Summary
切片文化促进胚胎发育的基因和药理学的扰动操作。然而，文化条件必须确保可以继续正常发展的片内减少环境。我们说明了一个协议，有利于脊髓发育正常进行至少24小时。
Abstract
切片培养的胚胎发育可以方便的操作都通过药理学和基因操作。这降低了系统潜在的致命的副作用，由于全身药物的应用是可以克服的。然而，文化条件必须确保正常发展所得的片内减少环境。我们一直专注于脊髓的发展，尤其是脊髓运动神经元。我们系统地不同的培养条件的鸡胚胎切片，的点最脊髓运动神经元诞生了。我们测定存活培养期间和运动神经元的位置的那些相比， 在体内的运动神经元的数目和类型。我们发现，培养期间需要血清型和神经营养因子，并能够保持为至少24小时，并允许这些运动神经元迁移到适当的位置中的运动神经元存活脊髓。我们提出这些培养条件和方法，准备使用嵌入在琼脂糖全净膛鸡胚胎的胚胎切片文化和切片用一个vibratome。
Introduction
在正常胚胎发育过程中，许多不同类型的细胞生成，必须从他们的角度原产地迁移，在那里他们将最终在成熟的有机体的功能。脊髓内的显影，在中线位于脑室区祖细胞，并生成许多亚型的有丝分裂后的神经元和神经胶质细胞，这些细胞必须迁移到融入功能的神经元的感官处理所需的电路和电机输出1。脊髓运动神经元控制四肢肌肉的收缩已被广泛研究，多是已知的分子和机制，推动形成不同的子类。然而，更何况是运动神经元迁移，分离和接收突触输入的机制。
运动神经元亚型的身份获得在开发过程中在一个分层的方式。运动神经元亚型可大致归我置身于不同的列，被定义为他们的轴突预测的部门和游泳池。汽车列项目轴突为轴向，内脏或四肢的肌肉。汽车部门细分的肢体投影到那些投射到腹部或背部肌肉的运动神经元电机外侧柱（LMC）。运动神经元群内的部门，被称为电机池项目单独的肌肉，肢体的2，3。肢体突出的运动神经元中定义的由它们的表达的转录因子FOXP1 4，5，而分割的身份是其特征在于，表达的同源结构域的转录因子胰岛-1（腹侧凸）或LHX-1（背侧凸）6。事实上，LHX-1的表达所需的适当的背突起的运动神经元7。这些亚型占据不同的位置，在脊髓腹侧突出的运动神经元来居住内侧背投影法纳克运动神经元。结果被隔离在大麦哲伦星云所谓的LMCmedial（LMCm）和LMClateral（LMCl）部门。池组织部门和电机的收购分为两个阶段8。在第一阶段中，分割偏析实现通过侧向时尚内侧的特性的运动神经元的迁移。 LMCl细胞后，将产生的LMCm细胞等LMCl的通过的LMCm移动实现其最终停留位置。第二阶段运动神经元内的分工和集群成运动神经元池，大概是通过一个背腹排序，运动神经元。已经示出连环蛋白依赖的古典钙粘蛋白家族的成员，是至关重要的两个阶段的运动神经元组织8-10。然而，钙粘蛋白功能如何控制细胞运动知之甚少。
收购柱状，部门和池标识需要外在的信号，这种模式本质安全C表达的转录因子11。此外，约50％的运动神经元死亡通过细胞凋亡在正常发展的一个过程，需要从肢体的外在信号，主要是通过神经营养支持的运动神经元生存。因此，运动神经元的发展，需要适当的环境，以保持在一个相对长的时间过程。出于这个原因，产生脊髓切片培养的实用性，以保持运动神经元存活所需要的适当的培养条件下的澄清。往前的胚胎切片培养已被用于跟踪的行为非本质加入纯化的神经元群体的12-14。然而，据我们所知，在片本身在原地运动神经元的存活和迁移的培养条件，促进尚未公布。我们修改一个标准的文化条件，有利于生存的纯化，分离颅运动神经元，以方便米OTOR神经元内的胚胎切片文化系统的发展。我们还监测了定位尚存的运动神经元的，并表明主要为正常的位置的运动神经元师培养期间获取。
Protocol
1。制作所需的解决方案
- 1 M磷酸盐缓冲液：称取的109.4克Na 2 HPO 4和32克的NaH 2 PO 4 H 2 O中 ，混合和溶解在水中，至总体积为1升。
- 磷酸盐缓冲盐水（PBS）中：准备的0.1M磷酸盐缓冲液，0.15M NaCl的。 100毫升PBS中应足以从10胚胎的处理的片。
- 琼脂糖：热的PBS溶液至约70℃，并缓慢加入固体低熔点琼脂糖同时不断搅拌。使该溶液至终浓度为4％（重量/体积）的琼脂糖。使50毫升该溶液中的库存。发布此解决方案水浴中，保持在48℃，直到需要。实验后的未使用的任何的琼脂糖溶液在4℃下，可以存储为几个星期。
- 抗体块解决方法：添加小牛血清和Triton X-100的到最后concentr的梁漱溟的1％（V / V）胎牛血清，0.1％（体积/体积）的Triton X-100的PBS。 5片冰冻切片的免疫块解决方案的10毫升就足够了。
- 固色剂：准备0.75毫米氢氧化钠，4％（W / V）多聚甲醛（小心）。为了制备固定液热所需的量的水至70℃，添加浓NaOH到所需的最终浓度，添加固体多聚甲醛和混合直至溶解。冷却冰至4℃。 10毫升该溶液就足够了的20口油井的胚胎切片。
- 蔗糖溶液：准备10毫升含0.1M磷酸盐缓冲液的30％（重量/体积）蔗糖溶液。 10毫升该溶液就足够了胚胎切片和10口井。
- 70％（体积/体积）乙醇，70毫升无水乙醇稀释，用30毫升的水。
- 培养基：准备的溶液的1％鸡胚胎提取物，1％青霉素/链霉素，0.35％L-谷氨酰胺，0.1％2 - mercaptoethanol，4％鸡血清，2％B27补充剂和100纳克/毫升ciliaryneurotrophic的生长因子（CNTF）所有在neurobasal培养基稀释;制备在冰上，并用的同一天。 10毫升培养基所需的20井胚胎切片。
2。鸡胚制备
- 地点受精母鸡鸡蛋的最长边的水平在强制通风孵化器在38°C，直到他们开发阶段15 24。这通常需要大约4天的潜伏期。
- 在培养的第二天，灭菌的蛋壳，浸泡在70％乙醇用纸巾擦拭。小心地刺进使用21号针头连接到一个5毫升注射器取出5毫升白蛋白的蛋壳的扁平端。这降低了胚胎离壳所以胚胎的外壳被打开时，不被损坏。返回蛋的孵化器和孵化他们的另外2天。
- 用迟钝杜蒙特＃5镊子Çarefully捅破了约9厘米2的外壳顶部中间的外壳和删除。周围的胚胎切割，并小心的胚胎，并在HBSS剥离时。胚胎应根据汉堡和汉密尔顿（1992）15上演。所有的胚胎应该是在近阶段24。任何的胚胎表现出任何异常迹象，应被丢弃。
- 删除羊膜，绒毛膜尿囊膜，头部和尿囊两个杜蒙特＃5镊子。剔骨的胚胎取出所有内脏器官。要做到这一点，剖开腹中的胚胎微解剖剪刀，一个钳子举行的胚胎周围的喙主干区域，抢头端的一部分，肠道和心脏和尾部拉。重要的是，这样做是干净的。你应该能够清楚地看到胚胎体节。一半，横向切胚胎之间的上肢和下肢buds.Now修剪胸体采用显微切割剪刀墙。
3。胚胎切片的制备
- 卸下的琼脂糖溶液从水浴中。一次性3毫升的塑胶巴斯德吸管的底部切5厘米。
- 轻轻地取出腰椎的解剖胚胎用两个镊子摇篮的胚胎解剖的解决方案，并将其放置在一个干燥的培养皿中的一半。使用巴斯德移液管，取出约2毫升的琼脂糖，吸移管约0.5毫升的胚胎的顶部，然后进入移液管吸胚胎切片。在胚胎转移和琼脂糖进行剥离，远离塑料模具照顾，不引入任何气泡在琼脂糖。轻轻地将胚胎在塑料模具的底部的琼脂糖与胸部朝下。胚胎应定位要直接使用21号针头。切片也将包含在显影肢体的一部分，它是重要的，在琼脂的胚胎的取向OSE会允许这样做。将艇上冰的琼脂糖。要小心，胚胎不改变方向在此期间（约2分钟）。
- 徕卡：VT1000S vibratome（速度，频率，400微米厚的片），应设置与切片室充满了HBSS，周围环绕着冰冷的水。琼脂糖块，然后粘超级胶水的vibratome平台。在琼脂糖块修整用剃刀刀片与它周围的琼脂糖1-3毫米离开胚片。选择，包括肢芽的部分有明显的顶外胚层rigde切片，这些切片，然后放置在HBSS。一般来说，有只有一到两个合适的片每个胚胎。轻轻地取出琼脂糖周围的组织切片，用两针。至关重要的是，这样做是彻底和仔细。
4。培养胚胎切片
- 加入500毫升培养液的必需参数（如上所述）24孔超低附件处理的组织培养板的孔的数目。片小心地从入井的HBSS溶液转移。在一般情况下，我们尝试在各孔中有两到三个切片。 24孔组织培养板在培养箱中在37℃下放置24小时，用5％的CO 2。
5。切片的切片，免疫组化染色
- 文化时期，加入500μl的无缓冲修复，每口井的胚胎切片，留在冰上20分钟。总溶液然后小心地除去和3的PBS洗涤，用5分钟的时间间隔进行。的切片，然后留在蔗糖溶液，在4℃，直到切片水槽中，约6小时，但可以离开的时间（ 例如过夜）。
- 约5分钟，取出切片，然后轻拍掉额外的蔗糖溶液中平衡约1毫升OCT在20°C每片安装在一个充满OCT-剥离的塑料模具持平。安装后，将模具垂直上干冰巩固。
- 安装OCT块，在-24°C的低温恒温器和平衡块约20分钟。将每个切片，用15毫米的部分安装对的Superfrost加幻灯片。幻灯片可以储存于-80℃直到需要它们。
6。免疫
- 移液器1-2毫升PBS持在潮湿的腔室与从腔室底部（我们使用1或2毫升塑料移液器用高压釜磁带固定）提出的幻灯片上水平滑动。孵育在PBS中的部分在20℃下5分钟，以除去过量的OCT取出PBS溶液从滑动和块溶液加入500毫升的部分，温育30分钟，在20℃下删除的块的解决方案，并立即加入500毫升稀释的抗体添加到幻灯片，在4°C孵育18-22小时。
- 移除第一抗体溶液，并立即h的幻灯片用1ml PBS中5分钟，3次，在20℃，以除去过量的第一抗体溶液。加入500毫升稀释后的二抗的部分。在20°C 30分钟的幻灯片，然后离开。的二次抗体溶液，然后除去和滑动洗涤3次，在20℃下在PBS中的5分钟
- 这些清洗后，取出最后PBS冲洗，DAB的幻灯片边缘以去除多余的PBS，加两滴vectashield幻灯片上的，轻轻打下了的盖玻片超过的部分，避免泡沫的形成。删除多余的Vectashield印迹从之前的幻灯片的边缘成像。
7。成像
- 图像的免疫染色的部分。我们使用了尼康的Eclipse E80i配备了一个Hamammatsu ORCA ER数码相机，10倍，20倍和40 X物镜的荧光显微镜。
Representative Results
使用培养的片一直遵循的发展interneuron和投射神经元影响力的进展我们对组织产生的内皮层16。在脊髓运动神经元的发展一直遵循文化的整个斑马鱼胚胎17。然而，在斑马鱼的脊髓运动神经元组织是相对简单的（由于缺乏鱼的大型四肢肌肉）。该驱动器的脊髓运动神经元组织层次的高等脊椎动物的发展过程中的分子机制知之甚少。在高等脊椎动物的胚胎切片文化，促进神经元的存活和细胞体迁移，因此需要培养条件。目前，脊髓切片培养的高等脊椎动物已被用于种子解离的神经元的顶部片12-14，调查荧光标记的切片的外周中的神经轴突18，或祖细胞早期脊髓发育行为19。片培养条件后脊髓，尤其是那些保持运动神经元发展目前所缺乏的。
为了试图脊髓运动神经元脊髓神经元的发育，特别是，我们研究了各种文化条件，可能会促进运动神经元的存活和运动组织通过横向迁移的神经元的初始订单收购。使用阶段18阶段20鸡胚脊髓切片的初步试验证明无果而终，我们不能够保持运动神经元存活超过几个小时的时间，并不能证明代相当数量的LMCl细胞的培养周期（数据未示出）。因此，我们研究阶段，24胚片文化的一个时间点时，大多数的LMCl和LMCm神经元已经产生，但是当LMCl神经元的迁移仍然是在我nfancy（ 图1A-C）。这种横向的LMCl神经元的迁移，主要是完成阶段27，约24至36小时后（ 图1 DF）。因此，我们的分析可以被简化为能够保持活着的神经元，以协助他们迁移到腹角横向。我们开始我们的实验中，使用相对简单的培养条件下，只包含Hank氏平衡盐溶液的鸡血清或鸡胚提取物带或不带。在所有情况下，尽管我们能够保持LMC切片中的神经元，我们发现几乎没有证据表明LMCl神经元保持（至少LHX-1的表达）。此外，我们发现不适当表达的基因，如HB9在脊髓背角， 在体内的 （数据未示出）的情况下，永远不会发生。因此，这些简单的文化条件不适合的收购运动神经元组织的调查。
因此，我们找到了更复杂的条件[NS和使用的碱的配方已发布，以方便分离的鸡胚脑神经运动神经元的存活。此条件20（1％鸡胚提取物，1％笔链球菌，0.35％L-谷氨酰胺，0.1％2 -巯基乙醇，2％马血清，2％B27补充剂和50纳克/毫升ciliaryneurotrophic的生长因子（CNTF）在neurobasal培养基（这里称为格思里中等），并保持活着比更简单的媒体更多的运动神经元。此外，它没有导致在杂散表达的转录因子在脊髓背角。然而，在生存的LMCl神经元是穷人（ 图1 GI， p）的，因此，我们改变我们认为是关键因素的Guthrie介质，即动物血清的来源，血清中的浓度和睫状神经营养因子在培养基中的浓度，我们发现，改变从马血清的血清小鸡血清和CNTF的浓度增加，从50毫微克/毫升至100毫微克/毫升的大幅增加吨他的的LMCl和LMCm细胞的生存，也允许他们迁移到脊髓前角超过24小时的培养条件（ 图1 JL，P）。运动神经元的总数，比LMCm LMCl和，的确，迁移的LMCl细胞到腹侧角出现非常相似的部分的胚胎被允许开发卵内 ，而不是在该切片培养（ 图1 KO，P）。因此，我们认为，基于转录因子的表达，细胞数量和位置的运动神经元，切片培养条件概括正常的脊髓运动神经元的发展至少在24小时内。
图1。 A - C。代LMC的状态（FOXP1染色b）和LMCl（LHX-1染色在 a）中，在阶段24。 c是一个合并的两个通道。中线作为a和D中的虚线所示，V表示的脊髓背腹轴（D，V）的取向。D - F。 。G - 我的状况：LMC（d） 中 FOXP1染色和LMCl（LHX-1染色在 e）组织阶段27。f是一个合并的两个通道。 LHX-1（g）和FOXP1（ 小时 ）在部分支持颅运动神经元细胞的存活（我们的“初始培养基”的Guthrie介质，见参考文献20），在培养基中培养的切片中表达。 LHX-1的是，不再在运动神经元中表达，虽然有一些LMC证明FOXP1表达细胞的生存。 ，D，V（g）中示出的脊髓背腹轴（D，V）的取向。 ML显示的正中侧面（M，L）的s轴的方向皮纳尔线的J - 升 。 LMCl细胞（LHX在腹侧角在 j-1）和LMC一般（FOXP1 在 k）中可以观察到在含有4％鸡血清和100 ng / ml的睫状神经营养因子的培养基中培养的切片。请注意，在腹侧角的横向位置被发现在一些LMCl细胞。 （j）条中的箭头示出了一些的LMCl细胞的横向位置。 （L）是一个合并的两个通道。 米- O。 LHX-1（m）和FOXP1（n）中的胚胎内的胚胎在 j - 升所示的切片培养过程中保持在卵的表达状况。 （O）是一个合并的两个通道。定量的百分比的LMCl（FOXP1 + VE / LHX1 +）细胞与LMC（FOXP1 + VE / LHX1-VE）在片文化在不同条件下的细胞中发现的Çompared控制卵 （占100％） 中保持的胚胎。学生的t检验***表示p <0.01。 点击此处查看大图 。
Discussion
这里所描述的协议允许的鸡胚胎切片保温一天以上，同时保持运动神经元的存活，并继续培养期间迁移。在阐明的条件，以保持运动神经元的存活，我们已经确定了几个主要特点。高达4％的小鸡血清它似乎是关键的运动神经元的生存和它的替换与来自不同物种的血清是不能容忍的。有趣的是，我们发现，较高浓度的血清的存在下，不利的，因为它们促进导致严重扭曲切片中的形状的组织过度生长的切片。神经营养因子cilliary的存在下，更重要的是，也被证明是至关重要的。它仍然是一个明显的可能性，可能可以相当长的时间，比只是24小时进行培养，甚至允许可视化感觉传入输入到脊髓切片。此外，CULTURE条件，也可能是有用的切片文化的发展脑干和中脑/小脑。
或许这些切片的培养条件下，在使用的最大的潜在的好处是，它们促进蛋白质的功能，同时尽量减少潜在的胚胎的其余部分上的不利影响，如心脏药理操纵的可能性。大量的不同的信号通路抑制剂和激动剂可用于评估不同的脊髓神经元亚型的迁移和潜在的，他们在开发过程中形成的局部脊髓电路的影响。此外，一些基因蛋白的表达，如那些利用siRNA和吗啉代寡核苷酸，受到扰动的事实，他们只能在开发初期推出（中在OVO电过程碍于）和效果只持续短期内添E（通常为一天）。我们的片文化在稍后阶段开始，并让使用这种技术的可能性在发展期间，文化的切片切片阶段，以查看效果。
片培养协议，也可以让双方脊髓运动神经元，以及作为背interneuron的迁移时间的推移实时通过视频显微镜的可视化。这可以实现白色光下使用相差显微镜或通过使用荧光成像。如果后者的技术被使用，则需要引入荧光标记。这可能通过引入如荧光染料DiI荧光或DIO来实现，也可以通过任逆行标记从肢体或顺行标签从心室或卵内的电驱动荧光蛋白，在神经元的一个子集的结构。
Disclosures
的作者都没有相互竞争的利益或利益冲突。
Acknowledgments
我们想了很多精辟的讨论和B Novitch抗体的一种恩赐，感谢沙龙大话FOXP1。资助这项工作从威康信托基金会的助学金KCT和SRP（的格兰特参考号094399/B/10/Z）从威康信托基金会的项目资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Henry Stewart Farms, UK | Fertilised Brown Bovan Gold Hen's eggs (Henry Stewart Farms, UK), stored at 14 °C until incubation | |
| 21 Gauge needle | BD-Microlance-3 | 304432 | |
| 5 ml syringe | BD Plastipak | 302187 | |
| #5 Dumont forceps | Roboz | RS 5045 | |
| Micro Dissecting scissors | Roboz | RS 5910SC | (3.5 in straight) |
| Embryo embedding moulds: Peel away moulds | Agar Scientific | G3764 | Pyramidal shaped 22 mm to 12 mm |
| Super glue | Power Flex, Loctite | ||
| Ethanol | SIGMA | 32221 | |
| Sodium di-hydrogen Phosphate, mono-hydrate | BDH | 102454R | |
| Di Sodium mono-hydrogen Phosphate | VWR/ BDH | 102494C | |
| Sodium Chloride | VWR/BDH | 27810.295 | |
| Low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10500-064 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| Sodium Hydroxide | FLUKA | 71689 | |
| Paraformaldehyde | VWR/BDH | 28794.295 | |
| Plastic disposable pasteur pipettes | ElKay Precision laboratory consumables | 127-P503-000 | Liquipette 3 ml volume |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170 | |
| Sucrose | SIGMA | S0389 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | SIGMA | S5761 | |
| Chicken Embryo Extract | Seralabs | CE650-J | |
| Penicillin/ Streptomycin solution | Gibco | 15070 | |
| L-Glutamine solution | Gibco | 25030 | |
| 2-mercapt–thanol | Gibco | 21985 | |
| Horse serum | Southern Group Labs | 9028B | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Neurobasal medium | Gibco | Cat ~ 2103 | |
| CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) | R and D Systems | 557-NT-010 | |
| Chick Serum | SIGMA | C5405 | |
| Primary antibodies | were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank, with the exception of anti-foxP1 antibodies, which were a kind gift from Bennett Novitch of UCLA. Primary antibodies dilutions were Rabbit anti-FoxP1 (1/32000), Mouse anti-Lhx1/2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). All antibodies were stored at 4 °C. |
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| Secondary antibodies | Donkey anti-Guinea Pig (cy3) (1:1000) purchased from Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-Rabbit (Alexa Fluor 594) (1:1000) purchased from Invitrogen All antibodies were stored at 4 °C. |
||
| 24-well plate | Corning COSTAR | 3473 | ultralow attachment 24-well plate |
| O.C.T. | Tissue Tek, Sakura | 4583 | Optimum Cutting Temperature |
| Vectashield | Vector Labs | H1000 | Vectashield fluorescent mounting medium |
| Slides | Thermo Scientific | Superfrost-Plus positively-charged slides, 25 x 75 x 1.0 mm | |
| Cover Glass | VWR International | 631-0167 | 25x60 mm |
| Forced draft incubator: | Lyon Electric Company | kept humid by ensuring water levels always sufficient, maintained at 38 °C | |
| Cryostat | Brite, Huntingdon, UK | -36 °C | |
| Tissue Culture Incubator | DH Autoflow | Nuaire 38 °C, 5% CO2 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT1000-S | |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse E80i fluorescence microscope | |
| Digital Camera | Nikon | Nikon DS5M and Hamammatsu ORCA ER |
References
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