Summary
Denne teknik tilvejebringer en fremgangsmåde til at høste, normaliseres og kvantificere intracellulær vækst af bakterielle patogener, der er præ-dyrket i naturlige protozoer værtsceller inden infektioner i pattedyrceller. Denne fremgangsmåde kan modificeres til at rumme en lang række værtsceller til priming fase samt målcelletyper.
Abstract
Mange intracellulære bakterielle patogener anvender ferskvand protozoer som et naturligt reservoir for proliferation i miljøet. Legionella pneumophila, det agens af legionærsyge lungebetændelse, får en patogen fordel i forhold til in vitro-dyrkede bakterier, når først høstet fra protozo-celler før infektion af mammale makrofager. Dette tyder på, at vigtige virulensfaktorer muligvis ikke korrekt udtrykkes in vitro. Vi har udviklet en medgørlig system til priming L. pneumophila gennem sin naturlige protozo host Acanthamoeba castellanii før pattedyrcelle infektion. Bidraget af en virulensfaktor kan undersøges ved at sammenligne intracellulær vækst af en mutantstamme med vildtype-bakterier efter protozoisk priming. GFP-udtrykkende vildtype og mutant L. pneumophila-stammer anvendes til at inficere protozo-monolag i en pennen og tillades at nå sene trin af intracellulær vækst. Fluorescerende bakterier høstes derefter fra disse inficerede celler og normaliseret ved spektrofotometri til at generere tilsvarende antal bakterier for en efterfølgende infektion i mammale makrofager. Til kvantificering, er levende bakterier overvåges efter infektion ved hjælp af fluorescensmikroskopi, flow-cytometri, og ved koloni udpladning. Denne teknik fremhæver og bygger på bidrag fra værtscellen-afhængig genekspression ved at efterligne miljøet, som ville blive mødt i en naturlig erhvervelse rute. Denne fremgangsmåde kan modificeres til at passe til enhver bakterie, der anvender et mellemled vært som et middel til at få en patogen fordel.
Introduction
Talrige bakterielle patogener har tilpasset generelle strategier til at udnytte værtsceller til overlevelse og replikation i en intracellulær rum. I mange tilfælde er patogene mekanismer ens mellem protozoisk og metazo celler. Disse to mikromiljøer er meget forskellige og kan resultere i forskellig ekspression af virulensfaktorer 1-4. Den legionærsyge bakterie Legionella pneumophila er ubikvitært forbundet med ferskvandsområder verdensplan 5. Vigtigere, L. pneumophila dyrket i protozo-celler før infektion af humane monocytter opnå en patogen fordel, hvilket antyder, at globale genekspressionsprofiler af bakterien forlader en protozo celle er anderledes end det in vitro dyrkede organisme 6-8. I naturen tilvejebringe ferskvand amøber næringsrige begrænset til hurtig amplifikation af en indtrængende bakterie. Menneskelig overtagelse af L. pneumophila er oftest tilskrives inhalation af forurenet vanddråber, der indeholder bakterien. Det er sandsynligt, at disse dråber harbor protozo celleassocierede bakterier, hvor protozo celler er mere resistente over for konventionelle vandbehandling praksis 9,10. Infektion af lunge alveolære makrofager gør dette på en måde, der næsten identisk med den intracellulære livscyklus af bakterien i protozoan værtsceller 11-13.
For at overleve og replikere i eukaryote celler, L. pneumophila anvender en specialiseret form IVb sekretionssystem betegnes Dot / Icm at levere næsten 300 "effektor"-proteiner i cytosolen af værtscellen 14-16. Disse effektor proteiner fungere samlet for at nedbryde cellulære processer for at frembringe en replikations eftergivende kammer for bakterien 17,18. Deletioner i nogen af de 26 gener, der omfatter Dot / ICM transporter resultat i stammer defekte for intracellulær multiplication 19-23. Historisk set sletning af individuelle effektor kodende gener sjældent resulteret i stammer svækkede for intracellulær vækst. Dette fænomen er blevet tilskrevet flere hypoteser, herunder redundant funktion og paralogous kopier af effektorer.
Nogle virulensfaktorer kun udtrykkes i forbindelse med værtscelle-associeret intracellulær vækst 24. Vi rationaliseres, at hvis en bestemt effektor kun blev udtrykt i forbindelse med protozo-infektion, da bidraget fra effektoren ikke kunne sammenlignes med en vildtypestamme, når begge blev dyrket in vitro. L. pneumophila overgange fra et replikativt til en transmissivt fase da den går ind stationær fase i kultur 25. Fasen skift fænotype repræsenterer næringsstof udtynding optræder under intracellulær vækst og er eksemplificeret gennem samling af flageller for motilitet 26. Fordi L. pneumophila er mere invasiontende og ondartet når de er høstet fra protozo celler, vi søgt at udvikle en analyse, som mere trofast repræsenterede patogen tilstand af bakterien, da denne løb vært makrofager.
Til dette formål har vi udviklet en alsidig protozo priming assay, der kan rumme en egnet vært for både den første (priming celle) og den anden (målcelle) fase infektioner. Infektionsprocessen er medgørlig ved anvendelse af bakterier, der stabilt udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP). Infektionen model for protozo Acanthamoeba castellanii følger en metode almindeligt anvendt inden for området 27. For pennen, L. pneumophila-stammer dyrkes in vitro til stationær fase i flydende medier for at fremstille mærkede "transmissive 'bakterier (figur 1A). Bakterier næste anvendt til at inficere monolag af A. castellanii i 18 timer for at opnå et sent tidspunkt af det intracellulære livscyklus. Store vakuoler indeholderING bakterier kan visualiseres på dette tidspunkt ved hjælp af fluorescensmikroskopi (Figur 1A). Protozo-celler lyseres derefter, og bakterier udvundet fra lysatet måles for emission ved 512 nm under anvendelse af en fluorescenspladelæser. Fluorescens er korreleret med optisk tæthed til at beregne multiplicitet-af-infektion (MOI) for infektionen af målceller (fig. 1, * korrelationskurve). Efter invasion (T 0) og 18 timer efter invasion (T 18), er målceller kvantificeret for fluorescens, der repræsenterer intracellulære bakterier. Fluorescens kan overvåges ved mikroskopi og flowcytometri, og levedygtighedstællinger kan måles ved hjælp af koloni udpladning. Den priming analysen er altid ledsaget af infektioner med vildtype L. pneumophila og en stamme defekt i Dot / Icm type IV secerneringssystem (Δ DOTA) (figur 1A). Dette vigtigere giver interne kontroller for direkte sammenligninger mellem vildtype ennd eventuelle isogene mutante stammer, der anvendes i infektionsprocessen. Medtagelsen af den avirulente Δ DOTA-stamme under priming fase fastsætter en tærskelværdi for observation af svækkede vækst fænotyper associeret med isogene mutante stammer, der er dyrket in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Legionella pneumophila Cultures for priming Stage Infektioner
- Omdan alle L. pneumophila stammer, der anvendes i assayet med plasmid pAM239, der koder for et isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) inducerbar grønt fluorescerende protein (GFP) 28. Streak bakteriestammerne over på jern og cystein tilsat N-(2-acetamido)-2-aminoethansulfonsyre (ACES) bufret trækul gærekstraktagar (CYEA) indeholdende 6,25 ug / ml chloramphenicol (CM) (for plasmidopretholdelse) og inkuberes i 72 timer ved 37 ° C.
- Overfør et inokulum af den bakterielle stamme til suppleret ACES bufret gærekstrakt-medium (AYE) med 6,25 ug / ml CM og 1 mM IPTG og dyrke til stationær fase (O / N) på en orbitalryster ved 37 ° C.
- Bekræfter GFP-ekspression i in vitro-kulturer under anvendelse af fluorescensmikroskopi. Overfør 10 pi af kultur på et objektglas under et dækkeslip og billede ved hjælp af en 60X målsætning med GFP excitation / emission cube (AMG EVOS fl).
- Fortynd en 100 gl portion af hver in vitro-kultur til 1:10 med sterilt H 2 O. Lav en tom bruger 100 ul AYE medier med 1 mM IPTG og 6,25 mg / ml cm og vand. Tag OD600 målinger af fortyndinger anvendelse af et spektrofotometer (Bio-Rad Smart Spec Plus). Beregne mængden nødvendig for at inficere en brønd ved en MOI = 20 for hvert in vitro-kultur: V = [(amøbe seeded) x MOI] / [OD 600 x (fortyndingsfaktor) x (konstant)] = [(1 X 10 6 ) x (20)] / [OD 600 x (10) x (1 x 10 6)] = 2/OD 600. Koncentration af bakterier bestemmes som OD600 = 1,0 = 1 x 10 9 CFU / ml.
2. Priming Stage Infektion Brug Acanthamoeba castellanii
- Fastholde og dyrke amøber i ATCC 712 PYG medium i 175 cm 2 kolber ved stuetemperatur.
- Erstat medier i amøber culrer 24 hr før de bakterielle flydende kulturer. Samme dag flydende bakteriekulturer startes, opsamle og tælle cellerne på et lysmikroskop med et hæmocytometer.
- Fortynd amøber med frisk medium til en slutkoncentration på 1 x 10 6 celler / ml. Frø 12-brønds cellekultur-plader med 1 ml af amøber under anvendelse af en gentagen pipettor og inkubér ved RT O / N.
- Efter inkubation vaskes brøndene i 12 brønds cellekultur-plader 3 gange med 1 ml sterilt PBS under anvendelse af en 10 ml serologisk pipette og en manuel pipette støtte.
- Efter aspiration af PBS, tilsættes 1 ml af infektion media (ATCC 712 PYG mediet minus glucose, pepton og gærekstrakt) med 1 mM IPTG og 6,25 ug / ml cm til hver brønd. Pladerne inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.
- Infect brønde ved en MOI = 20. Centrifugeres pladen ved 400 x g i 5 min (Eppendorf 5810R) og flyde i et 37 ° C vandbad i 5 minutter. Overføre pladen til en 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 18 timer.
- Bekræft infektioner med levende cell imaging på et fluorescensmikroskop før vært cellelyse og høst af bakterier.
3. Såning THP-1 celler til målcelle Stage Infektion
- (Begynd denne proces 24 timer før etablering flydende bakteriekulturer). Dyrke THP-1-celler i en 75 cm2 dyrkningskolber til næsten konfluens i RPMI 1640 medium med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS).
- Tælle suspensionsceller anvendelse af et hæmocytometer, fortynde THP-1 celler i RPMI 1640-medier med 10% FBS og 100 ng / ml phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) til en koncentration på 1 x 10 6 celler / ml og plade i 1 ml alikvoter på 12 brønds cellekultur-plader. Pladerne inkuberes i 48 timer ved 37 ° C, 5% CO2.
4. Behandling af bakterier til Target Cell Stage Infektion efter Priming Stage Infektion
- Aspirér medierne fra primede amøber.
- Lyseres amoebae anvendelse af 500 pi iskold, sterilt ultrafiltreret (UF) H2O og inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter.
- Pool lysaterne efter stamme type og tage en E 512 nm målinger for hver af de poolede lysater under anvendelse af en fluorescens-pladelæser (Molecular Devices Spectramax Gemini EM).
- Beregn en OD 600 måling for de poolede lysater: calcOD 600 = 0,0008 (E 512 - lysat baggrund) + 0,0019. Formlen er tidligere bestemt ved plotte en direkte sammenligning af både OD600 og E 512 nm målinger af fortyndinger af L. pneumophila vildtype udtrykker GFP fra stationær fase in vitro-kultur (fig. 1 *). De lysater af inficerede amøbe, forudsat at de samme eksperimentelle betingelser som den inficerede amøbe, der anvendes som en blank og forudsat en korrektion værdi (f.eks lysat baggrund), som blev indarbejdet i ligningen. Volumenet nødvendige to inficere en brønd ved en MOI = 20, beregnes for hvert lysat pool: V = [(THP-1 podet) x MOI] / [calcOD 600 x (konstant)] = [(1 X 10 6) x (20)] / [calcOD 600 x (1 x 10 6)] = 20 / calcOD 600.
- Vask THP-1-celler 3x med PBS, og der tilsættes 1 ml frisk RPMI 1640 (10% FBS) i hver brønd. Inkubér THP-1-celler i 1 time ved 37 ° C, 5% CO2.
- Infect af THP-1 celler ved den beregnede MOI med de samlede lysater. Skabe et sæt af brønde forbliver uinficerede, der tjener som en negativ kontrol til flowcytometrisk analyse. Behandling af priming fase skal være afsluttet på mindre end 30 min. Lysaterne holdes på is for at begrænse eventuelle ændringer i bakteriel genekspression før infektion.
- Centrifuger pladen, flyde at hæve temperaturen, og inkuberes som i priming fase.
- En time efter infektion, fjerne mediet ved aspiration og vaskes brøndene 3 gange med PBS til fjernelse af ekstracellulære bakterier.
- Tilsæt 1 ml fresh RPMI 1640 (10% FBS) til brøndene og returnere pladen til inkubatoren. Tiden umiddelbart efter udskiftning af medier tjener som tiden nul (T 0). Inkuberes THP-1-celler i 14-16 timer ved 37 ° C, 5% CO2.
5. Eksperimentel analyse
5,1 Live-cell imaging
Billed de inficerede brønde med et fluorescensmikroskop (AMG EVOS fl) ved 10X eller 20X forstørrelse (fig. 1A-D). De billeder kan sammenlignes enten kvalitativt eller kvantitativt at bestemme niveauer af infektion i både priming fase og målcelle-stage infektioner.
5,2 Flowcytometri
- Emissionsmålingerne toppe af forskellige infektioner kan sammenlignes med flowcytometri (BD FACS Calibur). Trypsinisér de inficerede THP-1-celler og forsigtigt vaske dem fra brøndene ved blanding i PBS med en pipette.
- Pool cellerne ved stammen skriver i 15 ml Falcon rør og pellet ved 1.800 xg for 2min i bordcentrifuge.
- Suspendere pellets i 1 ml PBS og overføres til 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Centrifuger suspensioner ved 1.800 x g (Eppendorf 5424) og genopslæmmes pellets i 1 ml PBS. Hvis de resulterende suspensioner stærkt uklare (OD 600 ≥ 1,0) de skal fortyndes i yderligere PBS (1:3) for at forhindre tilstopning af linjerne i flowcytometeret.
- Anvende sterilfiltreret PBS til ækvilibrering af flowcytometeret og vasketrin mellem prøveinjektioner. Plotte fremad / sidespredning af uinficerede målceller før injektion af målcelle-infektion prøver.
- Saml 20.000 hændelser i alt for hver tilstand ved hjælp 488 nm laser excitation og FL1 kanalen.
- Gate post-capture cellepopulationer at udelukke ikke-inficerede celler og plot fluorescensintensitet i et histogram (FlowJo) (figur 1E).
5,3 CFU plating
- Undersøg effektiviteten of infektion ved CFU udpladning af cellerne høstet til flowcytometri. Fremstille seriefortyndinger af prøverne i ultrafiltreret H2O ved 10 -1, 10 -2 og 10 -3.
- Plade 20 pi af hver fortynding på 1/3 af en CYEA plade med 6,25 ug / ml CM.
- Pladerne inkuberes ved 37 ° C i 72 timer.
- Kolonierne med en tandstikker og celletæller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et typisk resultat for hele infektionen er skitseret i figur 1.. Levende celler fluorescens mikrografier skildrer monolag af A.castellanii inficeret med vildtype L. pneumophila under priming fase er vist i figur 1A. En vellykket mål af pennen vil føre til en population af omkring 90% af værtscellerne indeholdende store vakuoler befolket med GFP-mærkede bakterier på denne MOI. Ved 18 timer efter infektion, A. mest castellanii celler er opnået maksimale bakterielle belastninger endnu lysis af befolkningen er minimal. Under lysmikroskopi, vil en vellykket priming infektion viser afrundet og løsnet amøber. Gentamycin [25 ug / ml] kan sættes til dyrkningsmediet 30 minutter til 1 time efter infektion for at eliminere bidraget af ekstracellulære bakterier. The Δ DOTA mutantstamme, som ikke kan understøtte Dot / Icm-medieret translokation af effektorer, ikke vokse iA. castellanii og selv om in vitro-kultur bør fluorescere samt vildtype-stammen, bør minimal fluorescens påvises med denne stamme på 18 timer efter infektion. Amøber vises flad og monolaget skal være intakt.
Samlet lysater huser L. pneumophila og værtscelle vragrester umiddelbart underkastet spektrofotometrisk analyse for at beregne koncentrationen af bakterier i prøven. MOI kan beregnes ved hjælp af korrelationskurve (fig. 1 *). Målceller skal forberedes til infektion således, at primede bakterier anvendes mindre end 30 minutter efter lyse for at bevare integriteten af genekspressionsprofiler. Når smittet, er målceller inkuberet i 14-18 timer, før de behandles. Fluorescens mikrografier i figur 1B viser den patogene fordel erhvervet af protozo-primet vildtype L. pneumophila i mål-celle stadiet infektioner af A. castellanii sammenlignet med den samme stamme, der var begrænset til in vitro-dyrkning forud for infektion. Målcelle stage infektioner er mindre robust end den priming fase på grund af optagelse af et vasketrin 1-2 timer efter infektion (målcelle-afhængige). Denne udskiftning af medier trin fjerner ikke-invasive bakterier, synkronisering af infektion og reducere baggrundsfluorescens i efterfølgende applikationer. Figur 1C-D viser fluorescens mikrografier af en typisk vildtype L. pneumophila to-trins-infektion scenario, hvor bakterierne først primet ved infektion af A. castellanii, høstet fra lyserede protozo-celler kvantificeres ved hjælp af korrelationskurve og anvendes til infektion af THP-1-makrofager i 14 timer.
Efter mikroskopi, er cellerne trypsiniseret til flowcytometri (BD FACS Calibur). Ikke-inficerede celler anvendes til at kalibrere maskine til frem-og sidespredning. Infektioner med hver stamme er procesed med 20.000 begivenheder registreret. FlowJo 7.6.1 software bruges til at analysere de rå data. Typisk fluorescens (488 nm excitation) først afbildet mod sidespredning at identificere baggrundsfluorescensen af uinficeret cellepopulation. Plots gated at udelukke denne population og igen afbildet som et histogram af det samlede tælninger over fluorescensintensitet. Fordi hver bakteriecelle repræsenterer en enhed af fluorescens, intensiteten af signalet giver en repræsentation af den vakuolær belastning i hver inficeret celle. En typisk afbildning af et vildtype-infektion er vist i figur 1E. Samlet set relative antal inficerede celler påvises ved flowcytometeret er lavere end forventet, når man sammenligner med mikroskopi data. Levende celler flowcytometri er følsom nok imidlertid at detektere stamme varianser.
Kvantificering af total cfu i prøverne udføres ved at generere seriefortyndinger af celler fremstillet til flowcytometri og efterfølgende udpladningpå CYEA medier. Efter 72 timer ved 37 ° C, enkeltkolonier bør være indlysende og sparse nok til tælling.
Figur 1. Protozo priming og målcelle-stage infektioner med Legionella pneumophila. A. vildtype eller type IV sekretion deficient (Δ DOTA) L. pneumophila stammer blev induceret til at udtrykke GFP med in vitro-dyrkning (små rammer) og anvendt til at inficere A. castellanii monolag i 18 timer ved MOI = 20. Fluorescens mikrografer af infektioner med hver L. pneumophila stamme er vist (store rammer) som en sammenfletning af fasekontrast-og E 512 nm fluorescensbilleder med et 20X objektiv i et fluorescensmikroskop (AMG EVOS fl). Grønne halvmåner er repræsentative for intracellulær vacuolesharboring L. pneumophila. B. GFP-fluorescens mikrografier af 18 timer målcelle fase infektion af A. castellanii med vildtype L. pneumophila høstet fra protozo priming fase infektion (øverst) eller in vitro dyrkede (nederst), hvor MOI = 10 for hvert blev beregnet ved anvendelse af ligningen udledes fra korrelationen vist kurve (blå *). Kurven blev fremstillet ved hjælp af serielle fortyndinger af vildtype L. pneumophila udtrykker GFP fra en 18 timer in vitro-dyrkning. C. Fluorescens mikrofotografi af en primende fase infektion af A. castellanii med vildtype L. pneumophila som i (A). D. Fluorescens mikrograf af en 14 timer målcelle fase infektion af PMA differentierede THP-1-makrofager med vildtype L. pneumophila høstet fra protozo priming fase infektion i (C). The MOI = 20 blev beregnet ved anvendelse af ligningen afledt af de tilsvarenderelation kurve vist (blå *). Det viste stel er en sammenfletning af fasekontrast og E512 nm fluorescensbilleder som i (A). E. Histogram afbildning af flow-cytometriske data, der sammenligner uinficerede THP-1-makrofager (rød) og celler inficeret med protozo primet vildtype L. pneumophila (grøn). Scale bar = 100 um. Klik her for at se større figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakteriel genekspression der kontrolleres nøje ved en kombination af livscyklus progression og reaktion på signaler i det omgivende mikromiljø. Vakuolære patogener, såsom L. pneumophila reagere på en mangfoldighed af værtscelle-afledte signaler, når ruminddelt i en phagosome. Som et samlet resultat af næringsstoffer konsumption i værtscellen, kompenserer bakterien ved at udtrykke faktorer er nødvendige for en vellykket spredning til en efterfølgende værtscelle 25. L. pneumophila indrettet til effektivt parasitize en lang række protozoer celler og derfor rummer en omfattende liste over effektor-proteiner til at drive denne proces. Disse effektor proteiner translokeres direkte i værtens cytoplasma under infektion af Dot / Icm typen IVb sekretion system 16. Effektorprotein, translokation er påkrævet, da mutationer, der resulterer i en mangelfuld transportør fuldstændigt ophæver intracellulær vækst i enhver værtscelle type. Curiously, individuelle deletioner især effektor-proteiner sjældent resulteret i intracellulær vækst dæmpning. Næsten 300 effektor proteiner, eller næsten 10% af proteinet koder genomet er blevet valideret som Dot / ICM substrater 14,15. Adskillige hypoteser er opstået for at forklare manglen på observerbare fænotyper for effektor deletioner, herunder tilstedeværelsen af paralogous kopier eller den horisontale erhvervelse af ortologe enzymer som følge af det brede værtsområde af L. pneumophila.
Fordi L. pneumophila får en patogen fordel, når for-dyrkes i protozo-celler (figur 1A-B), har vi ræsonnerede, at in vitro dyrkede bakterier ikke ville vise den samme genekspression nu tydelig i bakterier forlader protozo vært. Derfor kan ekspression af specifikke effektor-proteiner kun induceres i forbindelse med intracellulær vækst i protozoiske celler. Hvis en bestemt effektor ikke blev induceret for eXPRESSION under in vitro dyrkning, som bidraget fra det slettede effektor derfor ikke kunne vurderes i en traditionel infektion scenario. Fænotyper for virulensfaktorer vigtige for etableringen af infektion eller formidling kun ville blive opdaget i langvarige infektioner, der er tilladt for celle til celle spredning. Vi har derfor søgt at udvikle et assay, der kan måle bidrag af potentielle virulensfaktorer i forbindelse med en sekventiel infektion. I tilfælde af naturlige L. pneumophila erhvervelse, er det sandsynligt, at en human vært vil støde en bakterie, der var blevet primet til infektion i en protozo celle, hvor protozoer kan være mere resistente over for traditionelle kommunale vandbehandlingsanlæg praksis 10.
For at optimere den delvise oprensning af tilstrækkelige mængder af primede bakterier, vi først etableret et visuelt medgørlig stamme af L. pneumophila hjælp af IPTG-inducerbare GFP usynge plasmid bårne kopier af GFP locus. Vi har også genereret en enkelt kopi kromosomale indsættelse af IPTG inducerbar GFP om vildtype-genom. Selv om begge stammer fluorescerer in vitro og under infektion, jo højere kopiantallet af plasmid-bårne GFP produceret tilstrækkeligt signal til efterfølgende anvendelser i assayet. Vi konstateret, at anvendelse af næringsvæske dyrkede L. pneumophila ved en MOI = 20 var tilstrækkeligt til stærkt inficere A. castellanii monolag. Atten timers inkubation blev bestemt som optimal for at visualisere store fluorescerende vakuoler uden at nå en fase af værtscelle lysis (figur 1A). Protozoiske monolag ikke overholdes cellekultur plast, og er derfor nemt forstyrres med vasketrin. 12-brønds cellekultur-plader producerede de mest stabile monolag sammenlignet med andre skibe (6 eller 24 brønde, 10 cm skål). Fordi L. pneumophila kan ikke vokse i infektionen medium anvendes i the priming skridt, vi valgte at opgive enhver vasketrin for at fjerne ekstracellulære bakterier. Dette forbedrer udbyttet af inficerede amøbe i monolaget. Gentamycin er også ofte brugt til at dræbe ekstracellulære bakterier. Vi fandt protozo toksiske virkninger ved koncentrationer over 25 ug / ml, og fandt ingen forskelle i antallet af bakterier udvundet fra priming fase infektion ved 18 timer. Lyse af protozo cellemonolaget blev udført med iskold ultrafiltreret H2O, et opløsningsmiddel, der osmotisk bringer værtscellen uden at skade L. pneumophila. Hvis tilpasset til anvendelse med patogener, der ikke er stabile i H2O, 0,1% Triton X-100 i PBS, kan anvendes til at lysere den amøber med lignende resultater.
For direkte at sammenligne stamme til stamme forskelle i de efterfølgende målcelle-infektioner, blev en ligning genereret at korrelere optisk densitet på bakterier ved 600 nm med fluorescens-emission af GFP ved 512 nm (Figure 1 *). Vi valgte at anvende fluorescensemission som et middel til kvantitativ bestemmelse på grund af den store bidrag værtscelle rester i OD 600 målinger fra eukaryote cellelysater. Denne høje baggrund kontrast til ubetydelige værdier observeret for emission på 512 nm fra de samme lysater. Værdier af OD600 = 1,0 = 1x10 9 CFU / ml blev forudbestemt for L. pneumophila, hvilket muliggør beregning af bakteriel koncentration over et bredt område af fluorescensværdier. Mange organismer har etableret CFU henblik OD600 = 1,0, hvilket vil give mulighed for at anvende denne teknik til andre patogen ved generering af en korrelationskurve baseret på fluorescensemission. Vi valgte at undgå en bakteriel oprensningstrin under lysis af protozo celler for at 1) maksimere udbyttet af primede bakterier rådighed for målcellen infektion og 2) minimere tiden mellem høsten og efterfølgende infektion at bevare global genekspression patterns.
In vitro dyrkede vildtype L. pneumophila blev induceret til at udtrykke GFP i 18 timer med 1 mM IPTG. Seriefortyndinger af denne kultur blev anvendt til de spektrofotometriske målinger. Ved hjælp af afledte ligning blev målcelletyper infektioner rutinemæssigt udføres på variabel Mois med ensartet output. En MOI på 10 produceret omkring 1/2 af antallet af totale inficerede celler sammenlignet med infektioner, der modtog en MOI på 20 (figurerne 1A-B). Vi har testet tre mål celleværter med denne assay; A. castellanii, murine J774 makrofager og humane PMA-differentierede THP-1-makrofager. I hvert tilfælde var det resulterende infektion aldrig så robuste som den priming infektion på samme MOI (fig. 1C-D). Vi fastslået, at et yderligere vasketrin i målcellen fase infektion, som udføres både synkronisere målcellen infektion og reducerer ekstracellulære bakterier, er hhvonsible for denne observation. Ikke desto mindre er det afgørende, at eksperimentet internt styres med en vildtypestamme for både grunding og målcelle stage infektioner. Bakterielle mængder inddrevet i pennen er temmelig begrænsende for efterfølgende infektioner, derfor kun et enkelt mål celletype bør anvendes per eksperiment.
Kvantificering af målcellen infektion blev opnået ved anvendelse af tre metoder i dette assay. Fluorescensmikroskopi blev anvendt med en 20X objektiv. Billeder af vakuoler huser L. pneumophila blev manuelt optalt fra flere felter for hver testet stamme. Flowcytometrisk analyse gav et følsomt mål for forskelle i de samlede celler inficeret, såvel som en tilnærmelse af vakuolær belastning; hvor en højere fluorescenssignal var korreleret med bidrag fra GFP-signal fra et stigende antal L. pneumophila celler. Seriel fortyndingsudstrygning fastsat kvantitative værdier for total antalaf CFU s per volumen i celleprøverne indsamlet til flowcytometri. Kollektivt, disse metoder giver mulighed for fuldt medgørlig og kvantificerbare resultater i en sekventiel infektion scenario.
The priming assay er meget alsidig og egner sig til tilpasning til eventuelle bakterielle patogen, der anvender ferskvand protozoer som et miljømæssigt mellemprodukt 29,3. Valget af målcelle kan afholdes til at passe den naturlige infektion rute for den pågældende patogen. Vigtigt er det, kan en sekventiel infektionsmodel anvendes til at undersøge mutantstammer, der ikke fremviser en vækst-fænotype i en traditionel infektionsmodel anvendelse af in vitro dyrkede bakterier. Transkriptionel profilering in vitro dyrkede bakterier for formodede virulensfaktorer kan afsløre vigtige forskelle i profilen af udtryk i den inficerede mellemvært. Dette kunne åbne en ny linje af undersøgelse for funktionen af ukarakteriserede proteiner og deres bidrag til naturligsmitteveje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Craig Roy og Dr. Dario Zamboni for at tilvejebringe en skabelon for protozo celle infektioner. Vi takker Dr. Jagdeep Obhrai, Dr. Georgiana Purdy, Dr. Fred Heffron og Todd Wisner for udstyr og reagenser, Dr. Lulu Cambronne for kritisk gennemgang af manuskriptet. Flowcytometri blev udført på OHSU Flowcytometri delt ressource facilitet. Dette arbejde blev støttet delvist af en bevilling fra Medical Research Foundation of Oregon og en NIH tilskud R21 AI088275 (EDC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | antibiotic |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| ACES | Sigma | A9758-1KG | media component |
| ATCC medium: 712 PYG | ATCC | growth media for protozoans | |
| 1X PBS | Fisher Scientific | SH30256FS | phosphate buffered saline |
| activated charcoal | Fisher Scientific | C272-212 | media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | media component |
| peptone | BD Diagnostics | 211677 | media component |
| agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | media component |
| L-cysteine, 99%+ | Acros organics | 173601000 | media supplement |
| Ferric nitrate nonahydrate | Fisher Scientific | I110-100 | media supplement |
| Equipment | |||
| EVOS fl | AMG | EVOS fl | fluorescence microscope |
| Smart Spec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | spectrophotometer |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 22627023 | bench top centrifuge |
| Repeater plus | Eppendorf | 22230201 | repeating pipette |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | microplate reader | |
| Softmax Pro 5.3 | Molecular Devices | 0200-310 | microplate reader software |
| 5424 microfuge | Eppendorf | 22620401 | table top microcentrifuge |
| Fast-release pipette pump II | Scienceware | 379111010 | pipette aid |
| FACS Calibur | BD Bioscience | flow cytometer | |
| FlowJo 7.6.1 | FlowJo | license | flow cytometery software |
| 15 ml tube | BD Falcon | 352096 | polypropylene conical tube |
| 1.6 ml microfuge tube | Neptune | 3745.X | microcentrifuge tubes |
References
- Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues. Science. 259, 686-688 (1993).
- Mahan, M. J., et al. Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).
- Rankin, S., Isberg, R. R. Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment. Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).
- Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth. Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).
- Fields, B. S. The molecular ecology of legionellae. Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).
- Cirillo, J. D., et al. Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion. Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).
- Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages. Front Microbiol. 2, 60 (2011).
- Kilvington, S., Price, J. Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure. J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).
- King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination. Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).
- Horwitz, M. A. Formation of a novel phagosome by the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).
- Horwitz, M. A. Phagocytosis of the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil. Cell. 36, 27-33 (1984).
- Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes. J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).
- Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638 Forthcoming.
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Front Microbiol. 2, 136 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Shin, S., Roy, C. R. Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila. Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).
- Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
- Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).
- Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
- Segal, G., Shuman, H. A. Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila. Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Haghjoo, E., Galan, J. E. Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi. Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).
- Molofsky, A. B., Swanson, M. S. Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle. Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).
- Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).
- Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation. Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).
- Neild, A. L., Roy, C. R. Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation. Immunity. 18, 813-823 (2003).
- Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
- Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA. Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).
