Summary
Esta técnica proporciona um método para colher, normalizar e quantificar o crescimento intracelular das bactérias, que são pré-cultivadas em células hospedeiras naturais protozoários antes da infecção de células de mamíferos. Este método pode ser modificado para acomodar uma grande variedade de células hospedeiras para a fase de escorvamento, bem como tipos de células-alvo.
Abstract
Muitos agentes patogénicos bacterianos intracelulares, protozoários usar água doce como um reservatório natural para a proliferação no ambiente. Legionella pneumophila, o agente causador do legionário pneumonia, ganha uma vantagem sobre patogénico em bactérias cultivadas in vitro quando a primeira colheita a partir de células de protozoários antes da infecção de macrófagos de mamíferos. Isto sugere que os factores de virulência importantes não podem ser adequadamente expressas in vitro. Nós desenvolvemos um sistema tratável para o priming L. pneumophila através do seu hospedeiro natural protozoário Acanthamoeba castellanii antes da infecção de células de mamíferos. A contribuição de qualquer factor de virulência podem ser examinados, comparando o crescimento intracelular de uma estirpe mutante de tipo selvagem de bactérias depois de priming protozoário. Expressando GFP-L. de tipo selvagem e mutante estirpes pneumophila são utilizadas para infectar monocamadas de protozoários num passo de escorvamento e deixada atingir a fase tardia de crescimento intracelular. Bactérias fluorescentes são então colhidas a partir destas células infectadas e normalizados por espectrofotometria para gerar números comparáveis de bactérias para uma subsequente infecção em macrófagos de mamíferos. Para quantificação, as bactérias vivas são monitorizados após a infecção através de microscopia de fluorescência, citometria de fluxo, e por plaqueamento de colónias. Esta técnica destaca e conta com a contribuição de anfitrião a expressão do gene de células-dependente, imitando o ambiente que seria encontrado em uma rota de aquisição natural. Esta abordagem pode ser modificado para acomodar qualquer bactéria que utiliza um hospedeiro intermediário como um meio para a obtenção de uma vantagem patogénico.
Introduction
Numerosos agentes patogénicos bacterianos adaptaram estratégias generalizadas de explorar as células hospedeiras para a sua sobrevivência e replicação num compartimento intracelular. Em muitos casos, os mecanismos patogénicos são semelhantes entre protozoários e metazoários células. No entanto, estes dois microambientes são muito diferentes e podem resultar em expressão diferencial de factores de virulência 1-4. A doença dos legionários bactéria Legionella pneumophila é onipresente associada com ambientes de água doce em todo o mundo 5. Importante, L. pneumophila cultivado em células de protozoários antes da infecção dos monócitos humanos ganhar uma vantagem patogénicas, o que sugere que os perfis de expressão gênica global da bactéria que sai de uma célula de protozoários são diferentes do que a do organismo cultivado in vitro em 6-8. Na natureza, a água doce amebas fornecer nutrientes limita ricos para amplificação rápida de uma bactéria invasora. Aquisição humana de L. pneumophila é o mais frequentemente atribuída a inalação de gotículas de água contaminada que contém a bactéria. É provável que essas gotículas porto protozoários associados a células de bactérias, células de protozoários, onde são mais resistentes a práticas convencionais de tratamento de água 9,10. Infecção de macrófagos alveolares do pulmão procede de uma maneira praticamente idêntica à do ciclo de vida da bactéria intracelular em células hospedeiras de protozoários 11-13.
A fim de sobreviver e de se replicar em células eucariotas, L. pneumophila utiliza um tipo especializado sistema de secreção IVb denominado Dot / Icm para entregar cerca de 300 '"proteínas efectoras para o citosol da célula hospedeira 14-16. Estas proteínas efectoras funcionar colectivamente subverter processos celulares, a fim de gerar um compartimento de replicação para a bactéria permissiva 17,18. Deleções em qualquer um dos 26 genes que compreendem o resultado transportador Dot / Icm de estirpes defeituosas de mult intracelulariplication 19-23. Historicamente, a deleção de genes individuais que codificam efetores raramente resultou em estirpes atenuadas para o crescimento intracelular. Esse fenômeno tem sido atribuída a várias hipóteses, incluindo função redundante e cópias parálogas de efetores.
Alguns factores de virulência são apenas expressas no contexto do hospedeiro associada a células de crescimento intracelular 24. Nós racionalizado que se um efector específico foi expresso apenas no contexto da infecção por protozoários, em seguida, a contribuição do efector não pode ser comparada com uma estirpe de tipo selvagem, quando ambos foram cultivadas in vitro. L. pneumophila transições de um replicativa a uma fase transmissivo enquanto entra na fase estacionária da cultura 25. O fenótipo de comutação fase representa o esgotamento de nutrientes encontrados durante crescimento intracelular e é exemplificada através de montagem de flagelos para a motilidade 26. Porque L. pneumophila é mais invasive e virulenta quando colhido a partir de células de protozoários, buscou-se desenvolver um ensaio que mais fielmente representado o estado patogênico da bactéria quando encontrou macrófagos de acolhimento.
Para este fim, foi desenvolvido um ensaio de escorvamento versátil protozoário que pode acomodar qualquer hospedeiro adequado para ambos os primeiros (cell priming) e segunda (infecções de células alvo) de palco. O processo de infecção é tratável através da utilização de bactérias que expressam de forma estável a proteína fluorescente verde (GFP). O modelo de infecção pelo protozoário Acanthamoeba castellanii segue uma metodologia amplamente utilizado no campo 27. Para o passo de activação, L. estirpes pneumophila são cultivados in vitro até à fase estacionária em meios líquidos para produzir rotulados 'transmissivos "bactérias (Figura 1A). As bactérias são depois utilizadas para infectar monocamadas de A. castellanii durante 18 horas para atingir uma fase tardia do ciclo de vida intracelular. Grandes vacúolos contêmbactérias ção pode ser visualizada nesta altura utilizando a microscopia de fluorescência (Figura 1A). As células são então lisadas por protozoários e bactérias recuperadas a partir do lisado são medidos para a emissão a 512 nm utilizando um leitor de placas de fluorescência. A fluorescência é proporcional à densidade óptica para calcular multiplicidade de infecção (MOI) durante a infecção das células alvo (figura 1, * Curva de correlação). Após invasão (T 0) e 18 horas pós-invasão (T 18), as células alvo são quantificadas por fluorescência, que representa as bactérias intracelulares. A fluorescência pode ser monitorizada por microscopia e citometria de fluxo, e a contagem de viáveis pode ser medido através de plaqueamento de colónias. O ensaio de priming é sempre acompanhada por infecções de tipo selvagem L. pneumophila e de uma estirpe deficiente em Dot / Icm sistema de secreção de tipo IV (Δ DOTA) (Figura 1A). Este importante fornece controles internos para comparações diretas entre um tipo selvagemnd quaisquer estirpes isogénicas mutantes utilizados no processo de infecção. A inclusão da estirpe avirulenta DOTA Δ durante a fase de escorvamento estabelece um limiar para a observação de fenótipos de crescimento atenuado associados isogénicas estirpes mutantes que são cultivadas in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação das Culturas Legionella pneumophila para infecções Estágio Escorvante
- Transformar toda L. estirpes pneumophila utilizados no ensaio com as pAM239 plasmídeo, que codificam uma isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) induzível da proteína verde fluorescente (GFP) 28. Streak as estirpes bacterianas em ferro e de cisteína suplementado N-(2-Acetamido)-2-aminoetanossulfónico (ACES) tamponada carvão ágar com extracto de levedura (CYEA) contendo 6,25 ug / ml de cloranfenicol (CM) (para a manutenção do plasmídeo) e incubar durante 72 hr a 37 ° C.
- Transferir um inoculo da estirpe bacteriana em ACES suplementados tamponada caldo de extracto de levedura (AYE) com 6,25 ug / ml de CM e IPTG 1 mM e cultivar até à fase estacionária (O / N) num agitador orbital a 37 ° C.
- Confirmar a expressão da GFP em culturas in vitro, utilizando a microscopia de fluorescência. Transferem-se 10 ul de cultura sobre uma lâmina de vidro sob uma coberturadeslizamento e imagem através de uma objectiva 60X com excitação GFP / cubo de emissão (AMG EVOS fl).
- Diluir uma alíquota de 100 ul de cada cultura in vitro utilizando a 1:10 estéril H 2 O. Faça um branco usando 100 ul AYE media com IPTG 1 mM e 6,25 ug / cm ml e água. Tome OD600 medições das diluições usando um espectrofotómetro (Bio-Rad inteligente Spec Plus). Calcula-se o volume necessário para infectar um bem a um MOI = 20 para cada cultura in vitro: V = [(ameba seeded) x MOI] / [OD 600 x (factor de diluição) x (constante)] = [(1 X 10 6 ) x (20)] / [OD 600 x (10) x (1 x 10 6)] = 2/OD 600. Concentração de bactérias é determinada como OD 600 = 1,0 = 1 x 10 9 CFU / ml.
2. Infecção Priming palco usando Acanthamoeba castellanii
- Manter e cultivar as amebas em meio ATCC PYG 712 em 175 cm 2 frascos de RT.
- Substituir a mídia em cul amebasturas 24 h antes do início das culturas bacterianas de líquidos. No mesmo dia, líquidos culturas bacterianas são iniciados, recolha e contagem de células num microscópio de luz, utilizando um hemocitómetro.
- Diluir as amebas com meio fresco para uma concentração final de 1 x 10 6 células / ml. Semente 12 poços de células placas de cultura com alíquotas de 1 ml da amebas utilizando um pipetador de repetição e incubar à temperatura ambiente O / N.
- Após incubação, lava-se os poços das placas de 12 poços de cultura de células 3x com 1 ml de PBS estéril através de uma pipeta de 10 ml serológicos e um auxiliar de pipeta manual.
- Após a aspiração do PBS, adicionar 1 ml de meio de infecção (ATCC 712 media PYG menos glicose, peptona, extrato de levedura e) com IPTG 1 mM e 6,25 ug / ml cm a cada poço. Incubar as placas à temperatura ambiente durante 1 h.
- Infect poços a um MOI = 20. Centrifugar a placa a 400 xg durante 5 min (Eppendorf 5810R) e flutuar num banho de água a 37 ° C durante 5 min. Transferir a placa para um de 37 ° C, 5% CO 2 incubadora durante 18 horas.
- Confirmar as infecções usando imagens de células vivas em um microscópio de fluorescência antes de sediar a lise celular e colheita de bactérias.
3. Semeando células THP-1 para a Target Infecção estágio celular
- (Comece este processo 24 horas antes de definir-se líquidos culturas bacterianas). Cultivar células THP-1 a 75, em cm 2 frascos de cultura para quase-confluência em meio RPMI 1640 com 10% inactivado pelo calor de soro fetal bovino (FBS).
- Contar as células em suspensão utilizando um hemocitómetro, diluir as células THP-1 em meio RPMI 1640 com FBS a 10% e 100 ng / ml de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) para uma concentração de 1 x 10 6 células / ml , e prato em alíquotas de 1 ml em placas de 12 poços de cultura de células. Incubar as placas durante 48 horas a 37 ° C, 5% CO 2.
4. Transformação de bactérias para a Target Infecção estágio de célula após a infecção Estágio Priming
- Aspirar a mídia da amebas preparado.
- Lisam a ummoebae usando 500 ul de gelo frio, estéril de ultra-filtrado (UF) de H 2 O e incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
- O pool de lisados de acordo com o tipo de estirpe e tomar uma medida nm E 512 para cada um dos lisados agrupados utilizando um leitor de placas de fluorescência (Molecular Devices Spectramax Gêmeos EM).
- Calcule um OD 600 de medição para os lisados agrupados: calcOD 600 = 0,0008 (E 512 - fundo lisado) + 0,0019. A fórmula foi previamente determinada representando graficamente uma comparação directa de ambos o OD 600 e os E 512 nm medições de diluições de L. pneumophila GFP do tipo selvagem expressar de fase estacionária de cultura in vitro (Figura 1 *). Os lisados de ameba não infectado, sujeitos às mesmas condições experimentais, a ameba infectada, são utilizadas como um espaço em branco, e desde um valor de correcção (por exemplo, fundo lisado), que foi incorporado na equação. O volume necessário tó infectar um bem a um MOI = 20 é calculada para cada pool de lisado: V = [(THP-1 sem sementes) MOI x] / [calcOD 600 x (constante)] = [(1 X 10 6) x (20)] / [calcOD 600 x (1 x 10 6)] = 20 / calcOD 600.
- Lave as células THP-1 3x com PBS e adicionar 1 mL de RPMI fresco 1640 (10% de FBS) em cada poço. Incubar as células THP-1 durante 1 hora a 37 ° C, 5% CO 2.
- Infectar as células THP-1 na MOI calculada usando os lisados pool. Permitir que um conjunto de cavidades de não ficam infectadas, servindo como um controlo negativo para a análise de citometria de fluxo. Processamento da fase de escorvamento deve ser concluída em menos de 30 min. Os lisados foram mantidos em gelo para limitar as alterações na expressão de genes de bactérias antes da infecção.
- Centrifugar a placa, flutuar para aumentar a temperatura, e incubar como na fase de escorvamento.
- Uma hora após a infecção, que remove o suporte por aspiração e lavar os poços 3x com PBS para remover as bactérias extracelulares.
- Adicione 1 ml fresh RPMI 1640 (10% de FBS) aos poços e devolver a placa à incubadora. O tempo imediatamente após a troca de mídia serve como tempo zero (T 0). Incubar as células THP-1 de 14-16 horas a 37 ° C, 5% CO 2.
5. Análise Experimental
5,1 imagens de células vivas
Imagem cavidades infectadas, utilizando um microscópio de fluorescência (AMG EVOS fl) em 10X ou 20X de ampliação (Figuras 1A-D). As imagens podem ser comparadas, quer qualitativamente ou quantitativamente para determinar os níveis de infecção em ambas a fase de escorvamento e de infecções alvo estágio de células.
A citometria de fluxo 5,2
- Os picos de emissão de infecções diferentes podem ser comparados através de citometria de fluxo (FACS Calibur BD). Tripsinizar as infectadas células THP-1 e gentilmente lavá-los a partir dos poços através da mistura em PBS com uma pipeta.
- Reunir as células de tipo tensão em tubos Falcon de 15 ml e de pelotas a 1800 xg durante 2min na centrífuga de topo de mesa.
- Suspender as pelotas em 1 ml de PBS e transferir para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Centrifugar as suspensões a 1.800 x g (Eppendorf 5424) e re-suspender as pelotas em 1 ml de PBS. Se as suspensões resultantes são altamente turva (OD 600 ≥ 1.0) eles devem ser diluídos em PBS adicional (1:3), para evitar o entupimento das linhas no citómetro de fluxo.
- Use PBS estéril filtrada para equilíbrio do citómetro de fluxo e para as etapas de lavagem entre as injecções de amostra. Traça-se a dispersão para a frente / lateral de células alvo infectadas, antes da injecção de amostras-alvo da infecção das células.
- Colete 20.000 eventos totais para cada condição utilizando 488 nm do laser de excitação e o canal FL1.
- Portão populações de células pós-captura para excluir as células não infectadas e uma intensidade de fluorescência na trama de um histograma (FlowJo) (Figura 1E).
5,3 placas CFU
- Examinar a eficiência of infecção por CFU plaqueamento das células recolhidas por citometria de fluxo. Preparar diluições em série das amostras de ultra-filtrada H 2 O, 10 1, 10 -2, 10 -3 e.
- Placa de 20 ul de cada diluição para 1/3 de uma placa CYEA com 6,25 ug / ml de CM.
- Incubar as placas a 37 ° C durante 72 h.
- Contar as colónias, usando um palito e contador de células.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um resultado típico para o processo de infecção toda está delineado na Figura 1. Viver micrografias de células de fluorescência mostrando monocamadas de A.castellanii infectadas com o tipo selvagem L. pneumophila durante a fase de escorvamento é mostrado na Figura 1A. Uma medida de sucesso da etapa de iniciação levaria a uma população de cerca de 90% das células hospedeiras que contêm grandes vacúolos preenchidos com bactérias marcadas com GFP neste MOI. Às 18 horas pós-infecção, mais A., castellanii células atingiram máximos cargas bacterianas ainda lise da população é mínimo. Sob microscopia de luz, uma infecção priming sucesso irá revelar amebas arredondado e destacado. Gentamicina [25 ug / ml], pode ser adicionado ao meio de cultura de 30 min a 1 h após a infecção, para eliminar a contribuição das bactérias extracelulares. O Δ Dota cepa mutante, que não pode suportar Dot / Icm mediada translocação de efetores, não deve crescer emA. castellanii e, embora a cultura in vitro devem fluorescência, bem como a estirpe de tipo selvagem, a fluorescência mínima deve ser detectado com esta estirpe em 18 horas após a infecção. Amebas aparecerá plana e a monocamada deve estar intacta.
Lisados totais abrigando L. pneumophila e detritos célula hospedeira são imediatamente sujeitas a análise espectrofotométrica, a fim de calcular a concentração de bactérias na amostra. MOI pode ser calculada usando a curva de correlação (Figura 1 *). As células alvo deve ser preparado para a infecção por bactérias de tal modo que são utilizados activadas menos de 30 min após a lise de preservar a integridade dos perfis de expressão de genes. Uma vez infectadas, as células alvo foram incubadas durante 14-18 horas antes de serem processadas. Micrografias da fluorescência na Figura 1B demonstram a vantagem adquirida pela protozoário patogénico para ferrar o tipo selvagem L. pneumophila nas infecções de células alvo de estágio A. castellanii quando comparado com a estirpe idêntica que foi limitado a cultura in vitro antes da infecção. Infecções alvo estágio de células são menos robustas do que a fase de iniciação devido à inclusão de um passo de lavagem de 1-2 horas pós-infecção (célula alvo-dependentes). Esta etapa de substituição media remove bactérias não invasivos, sincronizando a infecção e reduzir a fluorescência de fundo em aplicações subsequentes. Figuras 1C-D mostram micrografias de fluorescência de um típico do tipo selvagem L. pneumophila cenário infecção de duas fases, onde as bactérias são primeiro preparadas através da infecção de A. castellanii, colhido a partir de células lisadas por protozoários, quantificados utilizando a curva de correlação e utilizados para infectar células THP-1 de macrófagos durante 14 h.
Depois de microscopia, as células são tripsinizadas para a citometria de fluxo (FACS Calibur BD). As células não infectadas são utilizados para calibrar o aparelho para a frente e dispersão lateral. Infecções com cada cepa são processosed com 20.000 eventos registrados. FlowJo software 7.6.1 é usado para analisar os dados brutos. Tipicamente, a fluorescência (excitação a 488 nm) é primeiro plotados contra dispersão lateral para identificar a fluorescência de fundo da população de células não infectadas. Parcelas são fechado para excluir esta população e re-desenhado como um histograma de contagens totais versus intensidade de fluorescência. Como cada célula bacteriana representa uma unidade de fluorescência, a intensidade do sinal dá uma representação da carga vacuolar em cada célula infectada. Uma curva típica de uma infecção do tipo selvagem é mostrada na Figura 1E. No geral, o número relativo de células infectadas detectados pelo citómetro de fluxo é inferior à prevista por comparação com os dados de microscopia. Citometria de fluxo ao vivo célula é sensível o suficiente para detectar variações no entanto tensão.
Quantificação do total de UFC nas amostras é realizada através da geração de uma série de diluições das células preparadas para citometria de fluxo e revestimento subsequenteem CYEA mídia. Após 72 h, a 37 ° C, colónias individuais devem ser evidentes e esparso suficiente para contagem.
Figura 1. Protozoário priming e infecções alvo celulares palco usando Legionella pneumophila. A. do tipo selvagem ou de secreção do tipo IV deficiente (Δ Dota) L. estirpes pneumophila foram induzidas a expressar a GFP através de cultura in vitro (quadros pequenos) e utilizados para infectar A. castellanii monocamadas de 18 horas à MOI = 20. Micrografias de fluorescência de infecções com cada L. pneumophila estirpe são mostrados (frames grandes) como uma fusão de contraste de fase e E 512 nm imagens de fluorescência com uma objectiva 20X de um microscópio de fluorescência (AMG EVOS fl). Crescentes verdes são representativos de vacuolesharbori intracelularng L. pneumophila. B. micrografias de fluorescência de GFP 18 horas de infecção de células alvo de fase A. castellanii com o tipo selvagem L. pneumophila colhidos a partir da infecção por protozoários priming fase (topo) ou cultivadas in vitro (em baixo), em que a MOI = 10 para cada uma foi calculada utilizando a equação derivada da curva de correlação mostrado (azul *). A curva foi produzida utilizando diluições em série do tipo selvagem L. pneumophila expressando GFP a partir de um 18 horas de cultura in vitro. C. Fluorescência micrografia de uma infecção de A. fase de escorvamento castellanii com o tipo selvagem L. pneumophila como em (A) micrografia de fluorescência. D. de um alvo de 14 hr a infecção de células de fase PMA THP-1 diferenciadas com macrófagos do tipo selvagem L. pneumophila colhidos a partir da infecção por protozoários priming na fase (C). O MOI = 20 foi calculada utilizando a equação derivada da corcurva de relação apresentada (* azul). O quadro apresentado é uma fusão de contraste de fase e E512 nm imagens de fluorescência como em (a) histograma. E. de dados de citometria de fluxo comparando não infectados macrófagos THP-1 (vermelho) e células infectadas com o protozoário preparado do tipo selvagem L. pneumophila (verde). Barra de escala = 100 mm. Clique aqui para ver maior figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A expressão do gene bacteriano é rigorosamente controlado por meio de uma combinação de progressão do ciclo de vida e resposta a sinais do micro-ambiente circundante. Patógenos vacuolares, tais como L. pneumophila responder a uma grande variedade de hospedeiros de células derivadas de pistas quando compartimentado em um fagossoma. Como resultado colectivo de exaustão de nutrientes na célula hospedeira, a bactéria compensa por expressar factores necessários para a difusão bem sucedida para uma célula hospedeira posterior 25. L. pneumophila adaptado para eficientemente parasitam uma grande variedade de células de protozoários e, portanto, abriga uma extensa lista de proteínas efectoras para dinamizar este processo. Estas proteínas efetoras são translocados diretamente no citoplasma do hospedeiro durante a infecção pelo Dot / Icm sistema de secreção tipo IVb 16. Translocação da proteína efectora é necessária, como mutações que resultam num transportador defeituoso completamente anulassem crescimento intracelular em qualquer tipo de célula hospedeira. Curiosidadeusly, delecções individuais em particular proteínas efectoras raramente resultou na atenuação do crescimento intracelular. Cerca de 300 proteínas efetoras, ou quase 10% do genoma que codifica a proteína foram validados como Dot / Icm substratos 14,15. Várias hipóteses surgiram para explicar a falta de fenótipos observáveis por deleções efectores, incluindo a presença de cópias parálogas ou a aquisição de enzimas horizontal ortólogos resultantes da ampla gama de hospedeiros de L. pneumophila.
Porque L. pneumophila ganha uma vantagem patogénicos quando pré-cultivados em células de protozoários (Figuras 1A-B), que argumentaram que as bactérias em cultura in vitro não exibem o perfil de expressão do gene aparente mesmo em bactérias que saem do hospedeiro protozoário. Portanto, a expressão de determinadas proteínas efectoras só podia ser induzida no contexto de crescimento intracelular em células de protozoários. Se um efector específico não foi induzida por e-xpression durante a cultura in vitro, que a contribuição do efector excluído não pode ser eficazmente avaliado num cenário infecção tradicional. Fenótipos de factores de virulência importantes para o estabelecimento de infecção ou disseminação só seriam detectados nas infecções prolongadas que permitiram a propagação de células de células. Por conseguinte, procuraram desenvolver um ensaio capaz de medir a contribuição de factores de virulência potenciais, no contexto de uma infecção sequencial. No caso dos naturais L. pneumophila aquisição, é provável que um hospedeiro humano iria encontrar uma bactéria que havia sido preparado para a infecção de uma célula de protozoário; onde protozoários podem ser mais resistentes às práticas tradicionais de água municipais de tratamento de 10.
A fim de optimizar a purificação parcial de uma quantidade suficiente de bactérias condicionadas, primeiro estabeleceu uma estirpe de L. visualmente tratável pneumophila usando IPTG induzível gfp ucantar plasmídeo cópias transmitidas do locus gfp. Nós também gerou uma inserção única cópia cromossómica de IPTG gfp induzível sobre o genoma de tipo selvagem. Apesar de ambas as estirpes de fluorescência in vitro e durante a infecção, o número mais elevado de cópia do plasmídeo gfp-borne produzido de sinal suficiente para aplicações a jusante no ensaio. Foi estabelecido que a utilização de caldo L. cultivadas pneumophila a um MOI = 20 foi suficiente para infectar fortemente A. monocamadas castellanii. Dezoito horas de incubação foi determinado como óptimo para a visualização de grandes vacúolos fluorescentes sem atingir uma fase de lise da célula hospedeira (Figura 1A). Monocamadas protozoários não são respeitadas plásticos de cultura de células, e são, portanto, facilmente perturbado com as etapas de lavagem. Placas de 12 poços de cultura de células produzidas as monocamadas mais estáveis quando comparados com outros vasos (6 ou 24 poços, placa de 10 cm). Porque L. pneumophila não podem crescer no meio de infecção utilizadas em thpasso priming e, optamos por abandonar qualquer etapa de lavagem para remover as bactérias extracelulares. Isto melhora o rendimento de ameba infectada na monocamada. Gentamicina é também frequentemente usado para matar as bactérias extracelulares. Descobrimos efeitos de toxicidade protozoários em concentrações acima de 25 ug / ml, e não encontraram diferenças no número total de bactérias recuperadas a partir da fase de infecção de escorva em 18 horas. Lise da monocamada de células foi realizada com o protozoário gelada ultra-filtrada H 2 O, um solvente que osmoticamente compromete a célula hospedeira sem prejudicar L. pneumophila. Se adaptado para uso com agentes patogénicos que não são estáveis em H 2 O, 0,1% de Triton X-100 em PBS pode ser utilizado para lisar as amebas com resultados semelhantes.
A fim de comparar directamente estirpe para estirpe diferenças de infecções celulares subsequentes alvo, uma equação foi gerada para correlacionar a densidade óptica de bactérias a 600 nm com emissão de fluorescência de GFP em 512 nm (Figure 1 *). Optou-se por utilizar emissão de fluorescência como meio de quantificação devido à contribuição grande de detritos célula hospedeira em OD 600 medições de lisados de células eucarióticas. Este fundo elevado contraste com valores insignificantes observados para a emissão a 512 nm a partir dos lisados mesmos. Os valores de OD 600 = 1,0 = 1x10 9 CFU / ml foram pré-determinado para L. pneumophila, permitindo o cálculo da concentração de bactérias ao longo de um amplo intervalo de valores de fluorescência. Muitos organismos estabeleceram valores de UFC por OD 600 = 1,0, o que permitiria a aplicação desta técnica para qualquer outro patogénio através da geração de uma curva de correlação com base na emissão de fluorescência. Optou-se por evitar uma etapa de purificação bacteriano durante a lise das células de protozoários, a fim de: 1) a maximizar o rendimento de bactérias imunizadas disponível para a infecção de células alvo e 2) minimizar o tempo entre a colheita e infecção subsequente de preservar p expressão global geneatterns.
Cultivados in vitro do tipo selvagem L. pneumophila foi induzida a expressar a GFP durante 18 horas com 1 mM de IPTG. Diluições em série desta cultura foram utilizadas para as medições espectrofotométricas. Usando a equação derivada, infecções de células alvo foram rotineiramente realizados em MOI variável com uma saída consistente. Uma MOI de 10 produziu aproximadamente 1/2 do número de células totais infectadas, quando comparado com as infecções que receberam uma MOI de 20 (Figuras 1A-B). Nós testamos três hospedeiros de células-alvo com este ensaio; A. castellanii, murinos J774 e macrófagos humanos PMA-THP-1 diferenciadas macrófagos. Em cada exemplo, a infecção resultante nunca foi tão robusta como a infecção priming ao mesmo MOI (Figuras 1C-D). Nós determinamos que a que um passo de lavagem adicional, durante a fase de infecção de células alvo, o que é executado para tanto sincronizar a infecção de células alvo e reduzir as bactérias extracelulares, é responsible por essa observação. No entanto, é crucial que a experiência é internamente controlada com uma estirpe de tipo selvagem para ambos o priming e infecções alvo estágio de células. Quantidades de bactérias recuperadas na fase de escorvamento é bastante limitativo para infecções subsequentes, por conseguinte, apenas um único tipo de células alvo deve ser usado por experiência.
Quantificação da infecção das células alvo foi obtida por meio de três métodos neste ensaio. A microscopia de fluorescência foi utilizada com uma objectiva 20X. Imagens de vacúolos abrigando L. pneumophila foram contadas manualmente a partir de vários campos para cada estirpe testada. A análise de citometria de fluxo fornecida uma medida sensível às diferenças nas células totais infectadas, bem como uma aproximação da carga vacuolar; onde um maior sinal de fluorescência foi relacionada com a contribuição de sinal GFP a partir de um número crescente de L. células pneumophila. Diluição em série fornecido valores quantitativos para o número totalde volume por CFU nas amostras de células colhidas por citometria de fluxo. Coletivamente, esses métodos permitem resultados plenamente tratáveis e quantificáveis em um cenário de infecção sequencial.
O ensaio de priming é muito versátil e é apropriado para adaptação a qualquer patogénio bacteriano que utiliza protozoários de água doce como um intermediário 29,3 ambiental. A escolha da célula-alvo podem ser atendidas para se ajustar à via de infecção natural para a determinado patógeno. É importante notar que um modelo de infecção sequencial pode ser usado para examinar as estirpes mutantes que não apresentam um fenótipo de crescimento num modelo de infecção em bactérias tradicional usando in vitro. Perfis de transcrição em bactérias cultivadas in vitro para fatores de virulência poderia revelar supostos principais diferenças no perfil de expressão no hospedeiro infectado intermediário. Isso poderia abrir uma nova linha de investigação para a função de proteínas descaracterizados e sua contribuição ao naturalvias de infecção.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Craig Roy e Dr. Dario Zamboni para fornecer um modelo para infecções protozoário. Agradecemos ao Dr. Jagdeep Obhrai, Dr. Georgiana Purdy, Dr. Fred Heffron e Todd Wisner para equipamentos e reagentes; Dr. Lulu Cambronne para revisão crítica do manuscrito. Citometria de fluxo foi realizada no Fluxo de instalação Citometria de Recursos OHSU compartilhado. Este trabalho foi financiado em parte por uma doação da Fundação de Pesquisa Médica de Oregon e uma concessão de NIH R21 AI088275 (EDC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | antibiotic |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| ACES | Sigma | A9758-1KG | media component |
| ATCC medium: 712 PYG | ATCC | growth media for protozoans | |
| 1X PBS | Fisher Scientific | SH30256FS | phosphate buffered saline |
| activated charcoal | Fisher Scientific | C272-212 | media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | media component |
| peptone | BD Diagnostics | 211677 | media component |
| agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | media component |
| L-cysteine, 99%+ | Acros organics | 173601000 | media supplement |
| Ferric nitrate nonahydrate | Fisher Scientific | I110-100 | media supplement |
| Equipment | |||
| EVOS fl | AMG | EVOS fl | fluorescence microscope |
| Smart Spec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | spectrophotometer |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 22627023 | bench top centrifuge |
| Repeater plus | Eppendorf | 22230201 | repeating pipette |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | microplate reader | |
| Softmax Pro 5.3 | Molecular Devices | 0200-310 | microplate reader software |
| 5424 microfuge | Eppendorf | 22620401 | table top microcentrifuge |
| Fast-release pipette pump II | Scienceware | 379111010 | pipette aid |
| FACS Calibur | BD Bioscience | flow cytometer | |
| FlowJo 7.6.1 | FlowJo | license | flow cytometery software |
| 15 ml tube | BD Falcon | 352096 | polypropylene conical tube |
| 1.6 ml microfuge tube | Neptune | 3745.X | microcentrifuge tubes |
References
- Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues. Science. 259, 686-688 (1993).
- Mahan, M. J., et al. Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).
- Rankin, S., Isberg, R. R. Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment. Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).
- Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth. Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).
- Fields, B. S. The molecular ecology of legionellae. Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).
- Cirillo, J. D., et al. Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion. Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).
- Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages. Front Microbiol. 2, 60 (2011).
- Kilvington, S., Price, J. Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure. J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).
- King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination. Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).
- Horwitz, M. A. Formation of a novel phagosome by the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).
- Horwitz, M. A. Phagocytosis of the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil. Cell. 36, 27-33 (1984).
- Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes. J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).
- Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638 Forthcoming.
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Front Microbiol. 2, 136 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Shin, S., Roy, C. R. Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila. Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).
- Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
- Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).
- Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
- Segal, G., Shuman, H. A. Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila. Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Haghjoo, E., Galan, J. E. Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi. Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).
- Molofsky, A. B., Swanson, M. S. Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle. Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).
- Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).
- Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation. Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).
- Neild, A. L., Roy, C. R. Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation. Immunity. 18, 813-823 (2003).
- Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
- Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA. Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).
