Summary
טכניקה זו מספקת שיטה לקצור, לנרמל ולכמת צמיחה תאית של חיידקים פתוגנים כי הם מראש מעובדים בתאי פונדקאי protozoan טבעיים לפני הזיהומים של תאי יונקים. שיטה זו יכולה להיות שונה כדי להתאים מגוון רחב של תאי מארח לבמה יחול כמו גם סוגי תאי היעד.
Abstract
חיידקים פתוגנים תאי רבה משתמשים הפרוטוזואנים מים מתוקים כמאגר טבעי לשגשוג בסביבה. הלגיונלה pneumophila, הגורם לכך מדלקת הריאות הליגיונרים, זוכה ליתרון על פני בחיידקים פתוגניים בתרבית מבחנה כאשר נקטפו ראשון מתאי protozoan לפני הזיהום של מקרופאגים יונקים. הדבר מרמז כי גורמים ארסיים חשובים לא יכולים לבוא לידי הביטוי כראוי במבחנה. פתחנו מערכת צייתנית ליחולו L. pneumophila דרך מארח protozoan הטבעי Acanthamoeba castellanii לפני הזיהום של תאי יונקים. תרומתו של כל גורם ארסיות ניתן לבדוק על ידי השוואת צמיחה תאית של זן מוטציה לחיידקי סוג פראי לאחר שהכין מראש protozoan. GFP-להביע פראי סוג והמוטציה L. זני pneumophila משמשים להדביק monolayers protozoan בשלב אתחול ואפשרו להגיע לשלבים מאוחרים של גידול תאי. חיידקי פלורסנט אז נקצרים מן התאים הנגועים האלה ונירמול של ספקטרופוטומטריה לייצר מספרים דומים של חיידקים לזיהום לאחר למקרופאגים יונקים. לכימות, חיידקי חיים מנוטרים לאחר הדבקה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, cytometry זרימה, ועל ידי ציפוי מושבה. טכניקה זו מדגישה ומסתמכת על התרומה של ביטוי גני התא תלוי מארח על ידי חיקוי הסביבה שהיה נתקלה במסלול רכישה טבעית. גישה זו יכולה להיות שונה כדי להתאים לכל חיידק שמשתמש מארח מתווך כאמצעי להשגת יתרון פתוגניים.
Introduction
חיידקים פתוגנים רבה יש להתאים את האסטרטגיות כלליות לניצול תאי מארח להישרדות ושכפולה בתא תאי. במקרים רבים, מנגנונים פתוגניים דומים בין תאים מטזואניים protozoan ו. עם זאת, שני microenvironments האלה שונים מאוד ויכול לגרום לביטוי הפרש של 1-4 גורמים ארסיים. המחלה הליגיונרים חיידק הלגיונלה pneumophila קשור ubiquitously עם סביבות מים מתוקים 5 ברחבי העולם. חשוב לציין, L. pneumophila טפח בתאי protozoan לפני הזיהום של מונוציטים אדם להשיג יתרון פתוגניים, מה שמרמז כי פרופילי ביטוי גנים הגלובליים של חיידק יציאת תא protozoan הם שונים מזה של במבחנה טפחה האורגניזם 6-8. בטבע, אמבות מים מתוקים לספק גבולות עשירים ברכיבים מזינים להגברה מהירה של חיידק פולש. רכישה אנושית ל ' pneumophמנהל מקרקעי ישראל הוא לרוב מיוחס לשאיפה של טיפי מים מזוהמים המכילות את החיידק. סביר להניח כי חיידקים אלו טיפי נמל protozoan תאים נלווים; בו תאי protozoan הם עמידים יותר לשיטות טיפול במים קונבנציונליים 9,10. זיהום של תמורת מקרופגים מכתשיים ריאה באופן כמעט זהה למחזור החיים התאי של החיידק בתאי פונדקאי protozoan 11-13.
כדי לשרוד ולהתרבות בתאים האיקריוטים, L. pneumophila משתמש במערכת מיוחדת סוג IVB הפרשה נקראת דוט / ICM כדי לספק כמעט 300 חלבונים 'מפעיל' לcytosol של התא המארח 14-16. חלבונים אלה מפעיל קולקטיבי לתפקד לחתור תחת תהליכים תאיים על מנת ליצור תא מתירנית שכפול לחיידק 17,18. מחיקות בכל של 26 גנים המרכיבים את תוצאת טרנספורטר דוט / ICM בזנים פגומים לmult התאיiplication 19-23. מבחינה הסטורית, מחיקה של גני קידוד מפעיל בודדים כמעט והביאה לזנים מוחלשים לצמיחה תאית. תופעה זו יוחסה לכמה היפותזות כוללים פונקציה מיותרת ועותקים של paralogous effectors.
החלק מהגורמים ארסיים באים לידי ביטוי רק בהקשר של צמיחת מארח תא הקשורים תאית 24. אנו רציונליזציה שאם מפעיל מסוים בא לידי ביטוי רק בהקשר של זיהום protozoan, אז התרומה של המפעיל, אינו יכולה להשתוות עם זן פראי סוג כאשר הן היו בתרבית במבחנה. L. pneumophila מעברים מreplicative לשלב מעביר כפי שהוא נכנס שלב נייח בתרבות 25. פנוטיפ מיתוג השלב מייצג את הדלדול התזונתי נתקל במהלך צמיחה תאית ומודגם באמצעות הרכבה של וטונים לתנועתיות 26. בגלל L. pneumophila הוא inva יותרsive וארסי כשנקצר מתאי protozoan, אנחנו בקשנו לפתח assay שייצג את המדינה הפתוגני של החיידק נאמן יותר כאשר הוא נתקל מקרופאגים המארחים.
לצורך כך, פתח assay יחול protozoan תכליתי שיכול להכיל את כל מארח מתאים לשני (תא המטרה) זיהומי השלב הראשונים (תא יחול) ושניים. תהליך ההדבקה הוא צייתן באמצעות שימוש בחיידקים ביציבות להביע חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). המודל לזיהום protozoan Acanthamoeba castellanii כדלקמן המתודולוגיה בשימוש נרחב בתחום 27. לצעד הנפץ, L. זני pneumophila מעובדות במבחנה לשלב נייח בתקשורת הנוזלית לייצור חיידקים שכותרתו "העברה ל'(איור 1 א). חיידקים משמשים הבא כדי להדביק monolayers של A. castellanii עבור 18 שעות כדי להשיג שלב מאוחר של מחזור החיים התאי. וקואולות גדולה מכילהחיידקי ing ניתן דמיינו בנקודת זמן זו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1 א). תאי protozoan מכן lysed וחיידקים התאוששו מlysate נמדדים לפליטה ב512 ננומטר באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי. פלואורסצנטי מתואם עם צפיפות אופטית לחישוב ריבוי-of-זיהום (משרד פנים) להדבקת תאי היעד (1 איור, * המתאם Curve). לאחר פלישה (ט 0) ו 18 שלאחר פלישה (ט 18) שעות, תאי יעד לכימות לקרינה, המייצגים חיידקים תוך תאיים. פלואורסצנטי ניתן לפקח על ידי מיקרוסקופ וcytometry זרימה, וספירת קיימא ניתן למדוד באמצעות ציפוי מושבה. Assay יחול תמיד מלווה בזיהומים עם ל 'פרא מסוג pneumophila ומתח פגום במערכת דוט / ICM הסוג הרביעית ההפרשה (Δ DotA) (איור 1 א). זה חשוב מספק בקרות פנימיות להשוואה ישירה בין פרא מסוגnd כל זנים מוטנטים isogenic המשמשים בתהליך ההדבקה. ההכללה של זן dota Δ לא האלים בשלב יחול קובעת סף לתצפית של פנוטיפים צמיחה נחלשו קשורים בזנים מוטנטים isogenic כי הם בתרבית במבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תרבויות הלגיונלה pneumophila לזיהומים בשלב קרקע
- להפוך כל L. זני pneumophila משמשים assay עם pAM239 פלסמיד, קידוד איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) מושרים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) 28. רצף של זני חיידקים על ברזל וציסטאין תוספת N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic חומצה (ACES) נאגר אגר תמצית שמרי פחם (CYEA) המכיל 6.25 מיקרוגרם / המ"ל chloramphenicol (CM) (לתחזוקת פלסמיד) ודגירה במשך 72 שעות ב 37 ° C.
- ההעברה בוצע בידוד של זן החיידקים לתוך ACES תוספת נאגר מרק תמצית שמרים (כן) עם 6.25 מיקרוגרם / המ"ל CM וIPTG 1 mM ולטפח לשלב נייח (O / N) בהקפה ייקרה ב 37 ° C.
- אשר ביטוי של GFP בתרבויות במבחנה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. העברת 10 μl של תרבות על גבי זכוכית מתחת לכיסויתלוש ותמונה באמצעות אובייקטיבי 60x עם עירור GFP / קוביית פליטה (AMG EVOS fl).
- מדולל aliquot μl 100 של כל התרבות במבחנה ל1:10 באמצעות H 2 O. סטרילי לעשות שימוש 100 μl כן תקשורת ריקה עם IPTG 1 mM ו6.25 מיקרוגרם / מיליליטר סנטימטר ומים. קח OD600 מדידות של הדילולים באמצעות ספקטרופוטומטר (Bio-Rad החכם Spec פלוס). לחשב את הנפח דרוש כדי להדביק גם במשרד פנים = 20 לכל התרבות במבחנה: V = [(האמבה seeded) x משרד פנים] / [OD 600 x (גורם דילול) x (קבוע)] = [(1 X 10 6 ) X (20)] / [OD 600 x (10) x (1 x 10 6)] = 2/OD 600. ריכוז החיידקים נקבע כOD 600 = 1.0 = 1 x 10 9 CFU / מ"ל.
2. זיהום שלב יחול שימוש Acanthamoeba castellanii
- לשמור ולטפח את האמבות במדיום PYG ATCC 712 ב175 סנטימטר 2 צלוחיות בRT.
- החלף תקשורת במבוי סתום אמבותtures 24 שעות לפני תחילת התרבויות הנוזליות החיידקים. באותו היום תרבויות חיידקי נוזלים התחילו, לאסוף ולספור תאים במיקרוסקופ אור באמצעות hemocytometer.
- דלל את האמבות עם תקשורת הטריה לריכוז סופי של 1 10 6 תאים / מ"ל x. זרעי צלחות 12-גם תא תרבות עם 1 aliquots המ"ל של האמבות באמצעות pipettor חוזר ולדגור על RT O / נ
- לאחר דגירה, לשטוף את הבארות של צלחות תא התרבות גם 12-3x עם 1 המ"ל סטרילי PBS באמצעות פיפטה 10 מ"ל סרולוגית וסיוע פיפטה ידנית.
- לאחר השאיפה של PBS, להוסיף 1ml של זיהום תקשורת (712 ATCC תקשורת PYG מינוס גלוקוז, peptone ותמצית שמרים) עם IPTG 1 מ"מ ו6.25 סנטימטר מיקרוגרם / מ"ל לכל באר. דגירת הצלחות בRT לשעה 1.
- להדביק בארות במשרד פנים = 20. צנטריפוגה את הצלחת ב 400 XG למשך 5 דקות (אפנדורף 5810R) ותצוף באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. להעביר לצלחת 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 חממה על 18 שעות.
- אשר את הזיהומים באמצעות הדמית תא חייה במיקרוסקופ פלואורסצנטי לפני לארח תמוגה תא וקציר של חיידקים.
3. זריעת THP-1 תאים לזיהום שלב תא יעד
- (בגין 24 שעתי התהליך הזה לפני הקמת תרבויות חיידקים נוזליות). לטפח THP-1 תאים ב75 סנטימטר 2 צלוחיות תרבות הקרובה confluency ב1640 תקשורת RPMI עם סרום 10% חום מומת עוברי שור (FBS).
- ספירת התאים באמצעות השעית hemocytometer, לדלל את THP-1 תאי שנת 1640 תקשורת RPMI עם 10% FBS ו 100 ng / ml phorbol-12-myristate-13-תצטט (PMA) לריכוז של 1 10 x 6 תאים / מ"ל , וצלחת ב1 aliquots מ"ל על צלחות תרביות תאים 12-כן. דגירת הצלחות עבור 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
4. עיבוד של חיידקים לזיהום שלב תא יעד לאחר זיהום שלב Priming
- לשאוב את התקשורת מהאמבות הדרוכות.
- Lysemoebae באמצעות 500 μl של הקרח הקר, Ultra-המסונן (UF) H 2 O סטרילית ולדגור על RT למשך 10 דקות.
- ברכת lysates לפי הסוג להתאמץ ולקחת מדידת ננומטר E 512 עבור כל אחד מlysates אסף באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי (המולקולרי ההתקנים Spectramax ג'מיני EM).
- חישוב 600 מדידה OD לlysates אסף: calcOD 600 = 0.0008 (E 512 - רקע lysate) + 0.0019. הנוסחא נקבעה בעבר על ידי שרטוט השוואה ישירה של שני OD 600 ושל 512 ננומטר מדידות E של דילולים של L. pneumophila GFP פראי מסוג הבעה משלב נייח בתרבות חוץ גופייה (איור 1 *). את lysates של אמבה אינה נגועה, בכפוף לאותם תנאים ניסיוניים כמו אמבה הנגועה, משמש כריק וספק ערך תיקון (למשל רקע lysate), אשר התאגד למשוואה. T הנפח הדרושo להדביק גם במשרד פנים = 20 מחושב לכל ברכת lysate: V = [(THP-1 seeded) x משרד פנים] / [calcOD 600 x (קבוע)] = [(1 X 10 6) x (20)] / [CalcOD 600 x (1 x 10 6)] = 20 / calcOD 600.
- שטוף את THP-1 תאי 3x עם PBS ולהוסיף 1 המ"ל RPMI טרי 1640 (10% FBS) לכל באר. THP-1 תאי דגירה במשך השעה 1 ב 37 ° C, 5% CO 2.
- להדביק את תאי THP-1 במשרד פנים המחושבים באמצעות lysates אסף. אפשר סט של בארות להישאר נגוע, ושמש כשליטה שלילית לניתוח cytometric זרימה. העיבוד לבמה תחול אמור להסתיים בפחות מ 30 דקות. את lysates נשמרים על קרח כדי להגביל כל שינויים בביטוי גני חיידקים לפני הזיהום.
- צנטריפוגה את הצלחת, לצוף להעלות את הטמפרטורה, ולדגור כמו בשלב יחול.
- שעה אחת לאחר פגיעה, להסיר את המדיה על ידי שאיפה ולשטוף בארות 3x עם PBS להסיר חיידקים תאיים.
- הוסף 1 מ"ל fresh RPMI 1640 (10% FBS) לבארות ולהחזיר את הצלחת לאינקובטור. הזמן מייד לאחר החלפת מדיה משמש כזמן אפס (ט 0). דגירת THP-1 התאים עבור 14-16 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
5. ניתוח ניסויי
הדמית תא חייה 5.1
תמונת הבארות הנגועות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (AMG EVOS fl) ב10X או 20X הגדלה (תרשימי 1A-D). את התמונות ניתן להשוות בין איכותי או כמותית לקביעת רמות הזיהום הוא בשלב האתחול וזיהומים בשלב תא המטרה.
cytometry זרימה 5.2
- פסגות הפליטה של זיהומים שונים ניתן להשוות על ידי cytometry זרימה (FACS BD Calibur). Trypsinize את THP-1 התאים הנגועים ולשטוף בעדינות אותם מהבארות ידי הערבוב ב PBS עם פיפטה.
- ברכת התאים לפי סוג הזן לתוך 15 מ"ל פלקון צינורות וגלולים ב 1800 XG ל2דקות בצנטריפוגה בראש הטבלה.
- להשעות את הכדורים במ"ל PBS 1 ותעביר ל1.5 צינורות microcentrifuge מ"ל.
- צנטריפוגה את המתלים ב1800 x גרם (אפנדורף 5424) ומחדש להשעות את הכדורים במ"ל PBS 1. אם כתוצאה מכך הם ההשעיות עכורות מאוד (OD 600 ≥ 1.0) הם חייבים להיות מדוללים ב PBS נוסף (1:03) כדי למנוע סתימה של הקווים בcytometer הזרימה.
- השתמש PBS סטרילי המסונן לאיזון של cytometer הזרימה ועל צעדים לרחוץ בין זריקות לדוגמה. עלילה מתפזרת קדימה / צד של תאי המטרה נגועים לפני ההזרקה של דגימות זיהום תא המטרה.
- לאסוף 20,000 אירועים כלל לכל מצב באמצעות עירור 488 ננומטר ליזר וערוץ FL1.
- אוכלוסיות תאים שלאחר לכידת שער להוציא תאים נגועים ואינטנסיביות עלילת פלואורסצנטי ביסטוגרמה (FlowJo) (האיור 1E).
5.3 ציפוי CFU
- לבחון את יעילות oזיהום F ע"י ציפוי CFU של התאים נקצרו עבור cytometry זרימה. הכן דילולים סידוריים של הדגימות בH 2 O Ultra-מסונן ב -10 -1, 10 -2, ו10 -3.
- 20 μl הצלחת של כל דילול על 1/3 מצלחת CYEA עם 6.25 מיקרוגרם / המ"ל סי.
- דגירת הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.
- לספור את המושבות באמצעות קיסם ודלפק תא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאה אופיינית לתהליך ההדבקה כל מתוארת באיור 1. לחיות micrographs קרינה סלולרית המתאר monolayers של A.castellanii נגוע בL. פראי מהסוג pneumophila בשלב יחול מוצג באיור 1 א. מידת הצלחה של הצעד יחולו תוביל לאוכלוסייה של כ 90% מתאי המארח המכילים וקואולות גדולה המאכלסת GFP חיידקים שכותרתו במשרד פנים הזאת. בפוסט זיהום 18 שעות, רוב א תאי castellanii השיגו המון חיידקים מרביים עדיין תמוגה מהאוכלוסייה היא מינימאלית. תחת מיקרוסקופ אור, זיהום יחול מוצלח יגלה אמבות מעוגלות ומנותקות. Gentamycin [25 מיקרוגרם / מ"ל] ניתן להוסיף לתרבות הבינונית 30 דקות עד 1 זיהום שלאחר שעות לחסל את התרומה של חיידקים תאיים. מתח Δ dota המוטציה, שאינו יכול לתמוך בטרנסלוקציה בתיווך ICM דוט / של effectors, לא צריך לגדול בא castellanii ואף בתרבות מבחנה צריך לזרוח כמו גם את הלחץ פראי הסוג, פלואורסצנציה המינימאלית צריכה להיות מזוהה עם הזן הזה בזיהום 18 שעתי הודעה. האמבות תופענה שטוחות וmonolayer צריך להיות שלם.
lysates סך מחסה L. pneumophila ופסולת תא מארח נחשפים מייד לניתוח spectrophotometric כדי לחשב ריכוז של חיידקים בדגימה. ניתן לחשב משרד פנים באמצעות עקומת המתאם (איור 1 *). תאי מטרה חייבים להיות מוכנים לכך שזיהום חיידקים דרוכים משמשים פחות מ 30 דקות לאחר תמוגה לשמור על השלמות של פרופילי ביטוי גנים. לאחר נגוע, תאי המטרה מודגרת ל14-18 שעות לפני שהם מעובדים. micrographs קרינה בתרשים 1B להדגים את היתרון פתוגניים נרכש על ידי protozoan-דרוך ל 'פרא מסוג pneumophila בזיהומים בשלב תא היעד של A. גastellanii בהשוואה לזן הזהה שהיה מוגבל בטיפוח לפני זיהום מבחנה. זיהומים בשלב תא מטרה הם פחות חזקים מאשר השלב יחול בשל ההכללה לאחר פגיעה לשטוף צעד 1-2 שעות (תא תלוי היעד). צעד החלפת מדיה זו מסיר חיידקים שאינם פולשניים, סנכרון הזיהום והפחתת קרינת רקע ביישומים הבאים. דמויות 1C-D להפגין micrographs קרינה של L. הטיפוסי פראי מסוג תרחיש pneumophila שני שלבי זיהום, שבו חיידקים דרוכים ראשון דרך זיהום של א ' castellanii, שנקטף מן תאי protozoan lysed, לכמת באמצעות עקומת קורלציה ונהג להדביק-1 THP מקרופאגים עבור 14 שעות.
לאחר מיקרוסקופיה, תאי trypsinized עבור cytometry זרימה (FACS BD Calibur). תאים נגועים משמשים לכיול מכונה לקדימה ופיזור צד. זיהומים עם כל לחץ הם תהליךאד עם 20,000 אירועים נרשם. 7.6.1 תוכנת FlowJo משמשת לניתוח הנתונים הגולמיים. בדרך כלל, פלואורסצנטי (488 עירור ננומטר) זמם ראשון נגד פיזור צד לזהות את קרינת הרקע של אוכלוסיית התאים הנגועה. מגרשים מגודרים להוציא אוכלוסייה זו ולהתוות מחדש כהיסטוגרמה של ספירות כלל מול עוצמת קרינה. מכיוון שכל תא חיידק מייצג יחידת הקרינה, עוצמת האות נותן ייצוג של עומס vacuolar בכל תא נגוע. עלילה אופיינית לזיהום פראי מסוג שמוצגת באיור 1E. בסך הכל, המספר היחסי של תאים נגועים זוהו על ידי cytometer הזרימה הוא נמוך יותר ממצופה בעת השוואה עם נתונים מיקרוסקופים. cytometry זרימת התא החי הוא רגיש מספיק כדי לזהות זאת סטיות מתח.
כימות של CFU של סך בדגימות מתבצעת על ידי יצירת דילולים סידוריים של התאים שהוכנו עבור cytometry זרימה והציפוי הבאעל CYEA תקשורת. לאחר 72 שעות ב 37 ° C, מושבות בודדות צריכות להיות ברורות ודלילות מספיק לספירה.
איור 1. תחול protozoan וזיהומים בשלב תאי היעד באמצעות הלגיונלה pneumophila. הפרשת IV סוג פרוע מסוג א 'או לקוי (Δ DotA) L. זני pneumophila היו מושרים להביע GFP דרך בתרבות חוץ גופייה (מסגרות קטנות) ונהגו להדביק א monolayers castellanii במשך 18 שעות במשרד פנים = 20. micrographs קרינה של זיהומים עם כל L. pneumophila מתח מוצג (מסגרות גדולות) כמיזוג של ניגוד שלב וE תמונות פלואורסצנציה 512 ננומטר עם 20X אובייקטיבי במיקרוסקופ פלואורסצנטי (AMG EVOS fl). סהרונים ירוקים הם נציג vacuolesharbori התאיng L. pneumophila. micrographs פלואורסצנציה GFP B. של זיהום 18 שעתי יעד תא שלב א castellanii עם ל 'פרא מסוג pneumophila נקטף מזיהום השלב יחול protozoan (למעלה) או במבחנה תרבותית (תחתון), שבו משרד פנים = 10 לכל חושב באמצעות המשוואה הנגזרת מהעקום מתאם מוצג (כחול *). העקומה הופקה באמצעות דילולים סידוריים של L. הפראי מהסוג pneumophila להביע GFP מ18 שעות בתרבות חוץ גופייה. ג פלואורסצנטי מיקרוסקופ של זיהום שלב הטרמה של א ' castellanii עם ל 'פרא מסוג pneumophila כמו ב() מיקרוסקופ של זיהום 14 שעתי יעד תא שלב מובחן PMA-1 THP מקרופאגים עם ל 'פרא מסוג פלואורסצנטי. ד pneumophila נקטף מזיהום השלב יחול protozoan ב( C). משרד פנים = 20 חושב באמצעות המשוואה נגזרת מcorעקומה ביחס מוצג (* כחול). המסגרת המוצגת היא מיזוג של ניגוד שלב וE512 ננומטר תמונות קרינה כמו ב(). עלילת היסטוגרמה א 'של נתוני cytometry זרימת השוואת THP-1 מקרופאגים נגועים (אדום) ותאים נגועים בprotozoan דרוך ל' פרא מסוג pneumophila (ירוק). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ביטוי גני חיידקי נתונה לפיקוח הדוק באמצעות שילוב של התקדמות ותגובה לאותות בmicroenvironment סביב מחזור חיים. פתוגנים Vacuolar כגון L. pneumophila להגיב לשפע של רמזים מארחים תא המופקים כאשר ממודר בphagosome. כתוצאה קולקטיבית של תשישות תזונתית בתא הפונדקאי, החיידק מפצה על ידי הבעת גורמים הנדרשים להפצה מוצלחת לתא מארח שלאחר מכן 25. L. pneumophila מותאם ביעילות לטפילים מגוון רחב של תאי protozoan ולכן מטפח קטלוג נרחב של חלבוני מפעיל לנהוג תהליך זה. חלבונים אלה מפעיל translocated ישירות לתוך הציטופלסמה המארח במהלך זיהום על ידי מערכת דוט / ICM סוג IVB הפרשת 16. טרנסלוקציה חלבון המפעיל נדרשה, כמו מוטציות שתוצאה בטרנספורטר פגום לבטל גידול תאי בכל סוג תא מארח לחלוטין. דבר יוצא דופןusly, מחיקות בודדות בחלבונים מסוימים מפעיל נדיר הביאו להנחתת צמיחה תאית. כמעט 300 חלבוני מפעיל, או כמעט 10% של הגנום קידוד החלבון אומתו כדוט / ICM מצעי 14,15. כמה שערות צמחו להסביר חוסר פנוטיפים נצפים למחיקות מפעיל, כולל נוכחות של עותקי paralogous או הרכישה האופקית של אנזימי orthologous תוצאה מהמגוון הרחב של מארח L. pneumophila.
בגלל L. pneumophila צובר יתרון פתוגניים כאשר מראש תרבותי בתאי protozoan (איורי 1 א '-B), שטענו כי בתרבית חיידקים במבחנה לא יציג את אותו הפרופיל הגנטי הביטוי ניכר בחיידקים יוצאים מארח protozoan. לכן, ביטוי של חלבונים מסוימים מפעיל יכול להיגרם אך ורק בהקשר של צמיחה תאית בתאי protozoan. אם מפעיל מסוים לא גרם לדוארxpression במהלך בתרבות חוץ גופייה, מהתרומה של המפעיל נמחק לא ניתן להעריך ביעילות בתרחיש זיהום מסורתי. פנוטיפים לגורמים ארסיים חשובים להקמת זיהום או הפצה יהיו לזהות רק בזיהומים ממושכים שאפשרו לתא לתא התפשטות. לכן בקשתי לפתח assay שיכול למדוד את התרומה של גורמים ארסיים פוטנציאליים בהקשר של זיהום רציף. במקרה של ל 'טבעי pneumophila הרכישה, סביר להניח כי מארח אנושי היה נתקל חיידק שהוכשר עתה לזיהום בתא protozoan; בי הפרוטוזואנים יכולים להיות עמידים יותר למנהגים מסורתיים עירוניים לטיפול במי 10.
על מנת לייעל את הטיהור החלקית של כמויות מספיקות של חיידקים דרוכים, הקימו עומס חזותי צייתן ל '1 pneumophila באמצעות מושרה IPTG GFP uלשיר עותקי מקורן פלסמיד של לוקוס GFP. גם אנחנו שנוצרנו הכנסה כרומוזומלית עותק יחידה של IPTG GFP המושרה על הגנום פראי מהסוג. למרות ששני הזנים לזרוח במבחנה במהלך הדבקה, עותק המספר הגבוה יותר של GFP פלסמיד הנישא מיוצר אות מספיק עבור יישומים במורד זרם assay. סכמנו את זה באמצעות המרק L. התרבותי pneumophila במשרד פנים = 20 היה מספיק כדי להדביק כבדות א monolayers castellanii. שמונה עשר שעות של דגירה נקבעו כאופטימלי לדמיין וקואולות ניאון גדולה בלי להגיע לשלב של תמוגה תא מארח (איור 1 א). monolayers protozoan לא דבק פלסטיק תרביות תאים, ולכן הם מוטרדים בקלות עם צעדי כביסה. צלחות תרביות תאים 12-גם הפיקו את monolayers היציב ביותר בהשוואה לכלים אחרים (6 או 24 גם, צלחת סנטימטר 10). בגלל L. pneumophila לא יכול לגדול במדיום הזיהום השתמש בדואר צעד יחולו, בחר לנטוש כל צעד לשטוף כדי להסיר חיידקים תאיים. זה משפר באופן משמעותי את התשואה של אמבה נגועה בmonolayer. Gentamycin גם משמש לעתים קרובות כדי להרוג חיידקים תאיים. מצאנו תופעות רעילות בריכוזי protozoan מעל 25 מיקרוגרם / מ"ל, ולא מצאנו הבדלים במספר הכולל של חיידקים שהתגלו זיהום השלב יחול ב 18 שעות. תמוגה של monolayer תא protozoan בוצעה עם הקרח H 2 O Ultra-מסונן הקר, ממס שאוסמוטי פוגע בתא המארח מבלי לפגוע L. pneumophila. אם מותאם לשימוש עם פתוגנים שאינם יציבים בH 2 O, 0.1% Triton X-100 ב PBS ניתן להשתמש כדי lyse אמבות עם תוצאות דומות.
כדי להשוות ישירות מתח להתאמץ הבדלים בזיהומי תא היעד הבאים, משוואה נוצרה כדי לקשר בין צפיפות אופטית של חיידקים ב 600 ננומטר עם פליטת קרינה של ה-GFP ב512 ננומטר (Figurדואר 1 *). אנחנו בחרנו להשתמש פליטת פלואורסצנטי כאמצעי לכימות בשל התרומה הגדולה של פסולת תא מארח ב600 מדידות OD מlysates הסלולרי האיקריוטים. רקע גבוה זאת בניגוד לערכים זניחים נצפו לפליטה ב512 ננומטר מאותם lysates. הערכים של OD 600 = 1.0 = 1x10 9 CFU / המ"ל היו ידועים מראש לL. pneumophila, המאפשר חישוב ריכוז חיידקים על פני טווח רחב של ערכי קרינה. אורגניזמים רבים הקימו ערכי CFU לOD 600 = 1.0, אשר יאפשר ליישום טכניקה זו לכל פתוגן אחר באמצעות דור של עקומת קורלציה מבוססת על פליטת קרינה. אנחנו בחרנו להימנע מצעד טיהור חיידקים במהלך תמוגה של תאי protozoan כדי 1) למקסם את התשואה של חיידקים דרוכים הזמינה להדבקת תא המטרה ו2) לצמצם את הזמן שבין קציר וזיהום לאחר לשמר עמ ביטוי גנים הגלובלייםatterns.
במבחנת L. התרבותי פרא מסוג pneumophila היה מושרה להביע GFP ל18 שעות עם IPTG 1 מ"מ. דילולים סידוריים של תרבות זו שמשו למדידת spectrophotometric. תוך שימוש במשוואה נגזרת, זיהומי תא המטרה היו מבוצעים באופן שגרתי במשרד פנים של משתנה עם תפוקה עקבית. משרד פנים של 10 מיוצר כ 1/2 מספר התאים נגועים כלל בהשוואה לזיהומים שקבלו משרד פנים של 20 (איורי 1 א '-B). בדקנו את שלושה צבאות תא היעד עם assay זה; א castellanii, J774 מקרופאגים Murine ו- 1 THP מקרופגים PMA-מובחן אדם. בכל מקרה, הזיהום כתוצאה מעולם לא היה חזק כמו הזיהום יחול באותו משרד פנים (איורי 1C-D). אנחנו קבענו שצעד נוסף במהלך שטיפת זיהום שלב תא המטרה, המבוצע לשניהם לסנכרן את זיהום תא המטרה ולהפחית חיידקים תאיים, הוא השו"תonsible לאבחנה זו. עם זאת, חשוב שהניסוי מבוקר באופן פנימי עם זן פראי מסוג לשניהם יחולו וזיהומים בשלב תא המטרה. כמויות חיידקים שנמצאו בשלב יחול ולא מגבילות לזיהומים שלאחר מכן, ולכן רק סוג תא מטרה אחת יש להשתמש בכל ניסוי.
כימות זיהום תא המטרה הושגה באמצעות שלוש שיטות בבדיקה זו. מיקרוסקופ פלואורסצנטי שמש עם 20X אובייקטיבי. תמונות של וקואולות מחסה L. pneumophila נספרו באופן ידני ממספר שדות לכל זן נבדק. ניתוח cytometric תזרים למדד רגיש להבדלים בתאים נגועים כלל, כמו גם קירוב של עומס vacuolar; בי אות פלואורסצנציה גבוהה הייתה תואמת את התרומה של אות ה-GFP ממספר גדל והולך של L. תאי pneumophila. ציפוי דילול סידורי ספק ערכים כמותיים למספר כוללהנפח של כל CFU בדגימות התאים שנאספו עבור cytometry זרימה. באופן קולקטיבי, שיטות אלו ייאפשרו לתוצאות צייתניות וכימות באופן מלא בתרחיש זיהום רציף.
Assay יחול הוא די מגוון ומתאים להסתגלות לכל חיידקים פתוגנים המשתמש הפרוטוזואנים מים מתוקים כביניים סביבתיים 29,3. הבחירה של תא המטרה ניתן לדאוג להתאים את מסלול ההדבקה הטבעית לפתוגן המסוים. חשוב מכך, מודל זיהום רציף יכול לשמש לבדיקת זנים מוטנטים שלא הציג עם הפנוטיפ צמיחה במודל מסורתי באמצעות זיהום חיידקים במבחנת תרבית. פרופיל שעתוק בחיידקים בתרבית מבחנה לגורמים ארסיים משוערים יכול לחשוף הבדלים עיקריים בפרופיל של ביטוי בפונדקאי ביניים הנגוע. זו יכולה לפתוח קו חדש של חקירה לתפקוד של חלבוני uncharacterized ותרומתם לטבעמסלולי זיהום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר קרייג ורוי ד"ר דריו מחליקים על מתן תבנית לזיהומים סלולריים protozoan. אנו מודים לד"ר Jagdeep Obhrai, ד"ר ג'ורג'יאנה פורדי, ד"ר פרד הפרון וטוד יזנר לציוד וריאגנטים; ד"ר הלול Cambronne לסקירה ביקורתית של כתב היד. cytometry הזרימה בוצע במתקן OHSU תזרים Cytometry המשותף המשאבים. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק מהקרן למחקר הרפואית של אורגון ומענק NIH R21 AI088275 (EDC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | antibiotic |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| ACES | Sigma | A9758-1KG | media component |
| ATCC medium: 712 PYG | ATCC | growth media for protozoans | |
| 1X PBS | Fisher Scientific | SH30256FS | phosphate buffered saline |
| activated charcoal | Fisher Scientific | C272-212 | media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | media component |
| peptone | BD Diagnostics | 211677 | media component |
| agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | media component |
| L-cysteine, 99%+ | Acros organics | 173601000 | media supplement |
| Ferric nitrate nonahydrate | Fisher Scientific | I110-100 | media supplement |
| Equipment | |||
| EVOS fl | AMG | EVOS fl | fluorescence microscope |
| Smart Spec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | spectrophotometer |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 22627023 | bench top centrifuge |
| Repeater plus | Eppendorf | 22230201 | repeating pipette |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | microplate reader | |
| Softmax Pro 5.3 | Molecular Devices | 0200-310 | microplate reader software |
| 5424 microfuge | Eppendorf | 22620401 | table top microcentrifuge |
| Fast-release pipette pump II | Scienceware | 379111010 | pipette aid |
| FACS Calibur | BD Bioscience | flow cytometer | |
| FlowJo 7.6.1 | FlowJo | license | flow cytometery software |
| 15 ml tube | BD Falcon | 352096 | polypropylene conical tube |
| 1.6 ml microfuge tube | Neptune | 3745.X | microcentrifuge tubes |
References
- Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues. Science. 259, 686-688 (1993).
- Mahan, M. J., et al. Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).
- Rankin, S., Isberg, R. R. Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment. Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).
- Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth. Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).
- Fields, B. S. The molecular ecology of legionellae. Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).
- Cirillo, J. D., et al. Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion. Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).
- Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages. Front Microbiol. 2, 60 (2011).
- Kilvington, S., Price, J. Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure. J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).
- King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination. Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).
- Horwitz, M. A. Formation of a novel phagosome by the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).
- Horwitz, M. A. Phagocytosis of the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil. Cell. 36, 27-33 (1984).
- Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes. J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).
- Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638 Forthcoming.
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Front Microbiol. 2, 136 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Shin, S., Roy, C. R. Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila. Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).
- Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
- Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).
- Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
- Segal, G., Shuman, H. A. Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila. Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Haghjoo, E., Galan, J. E. Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi. Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).
- Molofsky, A. B., Swanson, M. S. Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle. Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).
- Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).
- Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation. Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).
- Neild, A. L., Roy, C. R. Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation. Immunity. 18, 813-823 (2003).
- Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
- Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA. Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).
