, används i begränsad omfattning.

En stor fördel med optogenetics är förmågan att genetiskt-målgruppspecifika cellpopulationer i heterogena områden i hjärnan och tekniken har med framgång tillämpats på ett antal modellorganismer (ryggradslösa djur till icke-mänskliga primater) 4-6. Har genererats och finns kommersiellt tillgängliga 7,8 Många optogenetic transgena djur emellertid upprättandet transgena linjerna kan vara arbetsintensiv och kostnaden avskräckande. Här beskriver vi ett protokoll för viralt förmedlad leverans av ChR2 och NpHR gener under CaMKIIα promotorn i råtta prelimbic cortex och dorsala subiculum användning av ett rekombinant adeno-associerat virus (AAV)-vektor. Inom framhjärnan, är CaMKIIα uttryck exklusivt för glutamaterg pyramidala nervceller 9. AAV är vanligen används för grundforskning på grund av dess relativt lätta att framställa och avsaknaden av patogenicitet, liksom den starka och PERSIstent transgenuttryck som har uppnåtts med dessa vektorer 10. Utöver detta vill vi beskriva stegen och hårdvara för samtidig ljus leverans och inspelning i sövda huvud fixerade råttor.

Protocol

1. Virus lagring och beredning

  1. Användningen av replikations inkompetent AAV-vektorer för att leverera opsin gener till gnagare hjärnan är godkänd för biosäkerhet nivå 1 (BSL-1) och kräver ett ordentligt skydd och hanteringsförfaranden som beskrivs i den amerikanska regeringen publikation, biosäkerhet i mikrobiologi och biomedicinska laboratorier, som finns på Centers for Disease Control: s webbplats ( http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm ).
  2. För att undvika upprepade frys-tö cykler, pipett virus från tillverkarens flaskan i mindre arbetsgrupper portioner i en klass II biosäkerhet skåp och förvara i en -80 ° C frys.
  3. Före att stereotaktisk injektion, tillåta en alikvot tina på is och sedan snabbt spinna ned med en bänkcentrifug.
  4. Långsamt återfyllning av en Hamilton glasspruta och nål med en liten mängd av silikon eller mineralolja.Se till att det inte finns några synliga luftbubblor i sprutan. För in sprutan i en microinjector pump och fäst pumpen direkt till den vertikala stereotaxic armen (dvs. stereotaxisk manipulator).
  5. Sänk stereotaxic armen tills nålspetsen når bottnen av viruset alikvot röret. Använd regulatorn för microinjector pumpen att dra önskad volym av virus (1,5 l för en 1 l injektion).
  6. Allt material och ytor som kommer i kontakt med viruset skall dekontamineras med ett desinfektionsmedel såsom klorin (10%).

2. Kirurgi och Virus Injection

  1. Bedöva djur med en ketamin (råtta, 125 mg / kg, ip) - xylazin (råtta, 10 mg / kg, ip) cocktail. För att mäta effekten av anestesi, kontrollera om en reflex svar på en tå nypa och ge kompletterande doser av ketamin vid behov. Med sedvanlig aseptisk kirurgiska metoder, placera djuret i en stereotaxic apparater (David Kopf Inment).
  2. Gör ett mittlinjesnitt genom huden på toppen av djur skalle med små kirurgiska sax eller skalpell. Separera försiktigt bindväv och rengör toppen av skallen med en liten ben skrapa.
  3. Kontrollera att chefen för djuret är nivån så att z-koordinater för bregma och lambda är lika. Bestäm stereotaktiska koordinaterna för målet hjärnområdet från en hjärnatlas som The Rat Brain i Stereotaxic Koordinater (George Paxinos och Charles Watson, Academic Press, 2007) eller The Mouse Brain i Stereotaxic Koordinater (Keith BJ Franklin och George Paxinos, Academic Press , 2007). Märk den avsedda injektionsstället med ett kirurgiskt penna.
  4. Försiktigt tunna skallen över målområdet med hjälp av en handborr och sluta när borren når botten av skallen. Med hjälp av ett par av extra fin pincett, ta bort förtunnas ben för att frilägga duran.
  5. Placera injektionsnålen under målet ären och sänka nålen tills den rör dura och använda denna punkt för att beräkna z-koordinaten. Mycket sakta sänka injektionsnål in i hjärnan tills den rätta z läget nås. I detta protokoll, den prelimbic regionen av den mediala prefrontala cortex (2,7 mm främre till bregma, ± 0,5 mm i sidled med mittlinjen och -2,2 mm från dura) eller rygg subiculum (-6,0 mm främre till bregma, ± 3,0 mm i sidled med mittlinjen och -2,0 mm från dura) riktar i en vuxen Sprague Dawley hanråtta (ca 275 g).
  6. Injicera viruset vid en hastighet på 0,1 | il / min. Efter injektionen är klar vänta 10 min innan nålen dras ut för att förhindra backflöde av viruset till hjärnan ytan.
  7. Använd en sömnad sutur med nål för att täta huden och applicera antibiotika på såret.
  8. Tidsförloppet för ChR2 och NpHR funktionellt uttryck från AAV-vektorer varierar beroende på experimentell design och viral titer. För detta experiment in vivo

3. Lätt Leverans och in vivo Inspelning av ChR2 eller NpHR-uttryck nervceller

  1. Bifoga en volframelektrod (~ 1-1,5 Mohm, mikropelare) till ett glas kapillärrör (Fisher Scientific) med hjälp av superlim.
  2. Använd ett fiberskalningsverktyg (Thorlabs) att exponera den nakna änden av en multimode optisk fiber (core ìm diameter 200, Thorlabs) och ren fiberspetsen med etanol. Mycket lätt poäng fiberspetsen med en kilformad diamant kniv (Thorlabs) och försiktigt bort överskottsfiber (t.ex. med fin pincett). Fibern ska klyva lätt på poängen.
  3. Anslut FC änden av fibern till den PC-anslutningen på den utgående porten på en 200 mW enda diodlaser ( www.Lumiphy.com ) med den önskade våglängden. Se till att lämpliga skyddsglasögon är alltid användas vid arbete med laser.
  4. Mät laser intensitet vid spetsen av den optiska fibern med användning av en optisk effektmätare ( www.Lumiphy.com ). För in vivo-inspelningar, kan ljusintensitet så litet som 20 till 100 mW / mm 2 tillförlitligt framkalla ChR2-eller NpHR-medierad aktivering eller ljuddämpning, respektive, av neuronal aktivitet.
  5. Sätt in den optiska fibern in i kapillärröret. Placera fiberspetsen ungefär 500 um ovanför spetsen på volframelektrod och binda ett tunt suturtråd två gånger vid några punkter nära spetsen så att elektroden och fibern är raka. Se till att avståndet mellan spetsen på elektroden och den närmaste knut är tillräckligt lång för att föras till målregionen.
  6. Förbered djuret som i steg 2.1 och 2.2 ovan. Använd den ursprungliga kraniotomi som en guide för att göra en ny ren litet fönster i skallen för att positionera optrode ( www.Lumiphy.com ). Gör ett litet snitt i dura med hjälp av en fin nål.
  7. Sänk försiktigt ner optrode genom skallen fönstret och in i hjärnan till den omvandlade området med hjälp av en mikromanipulator (Narishige). Sedan föra optrode långsamt i 10-50 ìm steg fram till framväxten av en ljus-känslig cell.
  8. En anpassad programvaru användargränssnitt (NeuroLux Pro www.Lumiphy.com ) skriven i LabVIEW (National Instruments) används för att styra den enda diodlaser och att visualisera och spela in pågående neural aktivitet. Inspelade signaler fångas med ett exem-20K (kation Scientific) förstärkare bandpass filtrerad (0,3-8 kHz), och en National Instruments analog till digital styrelse (NI USB-6009). Den NeuroLux Pro användargränssnittet tillåter valet av analoga ingångar (välj två kanaler för neuronala och TTL-signal) och digital utgång. Användaren kan definiera samplingsfrekvensen (20 kHz), referensperioden (pre-ljus), och post-ljus period. Användaren kan definiera TTL laser stimulatipå pulsbredd, frekvens och stimuleringsperioden (om frekvensen är 20 Hz och stimuleringstiden är 500 millisekunder, är 10 laserpulser med definierad pulsbredd levereras). Användaren kan också välja kontinuerligt ljus leverans (t.ex. Figur 1). För upprepade inspelningar, användaren kan också definiera antalet pulståg och intervallet mellan tågen. Data kan förvärvas med eller utan inspelning till disk.
  9. Efter inspelningen, är djuren bedövas med ketamin / xylazin cocktail och transcardially perfusion med fysiologisk saltlösning och paraformaldehyd (4%) i syfte att kontrollera optrode placering och opsin uttryck.

Representative Results

Figur 1 visar en skärmdump av den anpassade programvaran (NeuroLux Pro) som utvecklats i LabVIEW miljön (National Instruments) som används för samtidig inspelning av nervaktivitet och kontroll av ljus pulsparametrar (dvs. pulsfrekvens, pulsbredd, stimuleringsperiod). Programvaran sänder en kommandosignal till en digital förvärv enhet som genererar TTL-pulser för kontroll över den inre diodlaser. Dessutom Programvaran visar och lagrar det inspelade neuronal aktivitet och levererade TTL-signaler. Dessa signaler digitaliseras genom förvärv enhet vid en definierad samplingsfrekvens (t.ex. 20 kHz). Inspelade signaler sparas som en tvådimensionell dubbel precision array i en binär fil.

Figur 2 visar den anpassade optrode bestående av en volframelektrod kopplad till en optisk fiber. En optisk fiber är fäst till elektroden med användning av tunn suturtråd vid trepoäng. Om det behövs, kan super lim användas för att hålla fast dem. Dock undvika permanent fastställande av den optiska fibern till elektroden eftersom även om elektroden kan återanvändas flera gånger, ljustransmission genom fibern kommer att försämras vid upprepad användning och skall klyvas och rengöras eller ersättas med varje insättning i hjärnan.

Vänster paneler av Figur 3 visar fluorescerande bilder av förstärkt gula fluorescerande protein, som anger faktisk ChR2 och NpHR uttryck. Dessa fotografier visar representativa NpHR uttryck i rått rygg subiculum (Figur 3A) och ChR2 uttryck i prelimbic cortex (Figur 3B). Viral uttryck begränsades mestadels till rygg subiculum och prelimbic cortex (t.ex. vissa fluorescens observerades i gyrus dentatus (Figur 3A, vänster)). Spåren hos elektroden (tunn spår, pilspets) och den optiska fibern (tjock spår, pil) observerades också.

figur 4 visar att ChR2 inducerad tidsmässigt exakt spiking i rått prelimbic cortex. Figur 4A är ett exempel spår av ChR2 triggad verkningspotentialer som svar på 20 Hz leverans av 10 msek blå ljuspulser till rått prelimbic cortex. Raster plot (Figur 4B) visar ChR2-inducerad aktivering i sex representativa neuroner. Alla inspelade nervceller visade ljus-framkallade tillsatta med perfekt trohet. I motsats till ChR2, NpHR snabbt och reversibelt tystas spontan aktivitet in vivo i rått prelimbic cortex (högra panelen i figur 4). Figur 4C är ett exempel spår visar att kontinuerlig 532 nm belysning (10 s) av den prelimbic cortex uttrycka NpHR under CaMKllα promotor eliminerar spontana singel-enhet aktivitet in vivo. Observera att hela tysta av prelimbic pyramidal cellaktivitet är tids låst till 10 sek kontinuerligt ljus leverans. Låger raster plot (Figur 4D) visar NpHR-inducerad ljuddämpning i sex representativa nervceller. Både in vivo-inspelningar är typiska för de som erhålls från vuxna Sprague-Dawley där AAV-medierad leverans av mikrobiella opsin gener inträffade 18-21 dagar innan.

Figur 5 visar resultatet av upprepad ChR2 stimulering av en råtta prelimbic pyramidala neuron. Blå ljuspuls (10 msek) levererades vid 20 Hz i 5 sek (100 pulser totalt). Spännings spår av den ljus framkallade spikades upprepade gånger fått varje 2 min under en 2 tim inspelning (61 repetitioner totalt). Även vid användning av denna repetitiva stimulering protokoll ChR2 inducerade stabil och robust spiking som svar på ljus leverans.

Figurerna 6 och 7 visar resultaten av NpHR-inducerad photoinhibition och ChR2 driven fotoaktivering av rått subicular neuronaktivitet. Som fallet är i prelimbic cortex, NpHR och ChR2 kundemedla ljusinducerad tids låst hämning och aktivering av opsin-omvandlade subicular nervceller med hög reproducerbarhet.

Figur 1
Figur 1. Skärmdump på NeuroLux Pro gränssnitt för samtidig ljus leverans och elektrofysiologiska inspelning. På bilden spår visar NpHR inducerad tysta av spontan aktivitet hos råtta prelimbic pyramidal celler som svar på 10 sekunder av kontinuerligt 532 nm ljus leverans. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2
Figur 2. Hög effekt bild av anpassade optrode. En optisk fiber införes i glaskapillärrör fäst vid en volframelektrod och fixeras till elektroden med användning av suturtråd. I centrum-till-centrumavstånd between elektrodspetsen och fiberspetsen är ca 500 | im.

Figur 3
Figur 3. Viral expression och optrode placering. (vänster) Fotografier visar representativ NpHR expression i dorsala subiculum (A) och ChR2 expression i prelimbic cortex (B). (Höger) Schematisk som representerar den plats där varje fotot togs. Den pilspets och pilen i varje fotografi ange läget för volframelektroden och optisk fiber, respektive. SUB: subiculum, DG: gyrus dentatus, PL:. Prelimbic cortex Klicka här för att visa en större bild .

Figur 4
Figur 4. In vivo-elektrofysiologiska inspelningar från ChR2 eller NpHR-omvandlade råtta prelimbic cortex. (A) Exempel spår av ChR2 triggad verkningspotentialer som svar på 20 Hz leverans av blått (473 nm) ljuspulser (10 ms, blå bar). (B) rasterdiagram visande ChR2-inducerad spiking i sex representativa neuroner. Varje enhet aktivitet plottas som en prick. (C) Exempel spår av NpHR-inducerad hämning av spontan aktivitet under kontinuerlig grönt (532 nm) ljus belysning (10 sek, grön stapel). (D) rasterdiagram visande NpHR-inducerad ljuddämpning i sex representativa neuroner. Varje enhet aktivitet ritas som en prick. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 5
Figur 5. Repetitive 20 Hz ChR2 driven spiking av en råtta prelimbic pyramidala neuron in vivo. (A) Spänning spår av det ljus-framkallade spikingförvärvats vid tidpunkterna 0, 30, 60, 90, 120 minuter efter början av inspelningarna. (B) Raster diagram som visar alla 61 repetitioner (2 min inter-försöksintervallet, 120 min totalt) av den ljus inducerad aktivering. Varje enhet aktivitet ritas som en prick. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 6
Figur 6. In vivo-elektrofysiologiska inspelningar från NpHR-omvandlade råtta rygg subiculum. (A) Exempel spår som visar att 10 sek kontinuerlig 532 nm belysning (grön stapel) på rygg subiculum uttrycker NpHR eliminerar spontan aktivitet. (B) Genomsnittlig vågformer för de två inspelade enheter från ovan spår. Tröskel amplitud användes för att identifiera två skilda neuroner. (C) Raster tomt visar fem upprepnings av NpHR-inducerad tysta av dessa enheter. Varje enhet aktivitet plottas som en prick.

Figur 7
Figur 7. Repetitive 20 Hz CR2 driven spiking av en råtta dorsala subicular neuron in vivo. (A) Spänning spår av ljus-framkallade tillsatta förvärvats vid tidpunkterna 0, 30, 60, 90, 120 minuter efter början av inspelningarna. Infällt: typiska spricker aktiviteten i denna cell. (B) Raster diagram som visar alla 61 repetitioner (2 min inter-försöksintervallet, 120 min totalt) av den ljus inducerad aktivering. Varje enhet aktivitet ritas som en prick. Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

Ett brett spektrum av tekniker finns tillgängliga för genetiskt inriktning mikrobiella opsin gener till diskreta hjärnregioner hos gnagare. Viral gen leverans ger en relativt billig och snabb metod för att förmedla ChR2 och NpHR uttryck med celltyp specificitet. AAV-vektorsystem är ett vanligt val för användning i optogenetic experiment på grund av höga produktions titrar som förblir stabil under lagring, dess avsaknad av patogenicitet och dess förmåga att producera långsiktig genuttryckning 10. Många av de opsin konstruktioner med cell-typspecifika promotorer är kommersiellt tillgängliga i en mängd olika AAV serotyper från vektor core faciliteter såsom University of Pennsylvania ( http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore ) eller universitetet of North Carolina i Chapel Hill ( http://genetherapy.unc.edu ). En nackdel med AAV-teknik ärbegränsad förpackningskapacitet (~ 4,7 MB), vilket innebär en begränsning av transgenen kassettstorleken som kan användas för cellspecifik inriktning. Som ett alternativ, lentivirala vektorer, som har en större förpackningskapacitet, kan ta emot opsin inriktade under kontroll av större promotorsekvenser.

Användningen av en optrode möjliggör tillförlitlig detektering av elektrofysiologiska signaler i kombination med temporalt-exakt ljusleverans. Såsom beskrivits ovan, krävs dock tillräcklig omsorg i dess konstruktion. Eftersom det kluvna optiska fibern är skör, kan binda suturtråd för hårt bringa fibern att bryta. Även om optrode kan användas för flera inspelningar, bör rengöras elektroden och den optiska fibern (eller manuellt spjälkas i fallet med den optiska fiberns nakna ände) före införande eftersom impedansen för elektroden och kvaliteten hos den levererade ljus kommer att brytas ned med upprepad användning.

Under electrophysiological inspelningar är det viktigt att optrode föras fram långsamt. Den optrode används här har ungefär 350 | im tjocklek (volframelektrod: 125 um; kärna av optisk fiber: 200 mikrometer) och sänka det snabbt kan leda till förflyttning av hjärnvävnad. Ljus-inducerade artefakter också kan anses särskilt inspelning och lätt leverans uppställningar 11-12. Även om vi hittade inga ljusinducerad artefakt i vår experimentella tillstånd, kan inspelningar utanför den omvandlade hjärnområdet potentiellt användas som en kontroll för lätta artefakter. En annan faktor under inspelningsprocessen är den önskade ljusstyrkan för att observera förändringar i ChR2-eller NpHR-uttryckande nervceller, särskilt för långvariga inspelningar. Stark laser intensitet och lång laserbelysning kan resultera i vävnadsskada och / eller en minskad respons på senare levererade ljus 12-13. För beteende experimenterande krävs användning av en kontroll virusvektor för eliminating någon effekt på grund av värmen som levereras från fibern. För många av de kommersiellt tillgängliga optogenetic konstruktioner finns det kompletterande kontroll konstruktioner där opsin gensekvens har avlägsnats.

Det bör noteras att engineered ChR2 varianter med förbättrade egenskaper och kinetik har utvecklats tillsammans med andra tysta opsins som kan vara bättre lämpade för vissa experimentella frågor 14-15. Till exempel, en ny ChR2 variant upprättas via riktad mutagenes, benämnd "Cheta", kan köra hifi-neuronala tillsatta vid frekvenser (upp till minst 200 Hz) ovanför den ursprungliga ChR2 14.

Kombinationen av in vivo-ljus leverans och samtidig inspelning av neuronala svar är ett kritiskt steg i upprättandet av orsakssamband mellan mönstrade aktivitet i genetiskt riktade cellpopulationer och motsvarande tids låsta beteende händelser. De förfaranden och hardware beskrivs här ger en enkel metod för att genomföra optogenetics för in vivo huvud-fasta inspelningar i gnagare.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Institute on Drug Abuse (NIDA) bevilja R01 DA24040 (DCC), University of Colorado Innovativ Seed Grant (DCC), och NIDA utbildningsstipendium T32 DA017637 (MVB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Syringe Hamilton 7653-01 10 μl
Removable Needle Hamilton 7803-03 31 gauge, beveled tip
Microinjector Pump World Precision Instruments UMP3
Pump Controller World Precision Instruments SYS-MICRO4
Silicone Oil Alfa Aesar A12728
Laser Protective Eyeware Kentek KMT-4501
Multimode Optical Fiber Thorlabs BFL37-200 200 μm diameter core, 0.37 NA
Fiber Stripping Tool Thorlabs T12S21 for 200 μm diameter core multimode fiber
Optical Power Meter Lumiphy LLC www.lumiphy.com
Photodetector Newport 818-SL/DB
Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW) Lumiphy LLC www.lumiphy.com coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter
Green Laser (532 nm, 100-200 mW) Lumiphy LLC www.lumiphy.com coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter
Tungsten/Fiber Optrode Lumiphy LLC www.lumiphy.com Lumitrode
Glass Capillary Tube Fisher Scientific 22-362-566
Hydraulic Micromanipulator Narishige MO-22
Amplifier Kation Scientific ExAmp-20K
Data Acquistion Device National Instruments NI USB-6009
Rodent Head Restraint for Recording Lumiphy LLC www.lumiphy.com
Small Animal Stereotaxic Unit David Kopf Instruments Model 963

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, (9), 1263-1268 (2005).
  2. Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2, (3), e299 (2007).
  3. Zhang, F., Wang, L. P., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, (7136), 633-639 (2007).
  4. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15, (24), 2279-2284 (2005).
  5. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450, (7168), 420-424 (2007).
  6. Han, X. Optogenetics in the nonhuman primate. Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).
  7. Zhao, S., Ting, J. T., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8, (9), 745-752 (2011).
  8. Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing. Nat Neurosci. 15, (5), 793-802 (2012).
  9. Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, eg Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system. Neuroscience. 46, (4), 825-849 (1992).
  10. McCown, T. J. Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS. Curr Gene Ther. 5, (3), 333-338 (2005).
  11. Cardin, J. A., Carlen, M., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat Protoc. 5, (2), 247-254 (2010).
  12. Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. J Physiol Paris. 106, (3-4), 104-111 (2012).
  13. Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J Neurosci. 31, (29), 10529-10539 (2011).
  14. Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13, (3), 387-392 (2010).
  15. Chow, B. Y., Han, X., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463, (7277), 98-102 (2010).
En metod för High Fidelity Optogenetic kontroll av enskilda pyramidala nervceller<em&gt; In vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nakamura, S., Baratta, M. V., Cooper, D. C. A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo. J. Vis. Exp. (79), e50291, doi:10.3791/50291 (2013).More

Nakamura, S., Baratta, M. V., Cooper, D. C. A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo. J. Vis. Exp. (79), e50291, doi:10.3791/50291 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter