Summary
Diese Technik stellt ein Verfahren zu ernten, normalisieren und zu quantifizieren intrazellulären Wachstum bakterieller Pathogene, die in natürlichen Protozoon-Wirtszellen vorkultiviert vor Infektionen von Säugerzellen. Dieses Verfahren kann modifiziert werden, um eine große Vielzahl von Wirtszellen für das Priming Bühne sowie Zielzelltypen unterzubringen.
Abstract
Viele intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger verwenden Süßwasser Protozoen als natürliches Reservoir für die Proliferation in der Umwelt. Legionella pneumophila, der Erreger der Legionärskrankheit Lungenentzündung, gewinnt eine pathogene Vorteil gegenüber in vitro kultivierten Bakterien beim ersten von Protozoen Zellen geerntet vor der Infektion von Säugetieren Makrophagen. Dies deutet darauf hin, dass wichtige Virulenzfaktoren möglicherweise nicht richtig in vitro exprimiert werden. Wir haben eine tractable System zur Grundierung L. entwickelt pneumophila durch seine natürliche Protozoen Host Acanthamoeba castellanii vor Säugetierzellen Infektion. Der Beitrag eines Virulenzfaktor durch Vergleichen intrazellulären Wachstum eines Mutantenstammes zu Wildtyp-Bakterien nach Protozoen Priming untersucht werden. GFP-exprimierenden Wildtyp und Mutante L. pneumophila-Stämme verwendet werden, um Protozoen Monoschichten in einem Priming-Schritt infizieren und dürfen späten Stadien der intrazellulären Wachstum zu erreichen. Fluoreszierende Bakterien werden dann aus diesen infizierten Zellen geerntet und normiert durch Spektrophotometrie um vergleichbare Anzahl von Bakterien für eine nachfolgende Infektion in Säugern Makrophagen erzeugen. Zur Quantifizierung werden lebenden Bakterien nach der Infektion überwacht mittels Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie, durch Kolonie und Plattieren. Diese Technik hebt und stützt sich auf den Beitrag der Wirtszelle-abhängige Genexpression durch Nachahmung der Umgebung, die in einem natürlichen Erwerb Weg begegnet wäre. Dieser Ansatz kann modifiziert werden, um jegliche Bakterium, das einen Vermittler Host verwendet als Mittel zur Gewinnung eines pathogenen Vorteil unterzubringen.
Introduction
Zahlreiche bakterielle Krankheitserreger allgemeine Strategien zur Wirtszellen für das Überleben und Replikation in einem intrazellulären Kompartiment nutzen angepasst. In vielen Fällen sind pathogenen Mechanismen ähnlich zwischen Protozoen und Metazoen Zellen. Jedoch sind diese beiden Mikroumgebungen sehr verschieden sein und in unterschiedliche Expression von Virulenzfaktoren 1-4 führen. Die Legionärskrankheit Bakterium Legionella pneumophila ist ubiquitär mit Süßwasser-Umgebungen weltweit 5 verbunden. Wichtig ist, dass L. pneumophila in Protozoen Zellen vor der Infektion von menschlichen Monozyten gewinnen eine pathogene Vorteil kultiviert, was darauf hindeutet, dass globale Genexpressionsprofile des Bakteriums Verlassen eines Protozoen-Zelle unterschiedlich sind als die der in vitro kultivierten Organismus 6-8. In der Natur, bieten Süßwasser Amöben nährstoffreichen Grenzen für eine schnelle Verstärkung eines eindringenden Bakteriums. Menschliche Akquisition von L. pneumophila wird häufig die Inhalation von kontaminiertem Wasser Tröpfchen, die das Bakterium enthalten, zurückzuführen. Es ist wahrscheinlich, dass diese Tröpfchen Hafen Protozoen Zell-assoziierten Bakterien, wo Protozoen Zellen sind resistent gegen herkömmliche Wasseraufbereitung Praktiken 9,10. Infektion der Lunge Alveolarmakrophagen verläuft in einer Weise nahezu identisch mit dem intrazellulären Lebenszyklus des Bakteriums in Protozoon-Wirtszellen 11-13.
Um zu überleben und zu replizieren in eukaryotischen Zellen, L. pneumophila verwendet eine spezielle Art IVb Sekretionssystem bezeichnet Dot / Icm auf fast 300 "Effektor"-Proteine in das Zytosol der Wirtszelle 14-16 liefern. Diese Effektorproteine kollektiv funktionieren, um zelluläre Prozesse zu unterlaufen, um eine Replikation permissiv Abteil für das Bakterium 17,18 erzeugen. Deletionen in einem der 26 Gene, die die Dot / Icm Transporters defekt Ergebnis in Stämmen für intrazelluläre mult umfasseniplication 19-23. Historisch Löschen einzelner Effektor-Gene kodieren selten führte Stämme gedämpft für die intrazelluläre Wachstum. Dieses Phänomen hat mehrere Hypothesen, einschließlich redundanter Funktion und paraloge Kopien von Effektoren zugeschrieben.
Einige Virulenzfaktoren sind nur im Rahmen der Wirtszell-assoziierter intrazelluläre Wachstum 24 exprimiert. Wir nahmen an, dass, wenn eine bestimmte Effektorzellen wurde nur im Kontext von Protozoen-Infektion exprimiert wird, dann der Beitrag des Effektors nicht durch einen Wildtypstamm, wenn sowohl in vitro kultiviert wurden verglichen werden. L. pneumophila Übergänge von einem replikativen zu einer transmissiven Phase, wie sie der stationären Phase in der Kultur 25 eintritt. Die Phase Switching Phänotyp stellt die Nährstoffverarmung während der intrazellulären Wachstums gestoßen und wird durch die Montage von Flagellen für Motilität 26 veranschaulicht. Da L. pneumophila ist invasive und virulent, wenn sie von Protozoen Zellen geerntet, haben wir versucht, einen Test, dass mehr treu die pathogenen Zustand des Bakteriums vertreten, wenn es Host-Makrophagen begegnet entwickeln.
Zu diesem Zweck haben wir ein vielseitiges Protozoen Priming-Assay, die jeden geeigneten Wirt für sowohl den ersten (Priming Zelle) und zweiten (Zielzelle) Stufe Infektionen unterbringen kann. Die Infektion Prozess ist lenkbar durch Verwendung von Bakterien stabil exprimieren grün fluoreszierendes Protein (GFP). Die Infektion Modell für die Protozoen Acanthamoeba castellanii folgt eine Methode weit verbreitet im Bereich 27 verwendet. Für die Grundierung Schritt, L. pneumophila-Stämme werden in vitro bis zur stationären Phase in flüssigen Medien kultiviert, um als 'durchlässigen' Bakterien (1A) zu erzeugen. Bakterien nächsten zur Monolagen A. infizieren castellanii 18 Stunden zur Erzielung einer späten Stufe des intrazellulären Lebenszyklus. Große Vakuolenten Bakterien können zu diesem Zeitpunkt mittels Fluoreszenz-Mikroskopie (Abbildung 1A) visualisiert werden. Protozoischen Zellen werden dann lysiert und Bakterien aus dem Lysat gewonnen werden für die Emission bei 512 nm unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenlesegerät gemessen. Fluoreszenz wird mit optischen Dichte korreliert Multiplizität-of-Infektion (MOI) für die Infektion von Zielzellen (Abb. 1, * Korrelation Kurve) zu berechnen. Nach Invasion (T 0) und 18 Stunden nach der Invasion (T 18), werden die Zielzellen für Fluoreszenz quantifiziert darstellt intrazellulären Bakterien. Fluoreszenz kann durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie überwacht werden, und kann durch Keimzahlen Kolonie Plattieren gemessen werden. Die Grundierzusammensetzung Assay wird immer durch Infektionen mit Wildtyp L. begleitet pneumophila und ein Stamm einen Defekt im Dot / Icm Typ IV-Sekretionssystem (Δ dota) (Abbildung 1A). Dies wichtiger bietet interne Kontrollen für direkte Vergleiche zwischen Wildtyp-and keine isogenen Mutanten bei der Infektion verwendet. Die Einbeziehung des avirulenten Stamm Δ DOTA während des Priming Stufe einen Schwellenwert für die Beobachtung eines abgeschwächten Wachstums Phänotypen mit isogenen Mutantenstämmen, die in vitro kultiviert werden, zugeordnet ist.
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Protocol
Ein. Vorbereitung der Legionella pneumophila Kulturen für Priming Stufe Infektionen
- Verwandeln Sie alle L. pneumophila-Stämme in dem Assay mit dem Plasmid pAM239 verwendet, die für ein Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induzierbaren grün fluoreszierendes Protein (GFP) 28. Streak die Bakterienstämme auf Eisen und Cystein N-(2-Acetamido)-2-Aminoethansulfonsäure (ACES) ergänzt gepufferten Aktivkohle Hefeextrakt-Agar (CYEA) mit 6,25 g / ml Chloramphenicol (CM) (für Plasmid-Wartung) und inkubieren für 72 Stunden bei 37 ° C.
- Übertragen ein Inokulum des Bakterienstammes in ergänzt ACES gepufferten Hefeextrakt-Brühe (AYE) mit 6,25 pg / ml CM und 1 mM IPTG und kultivieren bis zur stationären Phase (O / N) auf einem Schüttler bei 37 ° C
- Bestätigen GFP-Expression in den in vitro-Kulturen unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie. Übertragen 10 ul der Kultur auf einen Objektträger unter einer AbdeckungRutsch-und Bild mit einem 60X-Objektiv mit GFP Anregung / Emission cube (AMG EVOS fl).
- Verdünnen Sie eine 100 ul-Aliquot jeder in-vitro-Kultur bis 1:10 mit sterilem H 2 O. Stellen Sie eine leere mit 100 ul AYE Medien mit 1 mM IPTG und 6,25 pg / ml cm und Wasser. Nehmen OD600 Messungen der Verdünnungen mit einem Spektralphotometer (Bio-Rad Smart-Spec Plus). Berechnen des Volumens erforderlich, eine gut bei einer MOI = 20 infizieren für jede in vitro-Kultur: V = [(Amöben seeded) x MOI] / [OD 600 x (Verdünnungsfaktor) x (konstant)] = [(1 x 10 6 ) x (20)] / [OD 600 x (10) x (1 x 10 6)] = 2/OD 600. Bakterienkonzentration als OD 600 = 1,0 ermittelt = 1 x 10 9 CFU / ml.
2. Priming Stufe Infektion mit Acanthamoeba castellanii
- Pflegen und pflegen die Amöben in ATCC 712 PYG Medium in 175 cm 2-Kolben bei RT.
- Ersetzen Medien in Amöben culturen 24 Stunden vor Beginn der bakteriellen flüssigen Kulturen. Am gleichen Tag flüssigen Bakterienkulturen gestartet werden, zu sammeln und zu zählen Zellen auf einem Lichtmikroskop unter Verwendung eines Hämozytometers.
- Verdünnt das Amöben mit frischem Medium auf eine Endkonzentration von 1 × 10 6 Zellen / ml. Seed 12-Well-Zellkultur-Platten mit 1 ml Aliquots der Amöben mit einem Repetierpipette und inkubieren bei RT O / N.
- Nach der Inkubation die Wells der 12-Well-Zellkultur-Platten 3x mit 1 ml steriler PBS mit einem 10 ml serologische Pipette und eine manuelle Pipette Hilfe.
- Nach dem Absaugen des PBS, 1ml der Infektion Medien (ATCC 712 PYG media minus Glukose, Pepton und Hefeextrakt) mit 1 mM IPTG und 6,25 pg / ml cm in jede Vertiefung. Die Inkubation bei RT für 1 Stunde.
- Infect Vertiefungen bei einer MOI = 20. Zentrifuge die Platte bei 400 xg für 5 min (Eppendorf 5810R) und schwimmen in einem 37 ° C Wasserbad für 5 min. Übertragen der Platte an einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator für 18 Stunden.
- Bestätigen Sie die Infektionen mit Live Cell Imaging auf einem Fluoreszenzmikroskop vor Zelllyse und Ernte von Bakterien beherbergen.
3. Seeding THP-1-Zellen für Target-Zell-Stadium Infektion
- (Beginn dieses Prozesses 24 Stunden vor dem Einrichten flüssigen Bakterienkulturen). Kultivieren THP-1-Zellen in einem 75 cm 2-Kulturflaschen nahe-Konfluenz in RPMI 1640-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS).
- Zählen der Zellen unter Verwendung einer Suspension Hämozytometer, verdünnt den THP-1-Zellen in RPMI 1640-Medium mit 10% FBS und 100 ng / ml Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) zu einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml und die Platte in 1 ml Aliquots auf 12-Well-Zellkultur-Platten. Die Inkubation erfolgt 48 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2.
4. Verarbeitung von Bakterien für Target-Zell-Stadium Infektion nach der Grundierung Bühne Infektion
- Saugen Sie das Medium aus dem grundiert Amöben.
- Lysieren die amoebae mit 500 ul eiskaltem, sterilen ultrafiltriertes (UF) H 2 O und Inkubation bei RT für 10 min.
- Pool Die Lysate nach Art belasten und nehmen eine E 512 nm Messung für jede der gepoolten Lysaten mit einem Fluoreszenz-Reader (Molecular Devices Spectramax Zwilling EM).
- Berechnen Sie einen OD 600-Messung für den gepoolten Lysaten: calcOD 600 = 0,0008 (E 512 - Lysat Hintergrund) + 0,0019. Die Formel wurde zuvor durch die grafische Darstellung einen direkten Vergleich sowohl der OD 600 und der E 512 nm Messungen von Verdünnungen von L. ermittelt pneumophila Wildtyp-GFP exprimieren von stationärer Phase in vitro-Kultur (1 *). Die Lysate der nichtinfizierten Amöben, unterliegen den gleichen experimentellen Bedingungen wie die infizierten Amöben, werden als Rohling verwendet und einen Korrekturwert (zB Lysat Hintergrund), die in die Gleichung eingearbeitet wurde. Das notwendige Volumen to infizieren auch bei einer MOI = 20 wird für jedes Lysat Pool berechnet: V = [(THP-1 seeded) x MOI] / [calcOD 600 x (konstant)] = [(1 X 10 6) x (20)] / [calcOD 600 x (1 x 10 6)] = 20/600 calcOD.
- Waschen Sie die THP-1-Zellen 3x mit PBS und 1 ml frisches RPMI 1640 (10% FBS) in jede Vertiefung. Inkubieren THP-1-Zellen für 1 Stunde bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Infizieren die THP-1 Zellen bei der Verwendung der berechneten MOI gepoolt Lysaten. Zulassen, dass ein Satz von Vertiefungen bleiben uninfizierten, dient als negative Kontrolle für die durchflusszytometrische Analyse. Verarbeitung der Grundierung Stufe sollte in weniger als 30 Minuten abgeschlossen werden. Die Lysate werden auf Eis gehalten, um Veränderungen in bakterielle Genexpression vor der Infektion zu begrenzen.
- Zentrifuge die Platte schweben um die Temperatur zu erhöhen, und inkubieren, wie in der Grundierung Bühne.
- Eine Stunde nach der Infektion, entfernen Sie die Medien durch Aspiration und waschen Brunnen 3x mit PBS auf extrazelluläre Bakterien zu entfernen.
- 1 ml fresh RPMI 1640 (10% FBS), in Vertiefungen und kehren die Platte in den Inkubator. Der Zeitpunkt unmittelbar nach Medienersatz dient als Zeitpunkt Null (T 0). Inkubieren der THP-1-Zellen für 14-16 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2.
5. Experimental Analysis
5.1 Live Cell Imaging
Bild die infizierten Brunnen mit einem Fluoreszenzmikroskop (AMG EVOS fl) bei 10X oder 20X Vergrößerung (1A-D). Die Bilder können entweder qualitativ oder quantitativ verglichen werden, um Niveaus einer Infektion sowohl in der Initialisierungszusammensetzung Stufe und Stufe Infektionen Zielzelle zu bestimmen.
5,2 Durchflusszytometrie
- Die Emissions-Peaks verschiedener Infektionen können durch Durchflusszytometrie (BD FACS Calibur) verglichen werden. Trypsinieren die infizierten THP-1-Zellen und vorsichtig waschen sie aus den Vertiefungen durch Mischen in PBS mit einer Pipette.
- Pool die Zellen von Stamm-Typ in 15 ml Falcon-Röhrchen und Pellet bei 1.800 xg für 2min in der Tischzentrifuge.
- Suspend die Pellets in 1 ml PBS und Transfer zum 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Suspension bei 1.800 x g (Eppendorf 5424) und wieder aussetzen Pellets in 1 ml PBS. Wenn die resultierenden Suspensionen stark trüb werden (OD 600 ≥ 1,0) sie müssen in zusätzlichen PBS (1:3) verdünnt werden, um ein Verstopfen der Leitungen in dem Durchflusszytometer verhindern.
- Verwenden sterilfiltriert PBS für die Äquilibrierung des Durchflusszytometers und Waschschritte zwischen Probeninjektionen. Zur Erstellung der Vorwärts / Seitenstreuung von nicht infizierten Targetzellen vor der Injektion von Zielzelle Infektion Proben.
- Sammle 20.000 insgesamt Veranstaltungen für jeden Zustand mit 488 nm Laser-Anregung und die FL1-Kanal.
- Tor nach der Aufnahme Zellpopulationen auszuschließen infizierten Zellen und Grundstück Fluoreszenzintensität in einem Histogramm (FlowJo) (Abbildung 1E).
5,3 CFU plating
- Untersuchen Sie die Effizienz of Infektion durch Plattieren CFU der Zellen für Durchflusszytometrie geerntet. Planen serielle Verdünnungen der Proben in ultrafiltriertes H 2 O bei 10 -1, 10 -2 und 10 -3.
- Platte 20 ul jeder Verdünnung auf 1/3 einer CYEA Platte mit 6,25 pg / ml CM.
- Die Inkubation erfolgt bei 37 ° C für 72 Stunden.
- Zählen Sie die Kolonien mit einem Zahnstocher und Zell-Zähler.
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Representative Results
Ein typisches Ergebnis für die gesamte Infektion ist in Abbildung 1 dargestellt. Live-cell Fluoreszenzaufnahmen Darstellung Monolagen A.castellanii mit Wildtyp L. infiziert pneumophila während des Priming Stufe wird in 1A gezeigt. Eine erfolgreiche Maßnahme des Priming-Schritt würde zu einer Bevölkerung von etwa 90% der Wirtszellen mit großen Vakuolen mit GFP markierten Bakterien an dieser MOI besiedelten führen. Bei 18 Stunden nach der Infektion, die meisten A. castellanii Zellen maximale bakterielle Belastungen erreicht noch Lyse der Bevölkerung ist minimal. Unter Lichtmikroskopie wird eine erfolgreiche Grundierung Infektion zu offenbaren gerundet und abgenommen Amöben. Gentamycin [25 ug / ml] kann zum Kulturmedium 30 min bis 1 Stunde nach der Infektion, den Beitrag der extrazellulären Bakterien eliminieren zugesetzt werden. Die Δ Dota Mutante, die nicht unterstützt Dot / Icm-vermittelte Translokation von Effektoren, sollte nicht in zu wachsenA. castellanii und obwohl die in vitro-Kultur sowie der Wildtypstamm fluoreszieren sollte, sollte minimale Fluoreszenz mit diesem Stamm bei 18 Stunden nach Infektion detektiert werden. Amöben erscheint flach und die Monoschicht sollte intakt sein.
Insgesamt Lysaten beherbergen L. pneumophila und Host Zelltrümmer werden sofort an spektrophotometrische Analyse unterzogen, um die Konzentration der Bakterien in der Probe zu berechnen. MOI lässt sich anhand der Korrelationskurve (Abbildung 1 *) werden. Zielzellen müssen für eine Infektion wie vorbereitet sein, dass grundiert Bakterien weniger als 30 min werden nach der Lyse die Integrität der Genexpressionsprofile zu bewahren. Einmal infiziert, sind Zielzellen für 14-18 Stunden inkubiert, bevor sie verarbeitet werden. Fluoreszenz Aufnahmen in Abbildung 1B zeigen die pathogene Vorteil Protozoen-grundiert Wildtyp L. erworbenen pneumophila in Zielzelle Bühne Infektionen A. castellanii wenn sie dem gleichen Stamm, der in vitro-Kultivierung vor der Infektion war begrenzt verglichen. Zielzelle Stufe Infektionen sind weniger robust als das Priming Phase wegen der Einbeziehung eines Waschschritts 1-2 h nach der Infektion (Zielzelle-abhängig). Diese Medien Ersatz Schritt entfernt non-invasive Bakterien, die Synchronisation der Infektion und reduziert Hintergrundfluoreszenz in nachfolgenden Anwendungen. 1C-D zeigen Fluoreszenz-Aufnahmen von einem typischen Wildtyp L. pneumophila zweistufigen Infektion Szenario, bei dem Bakterien zunächst durch Infektion von A. sind grundiert castellanii, aus lysierten Protozoen Zellen geerntet, quantifiziert mit der Korrelationskurve und zur THP-1 Makrophagen für 14 Stunden zu infizieren.
Nach Mikroskopie, werden die Zellen für die Durchflusszytometrie (BD FACS Calibur) trypsiniert. Nicht infizierten Zellen verwendet werden, um die Maschine für Vorwärts und Seitenstreuung kalibrieren. Infektionen mit jedem Stamm sind Prozess-ed mit 20.000 Ereignisse aufgezeichnet. FlowJo 7.6.1-Software wird verwendet, um die Rohdaten zu analysieren. Typischerweise wird die Fluoreszenz (488 nm Anregung) zuerst gegen Seitwärtsstreuung aufgetragen, um die Hintergrundfluoreszenz des infizierten Zellpopulation zu identifizieren. Grundstücke sind gated diese Bevölkerung und re-aufgetragen als Histogramm der Gesamtaktivität gegenüber Fluoreszenzintensität auszuschließen. Da jede Bakterienzelle stellt eine Einheit von Fluoreszenz, die Intensität des Signals liefert eine Darstellung der Belastung in jedem vakuoläre infizierten Zelle. Eine typische graphische Darstellung eines Wildtyp-Infektion wird in 1E gezeigt. Insgesamt ist die relative Anzahl der infizierten Zellen durch das Durchflusszytometer detektiert niedriger als erwartet bei einem Vergleich mit Daten Mikroskopie. Live Cell Durchflusszytometrie ist empfindlich genug, aber zu Belastungen Abweichungen zu erkennen.
Quantifizierung von Gesamt CFU die in den Proben wird durch Erzeugen von seriellen Verdünnungen der Zellen für Durchflusszytometrie und anschließendes Plattieren hergestellt durchgeführtauf CYEA Medien. Nach 72 h bei 37 ° C, einzelne Kolonien sollte offensichtlich sein, und Sparse genug zum Zählen.
Abbildung 1. Protozoan Grundierung und Ziel-Zell-Stadium Infektionen mit Legionella pneumophila. A. Wild-Typ oder Typ IV-Sekretion mangelhaft (Δ DotA) L. pneumophila-Stämme induziert wurden mit GFP durch Ausdruck in vitro Kultur (kleine Bilder) und verwendet, um A. zu infizieren castellanii Monoschichten für 18 h bei MOI = 20. Fluoreszenz-Aufnahmen von Infektionen mit jedem L. pneumophila Belastung dargestellt (große Bilder) als Zusammenführung von Phasenkontrast-und E 512 nm Fluoreszenz-Bildern mit einem 20x-Objektiv auf einem Fluoreszenzmikroskop (AMG EVOS fl). Grüne Halbmonde sind repräsentativ für intrazelluläre vacuolesharboring L. pneumophila. B. GFP-Fluoreszenz-Aufnahmen von 18 Stunden Zielzelle Bühne Infektion A. castellanii mit Wildtyp L. pneumophila aus der Protozoen Grundierung Bühne Infektion (oben) oder in vitro kultivierten (unten), wo die MOI = 10 für jede wurde berechnet unter Verwendung der Gleichung aus der Korrelation Kurve (blau *) abgeleitet. geerntet Die Kurve wurde unter Verwendung von seriellen Verdünnungen vom Wildtyp L. pneumophila GFP aus einer 18 h in vitro Kultur. C. Fluoreszenz-Aufnahme einer Grundierung Bühne Infektion A. castellanii mit Wildtyp L. pneumophila wie in (A). D. Fluoreszenz-Aufnahme einer 14 hr Zielzelle Stufe Infektion von PMA differenziert THP-1 Makrophagen mit Wildtyp L. pneumophila der Protozoen-Infektion in Priming Stufe (C) geerntet. Die MOI = 20 wurde unter Verwendung der Gleichung aus dem entsprechenden abgeleitetenBezug Kurve (blau *). Der Rahmen dargestellt ist eine Zusammenführung der Phasenkontrast und E512 nm Fluoreszenz-Bildern wie in (A). E. Histogramm Plot durchflusszytometrischen Daten verglichen infizierten THP-1 Makrophagen (rot) und Zellen mit Protozoen grundiert Wildtyp L. infiziert pneumophila (grün). Maßstab = 100 um. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.
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Discussion
Bakterielle Genexpression dicht durch eine Kombination von Lebenszyklus Progression und ansprechend auf Signale in der umgebenden Mikroumgebung gesteuert. Vacuolar Krankheitserreger wie L. pneumophila zu einer Vielzahl von Host-Zellen abgeleiteten Signale reagiert, wenn in einem Phagosom kompartimentiert. Als Ergebnis der kollektiven Erschöpfung Nährstoff in der Wirtszelle, kompensiert das Bakterium durch Expression für erfolgreiche Verbreitung erforderlich zu einer nachfolgenden 25 Wirtszelle. L. pneumophila angepasst effizient parasitieren eine Vielzahl von Protozoen-Zellen und somit birgt einen umfangreichen Katalog von Effektorproteine, um diesen Prozess zu treiben. Diese Effektor-Proteine direkt in die Host Cytoplasma während der Infektion transloziert durch die Dot / Icm Typ IVb Sekretionssystem 16. Effektorprotein Translokation erforderlich ist, wie Mutationen, die zu einer defekten Transporters vollständig aufzuheben intrazelluläre Wachstum in jeder Wirtszelle Typ. Kuriositätusly einzelne Löschungen insbesondere Effektorproteinen selten führte das intrazelluläre Wachstum Dämpfung. Fast 300 Effektor-Proteine, oder fast 10% der Protein-codierenden Genom wurden als Dot / Icm Substrate 14,15 validiert. Mehrere Hypothesen sind entstanden, um den Mangel an beobachtbaren Phänotyp für Effektormoleküle Deletionen, einschließlich der Anwesenheit von paraloge Kopien oder der horizontalen Erwerb orthologen Enzyme, die aus der breiten Wirtsbereich von L. erklären pneumophila.
Da L. pneumophila gewinnt eine pathogene Vorteil, wenn vorkultiviert in Protozoen Zellen (1A-B), begründeten wir, dass in vitro kultivierten Bakterien würden nicht die gleiche Genexpressionsprofil offensichtlich in Bakterien Verlassen des Protozoen Host. Daher könnte Expression bestimmter Effektorproteine nur im Kontext von intrazellulären Protozoen Wachstum in Zellen induziert werden. Wenn eine bestimmte Effektorzellen wurde nicht für e induziertexpression während der in vitro Kultur, als der Beitrag des gelöschten Effektor konnte nicht wirksam in einem traditionellen Infektion Szenario ausgewertet werden. Phänotypen Virulenzfaktoren wichtig für die Etablierung der Infektion oder Verbreitung würde nur in längeren Infektionen, zur Ausbreitung von Zelle zu Zelle erlaubt detektiert werden. Wir haben daher versucht, einen Assay, der den Beitrag potenzieller Virulenzfaktoren im Rahmen eines sequentiellen Infektion messen entwickeln könnte. Im Fall von natürlichem L. pneumophila Akquisition ist es wahrscheinlich, dass ein menschlicher Wirt würde ein Bakterium, das für die Infektion in einer Protozoen-Zelle hatte grundiert stoßen, wo Protozoen kann mehr resistent gegen herkömmliche kommunale Wasseraufbereitung Praktiken 10.
Um die partielle Reinigung von ausreichenden Mengen von grundierten Bakterien zu optimieren, haben wir zunächst festgestellt eine visuell tractable Stamm von L. pneumophila mit IPTG induzierbar gfp usingen Plasmid borne Kopien des gfp Locus. Wir haben auch eine einzige Kopie erzeugt chromosomale Insertion von IPTG induzierbaren gfp auf dem Wildtyp-Genom. Obwohl beide Stämme in vitro und während der Infektion fluoreszieren, produziert der höhere Kopienzahl des plasmidgetragenen gfp ausreichendes Signal für Downstream-Anwendungen im Assay. Wir haben festgestellt, dass die Verwendung von Bouillon kultivierten L. pneumophila bei einer MOI = 20 war ausreichend, um stark zu infizieren A. castellanii Monoschichten. Achtzehn Stunden Inkubation wurde als optimal große fluoreszierende Vakuolen, ohne zu einem Stadium der Wirtszelle Lyse (Abbildung 1A) visualisieren bestimmt. Protozoischen Monoschichten sind nicht auf Zellkultur Kunststoffen haftet, und werden daher leicht mit Waschschritten gestört. 12-Well-Zellkultur-Platten produzierte die meisten stabile Monoschichten, wenn sie mit anderen Schiffen (6 oder 24-Loch, 10 cm Schale) verglichen. Da L. pneumophila kann nicht im Infektionsmedium in th verwendet wachsene Priming-Schritt, wählten wir einen Waschschritt an extrazelluläre Bakterien zu entfernen aufzugeben. Dies verbessert die Ausbeute an infizierten Amöben in der Monoschicht. Gentamycin wird auch oft verwendet, um extrazelluläre Bakterien abzutöten. Wir fanden Protozoen toxischen Wirkungen bei Konzentrationen über 25 pg / ml, und fand keine Unterschiede in der Gesamtzahl der Bakterien aus dem Priming Stufe Infektion bei 18 h gewonnen. Lyse des Protozoen Zellmonoschicht wurde mit eiskaltem ultrafiltriertes H 2 O, ein Lösungsmittel, das osmotisch kompromittiert die Wirtszelle ohne Schädigung L. durchgeführt pneumophila. Wenn für die Verwendung mit Erregern, die nicht in H 2 O stabil ausgelegt, 0,1% Triton X-100 in PBS kann die Amöben mit ähnlichen Ergebnissen zu lysieren werden.
Um direkt vergleichen Stamm von Unterschieden in nachfolgenden Zielzelle Infektionen Stamm wurde eine Gleichung erzeugt wird, um die optische Dichte der Bakterien bei 600 nm korreliert mit Fluoreszenzemission bei 512 nm GFP (Figure 1 *). Wir entschieden uns, Fluoreszenzemission als Mittel zur Quantifizierung aufgrund der großen Beitrag der Wirtszelle Schutt in OD 600-Messungen aus eukaryontischen Zelllysaten verwenden. Diese hohe Hintergrund mit vernachlässigbare Werte für die Emission bei 512 nm aus den gleichen Lysaten beobachtet gegenübergestellt. Werte von OD 600 = 1,0 = 1x10 9 KBE / ml wurden für L. vorgegebenen pneumophila, so dass für die Berechnung der Konzentration der Bakterien über einen weiten Bereich von Fluoreszenzwerte. Viele Organismen haben CFU Werte für OD 600 = 1,0 festgelegt, die für die Anwendung dieser Technik auf jeder anderen Pathogens durch Erzeugung einer Korrelationskurve auf Fluoreszenzemission Basis ermöglichen würde. Wir entschieden uns, eine bakterielle Reinigungsschritt während der Lyse der Zellen zu vermeiden Protozoen, um 1) die Ausbeute zu maximieren von grundierten Bakterien verfügbar für die Zielzelle Infektion und 2) minimiert die Zeit zwischen Ernte und nachfolgende Infektion auf globale Genexpression p bewahrenatterns.
In vitro kultivierten Wildtyp L. pneumophila induziert wurde mit GFP für 18 Stunden mit 1 mM IPTG auszudrücken. Reihenverdünnungen von dieser Kultur wurden für die spektrophotometrische Messungen verwendet. Mit der abgeleiteten Gleichung, wurden Zielzelle Infektionen routinemäßig variable Innenministeriums mit konsistenten Ausgabe durchgeführt. Einer MOI von 10 hergestellten etwa 1/2 der Gesamtzahl der infizierten Zellen bei Infektionen, die eine MOI von 20 (Fig. 1A-B) übermittelt verglichen. Wir haben drei Zielzelle Hosts mit diesem Assay getestet; A. castellanii, murine J774 Makrophagen und menschlichen PMA-differenzierte THP-1 Makrophagen. In jedem Fall war das resultierende Infektion nie so robust wie die Priming-Infektion gleichzeitig MOI (1C-D). Wir haben festgestellt, dass ein zusätzlicher Waschschritt während der Ziel-Zell-Stadium Infektion, die durchgeführt werden, um sowohl synchronisiert die Zielzelle Infektion und verringern extrazellulären Bakterien, bzw. istonsible für diese Beobachtung. Dennoch ist es wichtig, dass das Experiment innen mit einem Wildtypstamm sowohl für das Priming-und Ziel-Zellen-Stadium Infektionen gesteuert. Bakterielle Mengen in der Priming-Schritt zurückgewonnen wird nicht limitierend für nachfolgende Infektionen, daher nur ein einziges Ziel Zelltyp sollte pro Experiment verwendet werden.
Quantifizierung der Zielzelle Infektion erfolgte mit drei Methoden in diesem Assay. Fluoreszenzmikroskopie wurde mit einem 20x-Objektiv verwendet. Bilder von Vakuolen beherbergen L. pneumophila wurden manuell aus mehreren Feldern für jeden Stamm getestet gezählt. Durchflusszytometrieanalyse bereitgestellt ein empfindliches Maß für Unterschiede im gesamten Zellen infiziert, sowie eine Näherung vakuoläre Last; wo eine höhere Fluoreszenzsignal wurde mit dem Beitrag von GFP-Signal von immer mehr korreliert L. pneumophila Zellen. Serielle Verdünnungsausstrichverfahren vorgesehenen quantitativen Werte für die Gesamtzahlder CFU pro Volumen in den Zellproben für die Durchflusszytometrie gesammelt. Zusammen ermöglichen diese Methoden für voll gefügig und quantifizierbare Ergebnisse in einer sequentiellen Infektion Szenario.
Die Grundierung Assay ist sehr vielseitig und wird für die Anpassung an jede bakterielle Erreger, die Süß-Protozoen verwendet als Umwelt Zwischen 29,3 geeignet. Die Wahl der Zielzelle kann gesorgt werden, um die natürliche Infektionsweg für den jeweiligen Erreger passen. Wichtig ist, dass eine sequentielle Infektionsmodell zur Mutantenstämmen, die nicht mit einer Wachstumsrate Phänotyp in einer traditionellen Infektionsmodell Verwendung von in vitro kultivierten Bakterien hat präsentieren untersuchen. Transcriptional Profilierung in vitro kultivierten Bakterien für mutmaßliche Virulenzfaktoren konnte zeigen wesentliche Unterschiede im Profil der Ausdruck in der infizierten Zwischenwirt. Dies könnte eine neue Reihe von Untersuchungen für die Funktion des charakterisierten Proteinen und ihren Beitrag zu öffnen natürlichenInfektionswege.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Craig Roy und Dr. Dario Zamboni für die Bereitstellung einer Vorlage für Protozoen Zelle Infektionen. Wir danken Dr. Jagdeep Obhrai, Dr. Georgiana Purdy, Dr. Fred Heffron und Todd Wisner für Geräte und Reagenzien; Dr. Lulu Cambronne für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Durchflusszytometrie wurde am OHSU Durchflusszytometrie Shared Resource Facility durchgeführt. Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen Zuschuss aus dem Medical Research Foundation of Oregon und einer NIH R21 AI088275 (EDC) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | antibiotic |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| ACES | Sigma | A9758-1KG | media component |
| ATCC medium: 712 PYG | ATCC | growth media for protozoans | |
| 1X PBS | Fisher Scientific | SH30256FS | phosphate buffered saline |
| activated charcoal | Fisher Scientific | C272-212 | media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | media component |
| peptone | BD Diagnostics | 211677 | media component |
| agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | media component |
| L-cysteine, 99%+ | Acros organics | 173601000 | media supplement |
| Ferric nitrate nonahydrate | Fisher Scientific | I110-100 | media supplement |
| Equipment | |||
| EVOS fl | AMG | EVOS fl | fluorescence microscope |
| Smart Spec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | spectrophotometer |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 22627023 | bench top centrifuge |
| Repeater plus | Eppendorf | 22230201 | repeating pipette |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | microplate reader | |
| Softmax Pro 5.3 | Molecular Devices | 0200-310 | microplate reader software |
| 5424 microfuge | Eppendorf | 22620401 | table top microcentrifuge |
| Fast-release pipette pump II | Scienceware | 379111010 | pipette aid |
| FACS Calibur | BD Bioscience | flow cytometer | |
| FlowJo 7.6.1 | FlowJo | license | flow cytometery software |
| 15 ml tube | BD Falcon | 352096 | polypropylene conical tube |
| 1.6 ml microfuge tube | Neptune | 3745.X | microcentrifuge tubes |
References
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