Summary
存在稳定的microRNA（miRNA的）外来间通讯作为一种新型的模式产生了巨大的兴趣，为他们的潜在效用作为生物标志物和治疗干预的路由。在这里，我们展示了切体净化血液和文化传媒定量PCR确定的miRNA被运。
Abstract
稳定的miRNA是目前在所有的体液和一些循环miRNA是封存在小囊，称为外来免受降解。外来体可以在RNA和蛋白质转移到目标小区与质膜融合。它们的生物学功能包括免疫反应，抗原呈递细胞内的通信。受体细胞通过血液，可以调节基因表达的miRNA交付开辟了新的途径为目标的干预。除了提供交付药物或RNA的治疗药物的战略，exosomal内容可以作为生物标志物，可以帮助诊断，确定治疗方案和预后。
在这里，我们将介绍的程序定量分析miRNA和外来的信使RNA（mRNA）的分泌在血液和细胞培养基。纯化的外来的特点将是使用免疫印迹分析EXOS的OMAL标记和PCR检测mRNA的兴趣。透射电子显微镜（TEM）和免疫金标记将被使用的，来验证exosomal的形态和完整性。从这些外来体将纯化总RNA，以确保我们可以从相同的样本研究的mRNA和miRNA。验证RNA的完整性，生物分析仪后，我们会进行一个中等通量定量实时PCR（qPCR）的使用Taqman探针低密度阵列卡（TLDA）和基因表达研究感兴趣的成绩单，识别exosomal miRNA的。
这些协议可以用于量化的患者中，啮齿动物模型和药物干预前，后的细胞培养基改变exosomal的miRNA。不同的Exosomal内容来源及细胞分泌外来体的生理条件。这些变化，可以了解单元和系统如何应对压力或生理扰动。我们的有代表性的数据展示Variations的miRNA纯化小鼠血液，人体血液和人体细胞的培养基中存在的外来。
在这里，我们将介绍的程序定量分析miRNA和外来的信使RNA（mRNA）的分泌在血液和细胞培养基。纯化的外来的特点将是感兴趣的mRNA的的exosomal标记和PCR使用免疫印迹分析。透射电子显微镜（TEM）和免疫金标记将被使用的，来验证exosomal的形态和完整性。从这些外来体将纯化总RNA，以确保我们可以从相同的样本研究的mRNA和miRNA。验证RNA的完整性，生物分析仪后，我们会进行一个中等通量定量实时PCR（qPCR）的使用Taqman探针低密度阵列卡（TLDA）和基因表达研究感兴趣的成绩单，识别exosomal miRNA的。
这些协议可以用来量化的改变，在exosomal miRNA的我Ñ患者，啮齿类动物模型，药物干预前后细胞培养基。不同的Exosomal内容来源及细胞分泌外来体的生理条件。这些变化，可以了解单元和系统如何应对压力或生理扰动。我们的有代表性的数据显示变化的miRNA存在于外来鼠标血，人体血液和人体细胞培养介质纯化
Introduction
短期非编码的miRNA调节基因表达靶mRNA结合。种子序列〜7个碱基对的互补性使miRNA的结合到靶mRNA，导致翻译抑制或减少的mRNA的稳定性，这两者都可以导致靶蛋白1的表达减少。在过去十年的研究明确证明的基础性作用的miRNA介导细胞功能。同时也出现了相当大的努力，朝向解剖的miRNA介导的分子变化相关的各种疾病2,3。此外，最近鉴定稳定的miRNA在体液4-6铺平了道路，利用他们作为新型生物标志物，适合于临床诊断。
外来体，小囊泡携带基因，蛋白质，脂类介质，和miRNA通过全身血液circulat的受体细胞是通过体液中miRNA的运输模式之一离子7-14。这将导致在受体细胞的基因表达的调制和蜂窝通信代表了一种新的机制。例如，细胞可以调节分泌和/或参与炎症如白细胞介素-1β（IL1β），肿瘤坏死因子-α（TNFα）的含有生物分子的吸收外来的免疫调节过程，转化生长因子-β5（TGFβ5），并调节这些基因的miRNA 13。由于miRNA表达异常在人体多种疾病的共同特点是，这些分子的发现和验证新的治疗目标2提供了激动人心的新机遇。
循环miRNA是存在的所有体液中，它被称为外来的组成是不同的，根据他们被释放源细胞。因此，他们提供了一个途径来研究细胞的生理状况和细胞改变信号甚至TS压力，包括疾病。研究切体成分的改变，可以提供洞察信号转导，并探讨其潜在效用作为生物标志物或治疗干预航线。
在这里，我们将展示发布的协议的基础上，从多个来源的外来的净化。这些将用于RNA分离qPCR的识别和测量水平的miRNA存在于外来外来。
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Protocol
所有实验中使用人类和啮齿动物的血液样本，符合所有有关准则，法规和监管机构执行。人类受试者参加知情同意后批准的德雷克塞尔大学Drexel的机构动物护理和使用委员会批准使用动物进行研究医学伦理审查委员会的一切手续。
1。外切体净化血液（约5.5小时）
TIPS
- 我们重悬外来一管血300μlRNA提取裂解液从mirVana miRNA分离试剂盒（〜10毫升人体血液和小鼠血〜2毫升）。
- 为了纯化从细胞培养基的外来体，介质旋转，在500×g离心10分钟以除去细胞，并以12,000×g离心分离后，通过0.22微米的过滤器过滤。外切体净化细胞培养基不需要稀释在PBS，PBS洗或的第二超速离心步骤。
- 如果纯化的外来体将用于蛋白质组学研究，超速离心步骤后，加入蔗糖梯度离心步骤将减少量的蛋白聚集体和污染物15。
- 外来体可以观察到的形态有所不同，这取决于同时在源和用于TEM的处理步骤。我们并没有观察到样品处理9,15差异归因于先前已外来杯形形态。我们的TEM照片，包括免疫标记类似于以前的报告从不同的来源，其中包括血液，胆汁和皮质文化衍生的外来9,16,17。
- 反转涂覆EDTA管中，血液5倍和地点直立10〜60分钟，在室温下。
- 在4℃下2000×g离心15分钟离心收集的顶层，血浆，在15毫升管中并保持在冰上。
- 稀释液用等体积的PBS。以2000×g离心30分钟，在4℃下
- 转入离心管，加的总体积为24ml的PBS洗涤，并在4℃下以12000×g离心45分钟
- 转移到超速离心机管，并以110,000 xg离心2小时，在4°C
- 重悬沉淀在PBS中，在4℃下以100,000 xg离心1小时
- 在适当的缓冲液中悬浮颗粒（RNA裂解缓冲液）。
- 重悬在PBS或RIPA缓冲电子显微镜和免疫印迹分析。
2。 RNA纯化用改进的mirVana miRNA分离试剂盒（约1小时）
TIPS
- 佩戴个人防护装备（PPE），分离RNA核糖核酸ZAP擦拭表面和移液器，并使用无菌过滤嘴和管准备的区域。
- 添加一个列上的DNase处理步骤，除去可能存在的DNA痕迹。根据外来的来源，DNA已经从一些消息来源，包括鼠标和人体的肥大细胞线8，但已发现染色体的DNA序列外来媒体纯化心肌细胞的18纯化外来缺席。
- 我们减少洗涤液的体积1至350微升（下面的步骤2.4），因为供应商提供足够的清洗液1 700μL此外。如果不降低音量没有足够的解决方案，使用整个套件内容留下。其余的步骤，根据制造商的建议进行。
- 加入1/10 VOmiRNA的的匀浆添加剂（30微升）和孵育10分钟冰lume明。
- 提取物的体积为基磺酸 - 苯酚：氯仿等于初始的溶胞产物的体积。在新的管中，离心回收上层相。
- 添加1.25卷100％的乙醇（375微升）。涡街流量计。适用于过滤盒和以10,000×g离心15秒。
- 加入推荐量的miRNA洗涤液1（350微升）的一半，并以10,000×g离心15秒。
- 对每个样品中加入10微升DNA酶1〜70微升缓冲液RDD（Qiagen公司）。加入80微升列，并在室温下孵育15分钟。
- 添加洗涤液1（350微升），并以10,000×g离心15秒。
- 添加清洗液2/3（500微升），并在10,000×g离心15秒。重复。
- 洗脱用40微升95℃下无核酸酶的H 2 O的
- 确定RNA浓度的RNA稀释至100毫微克/微升。
3。布卢外来体miRNA表达谱d使用Taqman探针低密度阵列（TLDA）的卡（约6.5小时）
TIPS
- 通过佩戴个人防护装备，分离RNA核糖核酸ZAP擦拭表面和移液器，并使用无菌过滤嘴和管准备的区域。
- 预扩增步骤是建议（前置放大器）1-350纳克RNA（350-1,000纳克样品不需要前置放大器的一步合成cDNA后）。重要的是要确定是否前置放大器为您的样品是必要的，因为你必须把所有的样品在同等条件下。前置放大器的步骤增加了成本和Ct值有一个较低的可接受的切断（32，而不是40）。
- 它是有用的，而不是根据卡的数量，可以运行在一个单一的天的板，以制备的cDNA的反应在条形管。这将减少在同一天，将不被处理的cDNA样品冻融。
- 外来体从不同来源收集有不同租金额的RNA。此协议允许最多3微升RNA为模板的cDNA合成反应的。根据不同来源，可以被孤立的exosomal RNA的量可能有限。而一个典型的组织会产生足够的RNA的cDNA，将100毫微克的RNA在3微升的体积，从人血或人类细胞培养基的外来通常含有较少的RNA和cDNA的必须由较少的起始原料。小鼠血液中的外来体含有较高水平的RNA，可以通过以下方式获得至少100毫微克3微升。
- 要使用的Megaplex池纯化RNA制备cDNA逆转录引物（甲组及乙组B包含miRNA的引物微阵列卡A和B），冰解冻反应组分。
- 标签两个RNase-free的1.5毫升管RT反应池的引物或乙组的引物，并添加组件图表顺序。添加至少一个额外的元件体积为2个或更多的反应，或使主结构建议采用t他的供应商。
| RT反应成分 | 成分浓度 | 1个样本的体积（的总V /样品= 4.5微升） |
| 无核酸酶水 | 0.20微升 | |
| 的Megaplex RT缓冲液（10X） | 1X | 0.80微升 |
| dNTPs浓度（100毫米） | 4.4毫米 | 0.20微升 |
| 氯化镁 （25毫米） | 5毫米 | 0.90微升 |
| RNase抑制剂（20U/μl） | 2 U | 0.10微升 |
| A或B的Megaplex RT引物（10X） | 1X | 0.80微升 |
| MultiScribe逆转录酶 | 75ü | 1.50微升 |
- 反转管6次，占简要rifuge。然后，移液管4.5微升RT反应混合到微安8管条或96孔微安的光学反应板。
- 添加100 ng的RNA和音量调整到3微升DEPC处理过的水或加3μl总RNA，搅拌枪头，密封管或板。短暂离心，并在冰上孵育5分钟。
- 将反应到PCR仪，并在下列条件下运行（建议由美国应用生物系统公司的Megaplex池协议）：
| 舞台 | 温度 | 时间 |
| 周期（40X） | 16°C | 2分钟 |
| 42°C | 1分钟 | |
| 50°C | 1秒 | |
| 持有 | 85°C | 5分钟 |
| 持有 | 4°C | ∞ |
- 储存在-20℃下（至少一个星期好）的cDNA或继续预放大器的步骤可以被存储为1个星期。
- 甲组和乙组的冰解冻前置放大器的引物，并转化为混合。漩涡Taqman探针前置放大器主也并保持在冰上。
- 按照图表添加至少一个额外的元件体积为2个或更多的反应，或由供应商建议的高手组合。
| 前置放大器反应成分 | 1个样本的音量 |
| 无核酸酶水 | 7.5微升 |
| Taqman探针前置主混音（2X） | 12.5微升 |
| A或B的Megaplex前置放大器引物（10X） | 2.5微升 |
- 吸取2.5μLRT机生产线克拉到8管带或96孔微安的光学反应板和分配22.5微升前置放大器各孔中的反应混合液到微安。
- 密封板，在冰上孵育5分钟，然后装入样品放入PCR仪。在下列条件下运行。
| 舞台 | 温度 | 时间 |
| 持有 | 95°C | 10分钟 |
| 持有 | 55°C | 2分钟 |
| 持有 | 72°C | 2分钟 |
| 周期（12X） | 95°C | 15秒 |
| 60°C | 4分钟 | |
| 持有 | 99.9°C | 10分钟 |
| 持有 | 4°C | ∞ |
- 前置放大器反应结束后，短暂离心管或板，然后向每孔或管中加入75μl的0.1X TE pH为8.0。
- 密封和混合简单旋转。稀释后的产品存放在-20℃下为1个星期，或继续加载板。
- 组合下列RNase-free的1.5毫升管中，在冰上。
| 元件 | 1卡的体积 |
| TaqMan通用PCR预混无AmpErase UNG（2X） | 450微升 |
| 摊薄前置放大器产品 | 9微升 |
| 无核酸酶水 | 441微升 |
- 反转管混合并短暂离心。免除100微升PCR反应混合成的TaqMan microRNA的阵列卡的每个端口。
- 离心卡2×1,000×g离心1分钟。密封卡，并运行它使用Applied Biosystems公司手册和384 Taqman探针低密度阵列设置中的引物提供的模板。我们使用使用Applied Biosystems 7900HT快速实时PCR系统。
4。 mRNA的分析采用TaqMan（约1.5小时）
- 要准备的qPCR反应，反应组分混合，在图表中的顺序。所有的样品进行分析与感兴趣的作为标准的基因和18S rRNA基因的基因的引物探针。
| Taqman探针反应成分 | 1个样本的音量 |
| 无核酸酶水 | 7微升（调整个别样品的基础上） |
| Taqman探针快速预混（2X） | 10微升 |
| Taqman探针引物探针（20倍） | 1微升 |
| 从100纳克RNA基因 | 2亩L（调整基于个别样本） |
- 运行（使用Applied Biosystems 7900HT快速实时PCR系统）制造商的建议，使用快速的96块96孔板。
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Representative Results
从血液或细胞培养介质隔离外来后，外来的纯度可以测试通过电子显微镜（EM）和免疫印迹（ 图1A和1B）。我们证实了我们的外切体的制剂， 图1A示出从各种来源与EM和使用多个抗体的免疫印迹。确认外来体具有直径约30 -100 nm处是完整的，并包含CD81的免疫金标记的EM图像。常用的exosomal标记是Hsp70和tetraspannin的家庭糖蛋白CD63，CD81和CD9 14。确认纯化的外来的完整性之后，我们进行了免疫印迹HSP70 图1B表明，外来仅当媒体（阴性对照）不包含热休克蛋白70。生物分析仪跟踪显示，外来孤立从RAW细胞培养基中含有多种的RNA，但不包含大量的核糖体RNA，是典型的RNA从整体细胞（ 图1C）。图1D示出了从全血和来自血液的外来体的mRNA的定量PCR分析。我们能够隔离500毫微克〜10毫升人体血液使用mirVana miRNA的隔离套内的exosomal RNA。该的qPCR结果表明基因编码肿瘤坏死因子和血管内皮生长因子的存在（VEGFA）纯化外来以及全血。
除了基因表达研究的定量PCR总RNA，也用于miRNA表达谱。的miRNA的TLDA卡3.0版包含〜758个miRNA包括内对照RNA U6的引物探针。与另外的预扩增步骤中，供应商建议30 ng的RNA到运行TLDA卡。这是很有用的用于分析RNA的纯化从血清或人的血液，通常具有较低的产率，比从小鼠血液中纯化的外来。用250 ng的RNA的miRNA进行分析， 如图2所示，从小鼠血外来和15-30纳克exosomal的RNA从人类血液或人体主动脉内皮细胞（HAOEC）。我们的研究结果表明89 miRNA在小鼠血液，人体血液中的外来体，209个miRNA和199个miRNA在人体细胞培养介质外来收集外来的存在。 6 miRNA的有代表性的数据作为增量Ct值归一化到U6核糖核酸内源性啮齿动物的血液（ 图2A），人体血液中（ 图2B）和HAOEC细胞培养基中（ 图2C）所示。虽然的miR-126和miR-200c的外来啮齿动物的血液或分别HAOEC媒体缺席，其余4个miRNA是目前在所有三个样本数额不等。相对于从细胞培养基中纯化的外来体，miR-223的表达外来从人类和啮齿动物的血液样本在更高的水平。
图1。风帆ansmission电子显微镜（TEM），使用从各种来源纯化的外来基因的印迹分析和定量RT-PCR。再悬浮于1％的戊二醛（左）或RAW细胞来源的外来体再悬浮于4％多聚甲醛）小鼠血液中外来体的TEM图像，标记为10 nm的黄金和兔抗CD81（右）和斑点关于福尔瓦碳包覆栅极的电磁分析（比例尺= 100纳米）B）西方分析HSP70纯化小鼠血液或外切体自由媒体RIPA缓冲液：C + / - 24小时孵化RAW 264.7小鼠细胞和悬浮在外来）的总RNA的生物分析仪分析外来来自RAW 264.7细胞培养介质D）纯化总RNA纯化获得具有代表性的人为控制的全血和外来用来比较的表达水平TNFα和VEGFA 点击这里 。查看大图。
图2。相对表达外来体中发现的miRNA分数。阈值循环（CT值）是一个单独的miRNA的浓度在PCR反应中，CT值较低的相对度量表示高表达。正常化为六个检出exosomal的miRNA qPCR的值以U6 RNA和三角洲CT值绘制的外来三个来源。负值表示此图中的高表达。从啮齿动物的血液（A）和人体血液中的外来体（B）表示，HSA-MIR-223比控制在较高的水平，从HAOEC细胞培养基（C）表示，而外来HSA-MIR-223比控制在较低的水平。 HSA-MIR-226是从啮齿动物血液外来缺席，HSA-MIR-200C从HAOEC外来缺席。
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Discussion
在这个协议中，我们展示了通过差速离心纯化的外来从血和文化媒体的miRNA和mRNA的定量。外来体取决于其原产地有不同的组成部分，并参与了一些生物功能，包括免疫反应，抗原呈递细胞内的沟通，转移RNA和蛋白质9,11,12,19,20。大小和形状是外切体纯度的一个决定性因素，一些论文EM外来的数据表明，这些囊泡的范围可以在大小和形态的基础上从哪个源分泌，以及用于固定的方法和成像9 ，15。可接受的尺寸为30-100 nm的外来体，是一个平均的范围，其中包括一小口外来体具有较大的直径取决于源21,22，其中一个原因，多种方法被用来验证exosomal纯度。分泌的miRNA有许多必要的featur除了 各种疾病的潜在治疗目标2,3,24良好的生物标志物23 ES。这种净化方法提供了一种非侵入性的方法来描述时间从各种体液的生物变化在exosomal内容而定量PCR miRNA表达谱，miRNA的内容提供了全面的概述。超过4500种蛋白质，1639的mRNA的764个miRNA和194脂是已知的用外来体25（ www.exocarta.org ）和在某些情况下，这些生物分子水平的变化已经被链接到疾病状态相关联。在我们的研究中，从人体血液中纯化的外来许多miRNA在与外来媒体从培养的人类细胞系，但显着差异从exosomal小鼠血液中发现的miRNA纯化。虽然有miRNA的目标只有一个基因的例子，许多miRNA的功能部分减少的水平MULTIP文件的目标，导致强烈的生理反应。特性驻留在外来的mRNA和miRNA的切体介导的信息传递和循环的miRNA介导的基因表达变化的作用提供独特的洞察。从各种来源的外来体的纯化和鉴定，将有利于在确定这些分泌囊泡相关的分子特征。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项研究是支持的资金丽塔艾伦基金会授予Seena阿吉特。笔者想从南卡罗来纳州电子显微镜仪器的使用，科学和技术援助中心大学的埃里卡巴洛格和Soumitra Ghoshroy博士的承认。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) | BD Diagnostics | 366643 | For exosome purification from human blood |
| EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) | BD Diagnostics | 367841 | For exosome purification from mouse blood |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | For miRNA isolation from total blood |
| miRVana microRNA isolation kit | Ambion | AM1561 | |
| Acid-Phenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | For TLDA cards |
| Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444747 | |
| Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp human pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman MicroRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
| Tumor necrosis factor (primer probe) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Vascular endothelial growth factor A (primer probe) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | For mRNA |
| HSP70 antibody | Abcam | ab94368 | For western blot |
| Anti-rabbit IgG-Gold | Sigma | G7402 | For electron microscopy |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Nickel 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Ni | |
| Copper 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Table 1. Table of specific reagents. | |||
References
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