Summary
Questa tecnica fornisce un metodo per raccogliere, normalizzare e quantificare la crescita intracellulare di batteri patogeni che sono pre-coltivate in cellule naturali ospiti protozoi prima di infezioni di cellule di mammifero. Questo metodo può essere modificato per accogliere una grande varietà di cellule ospiti per la fase di adescamento e tipi di cellule bersaglio.
Abstract
Molti batteri patogeni intracellulari utilizzare protozoi d'acqua dolce come un serbatoio naturale per la proliferazione nell'ambiente. Legionella pneumophila, l'agente eziologico della legionario 'polmonite, guadagna un vantaggio su di batteri patogeni in vitro in coltura al momento della prima raccolti da cellule protozoi prima infezione di macrofagi mammiferi. Questo suggerisce che i fattori di virulenza importanti non possono essere adeguatamente espresse in vitro. Abbiamo sviluppato un sistema per l'adescamento trattabile L. pneumophila attraverso il suo naturale ospite protozoo Acanthamoeba castellanii prima dell'infezione cellula di mammifero. Il contributo di ogni fattore di virulenza può essere esaminata confrontando la crescita intracellulare di un ceppo mutante di wild-type batteri dopo aver riempito protozoo. GFP che esprimono L. wild-type e mutante ceppi pneumophila sono utilizzati per infettare monostrati protozoi in fase di caricamento, e ha permesso di raggiungere ultime fasi della crescita intracellulare. Batteri fluorescenti vengono quindi raccolte da queste cellule infette e normalizzati per spettrofotometria per generare numeri comparabili di batteri per una successiva infezione in macrofagi mammiferi. Per la quantificazione, batteri vivi sono monitorati dopo l'infezione usando la microscopia a fluorescenza, citometria a flusso, e mediante placcatura colonia. Questa tecnica mette in evidenza e si avvale del contributo della cellula ospite-dipendente l'espressione del gene imitando l'ambiente che si può incontrare in un percorso di acquisizione naturale. Questo approccio può essere modificato per ospitare qualsiasi batterio che utilizza un host intermediario come un mezzo per ottenere un vantaggio patogeno.
Introduction
Numerosi batteri patogeni si sono adattati strategie generalizzate per sfruttare cellule ospiti per la sopravvivenza e la replicazione in un compartimento intracellulare. In molti casi, i meccanismi patogenetici sono simili tra protozoi e metazoi le cellule. Tuttavia, questi due microambienti sono molto diversi e possono provocare un'espressione differenziale di fattori di virulenza 1-4. Il batterio della malattia del legionario 'Legionella pneumophila è ubiquitariamente associati agli ambienti d'acqua dolce in tutto il mondo 5. È importante sottolineare che, L. pneumophila coltivato in cellule protozoarie prima infezione dei monociti umani acquisire un vantaggio patogeno, suggerendo che globali profili di espressione genica del batterio uscita una cella protozoo sono diverse da quella del coltivati in vitro dell'organismo 6-8. In natura, amebe acqua dolce forniscono nutrienti confini ricchi per l'amplificazione rapida di un batterio invasore. Acquisizione umana della L. pneumophila è spesso attribuita a inalazione di goccioline di acqua contaminata che contengono il batterio. È probabile che queste goccioline porto protozoi cellula batteri associati; dove cellule protozoarie sono più resistenti alle pratiche convenzionali di trattamento delle acque 9,10. Infezione di macrofagi alveolari polmonari procede in modo quasi identico al ciclo di vita del batterio intracellulare in cellule ospiti protozoi 11-13.
Per sopravvivere e replicarsi in cellule eucariotiche, L. pneumophila utilizza uno speciale sistema di secrezione di tipo IV ter chiamato Dot / Icm per fornire circa 300 "effettrici" proteine nel citosol della cellula ospite 14-16. Queste proteine effettrici collettivamente funzionamento per sovvertire processi cellulari per generare un vano permissive per la replicazione del batterio 17,18. Delezioni in qualsiasi dei 26 geni che costituiscono il Dot / Icm risultato trasportatore in ceppi difettosi per mult intracellulareiplication 19-23. Storicamente, cancellazione di singoli geni codificanti effettori raramente portato in ceppi attenuati di crescita intracellulare. Questo fenomeno è stato attribuito a diverse ipotesi tra cui la funzione ridondante e copie paralogous di effettori.
Alcuni fattori di virulenza sono espressi solo nel contesto della cellula ospite associata crescita intracellulare 24. Abbiamo razionalizzato che se un effettore particolare è stato espresso soltanto nel contesto di infezione protozoo, quindi il contributo del effector non può essere confrontato con un ceppo selvatico quando entrambi sono stati coltivati in vitro. L. pneumophila transizioni da un replicativa a una fase trasmissivo, che entra nella fase stazionaria cultura 25. Il fenotipo di commutazione fase rappresenta l'esaurimento degli elementi nutritivi incontrato durante la crescita intracellulare ed è esemplificata attraverso il montaggio di flagelli per la motilità 26. Perché L. pneumophila è più invaSIVE e virulenta quando raccolto da cellule protozoi, abbiamo cercato di sviluppare un metodo che più fedelmente rappresentato lo stato patogeno del batterio quando ha incontrato macrofagi host.
A tal fine, abbiamo sviluppato un saggio di adescamento protozoo versatile in grado di ospitare qualsiasi host adatto sia per i primi (cella priming) e la seconda (cella di destinazione) infezioni stadio. Il processo di infezione è trattabile mediante uso di batteri che esprimono stabilmente la proteina fluorescente verde (GFP). Il modello di infezione per il protozoo Acanthamoeba castellanii segue una metodologia ampiamente usato nel campo 27. Per la fase di caricamento, L. ceppi pneumophila sono coltivati in vitro alla fase stazionaria in mezzi liquidi per produrre etichettati 'trasmissive' batteri (Figura 1A). I batteri vengono quindi utilizzati per infettare monostrati di A. castellanii per 18 ore per ottenere una fase avanzata del ciclo di vita intracellulare. Vacuoli di grandi dimensioni contengonobatteri zione può essere visualizzata a questo punto di tempo utilizzando microscopia a fluorescenza (Figura 1A). Protozoi cellule vengono lisate e batteri recuperati dal lisato sono misurati per l'emissione a 512 nm usando un lettore di fluorescenza piastra. Fluorescenza è correlata con la densità ottica per calcolare molteplicità d'infezione (MOI) per l'infezione di cellule bersaglio (Figura 1, Correlazione * Curve). Dopo ore invasione (T 0) e 18 post-invasione (T 18), le cellule bersaglio sono quantificati per la fluorescenza, che rappresenta i batteri intracellulari. Fluorescenza può essere monitorato mediante microscopia e citometria a flusso, e la conta può essere misurata mediante placcatura colonia. Il test di adescamento è sempre accompagnato da infezioni da wild-type L. pneumophila e un ceppo difettosa in Dot / Icm sistema secrezione di tipo IV (Δ DOTA) (Figura 1A). Ciò fornisce soprattutto controlli interni per i confronti diretti tra wild-type di unnd eventuali ceppi mutanti isogenici utilizzati nel processo di infezione. L'inclusione del ceppo virulento Δ DOTA durante la fase di adescamento imposta una soglia per l'osservazione della crescita attenuati fenotipi associati isogeniche ceppi mutanti che sono coltivate in vitro.
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Protocol
1. Preparazione di Legionella pneumophila Culture per le infezioni della fase di priming
- Trasforma tutti L. ceppi pneumophila usare nel saggio con le plasmide pAM239, codificante un isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) inducibile proteina fluorescente verde (GFP) 28. Streak i ceppi batterici sul ferro e cisteina integrato N-(2-acetammido)-2-acido aminoethanesulfonic (ACES) tamponata agar carbone estratto di lievito (CYEA) contenente 6,25 mg / ml di cloramfenicolo (CM) (per manutenzione plasmide) e incubare per 72 hr a 37 ° C.
- Trasferire un inoculo del ceppo batterico in ACES integrate tamponato estratto di brodo di lievito (AYE) con 6,25 mg / ml CM e 1 mM IPTG e coltivare di fase stazionaria (O / N) su un agitatore orbitale a 37 ° C.
- Confermare espressione GFP in colture in vitro utilizzando la microscopia a fluorescenza. Trasferire 10 microlitri di cultura su un vetrino sotto una coperturaslip e immagine utilizzando un obiettivo 60X con eccitazione GFP / cubo di emissione (AMG EVOS fl).
- Diluire un'aliquota di 100 ml di ciascuna coltura in vitro a 1:10 con sterile H 2 O. Fai il bianco con 100 pl AYE supporti con 1 mM IPTG e 6,25 mg / cm ml e acqua. OD600 prendere misure delle diluizioni utilizzando uno spettrofotometro (Bio-Rad intelligente Spec Plus). Calcolare il volume necessario per infettare un pozzo ad una MOI = 20 per ciascuna coltura in vitro: V = [(ameba seeded) x MOI] / [OD 600 x (fattore di diluizione) x (costante)] = [(1 x 10 6 ) x (20)] / [OD 600 x (10) x (1 x 10 6)] = 2/OD 600. Concentrazione di batteri viene determinato come OD 600 = 1.0 = 1 x 10 9 UFC / ml.
2. Adescamento infezione stage utilizzando Acanthamoeba castellanii
- Mantenere e coltivare le amebe in ATCC 712 medie PYG in 175 cm 2 flaconi a temperatura ambiente.
- Sostituire media in cul amebeture 24 ore prima di iniziare le colture batteriche liquidi. Lo stesso giorno liquido colture batteriche sono avviati, raccogliere e contare le cellule su un microscopio ottico utilizzando un emocitometro.
- Diluire il amebe con mezzi freschi ad una concentrazione finale di 1 x 10 6 cellule / ml. Seed 12 e piastre di coltura cellulare con aliquote da 1 ml di amebe con un pipettatore a ripetizione ed incubare a RT O / N.
- Dopo l'incubazione, lavare i pozzetti delle piastre di coltura cellulare da 12 pozzetti 3x con 1 ml di PBS sterile utilizzando una pipetta 10 ml sierologica e un aiuto pipetta manuale.
- Dopo l'aspirazione di PBS, aggiungere 1 ml di infezione supporti (ATCC 712 supporti PYG meno glucosio, peptone, estratto di lievito e) con IPTG 1 mM e 6,25 mcg / ml cm a ciascun pozzetto. Incubare le piastre a RT per 1 ora.
- Infettare pozzetti ad una MOI = 20. Centrifugare la piastra a 400 xg per 5 min (Eppendorf 5810R) e galleggiare in un bagno di acqua 37 ° C per 5 min. Trasferire la piastra ad un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 18 ore.
- Confermare le infezioni utilizzando l'imaging dal vivo cella di un microscopio a fluorescenza prima di ospitare la lisi cellulare e la raccolta di batteri.
3. Semina cellule THP-1 per l'infezione fase cella obiettivo
- (Inizia questo processo 24 ore prima di impostare liquidi colture batteriche). Coltivare cellule THP-1 in un cm 75 due fiasche per colture a quasi confluenza in RPMI 1640 con 10% di siero siero fetale bovino (FBS).
- Contare le cellule in sospensione utilizzando un emocitometro, diluire le cellule THP-1 in RPMI 1640 con 10% di FBS e 100 ng / ml forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / ml , e la piastra in aliquote da 1 ml su piastre di coltura cellulare da 12 pozzetti. Incubare le piastre per 48 ore a 37 ° C, 5% di CO 2.
4. Lavorazione dei batteri per infezione fase cella obiettivo dopo l'infezione stage adescamento
- Aspirare il supporto dal amebe innescato.
- Lyse l'unamoebae utilizzando 500 pl di ghiaccio freddo, sterile ultra-filtrata (UF) H 2 O ed incubare a temperatura ambiente per 10 min.
- Pool I lisati secondo ceppo e prendere una misura E 512 nm per ciascuno dei lisati aggregati utilizzando un lettore di piastra di fluorescenza (Molecular Devices Spectramax Gemini EM).
- Calcolare un misura 600 DO per tutti i lisati pool: calcOD 600 = 0,0008 (E 512 - sfondo lisato) + 0,0019. La formula è stata precedentemente determinate dal grafico di un confronto diretto sia la DO 600 e la E 512 nm misure di diluizioni di L. pneumophila GFP di tipo esprimendo fase stazionaria da coltura in vitro (Figura 1 *). I lisati di ameba non infetto, alle stesse condizioni sperimentali l'ameba infetta, sono usati come bianco e fornito un valore di correzione (lisato es sfondo), che è stato accolto nell'equazione. La t volume necessarioo infettare un pozzo ad una MOI = 20 viene calcolato per ciascun pool lisato: V = [(THP-1 seminate) x MOI] / [calcOD 600 x (costante)] = [(1 x 10 6) x (20)] / [calcOD 600 x (1 x 10 6)] = 20/600 calcOD.
- Lavare le cellule THP-1 3x con PBS e aggiungere 1 ml fresco RPMI 1640 (10% FBS) in ciascun pozzetto. Incubare le cellule THP-1 per 1 ora a 37 ° C, 5% di CO 2.
- Infettare le cellule THP-1 al MOI calcolato utilizzando i lisati pool. Permettono una serie di pozzi di rimanere non infetto, serve come controllo negativo per l'analisi citofluorimetrica. Elaborazione dello stadio primer deve essere completato in meno di 30 minuti. I lisati sono tenuti su ghiaccio per limitare eventuali cambiamenti nell'espressione genica batterica prima dell'infezione.
- Centrifugare la piastra, galleggiare per aumentare la temperatura, e incubare come nella fase di adescamento.
- Un'ora dopo l'infezione, rimuovere il supporto mediante aspirazione e lavare i pozzetti 3 volte con PBS per rimuovere i batteri extracellulari.
- Aggiungere 1 ml di fresh RPMI 1640 (10% FBS) ai pozzetti e restituire la piastra al incubatore. Il tempo subito dopo la sostituzione dei supporti serve come tempo zero (T 0). Incubare le cellule THP-1 per 14-16 ore a 37 ° C, 5% di CO 2.
5. Analisi sperimentale
5,1 imaging cellulare in diretta
Immagine i pozzetti infetti utilizzando un microscopio a fluorescenza (AMG EVOS fl) a 10X o 20X di ingrandimento (Figure 1A-D). Le immagini possono essere confrontati qualitativa o quantitativa per determinare i livelli di infezione sia in fase di innesco e di destinazione infezioni stadio cellulari.
5,2 Citometria a flusso
- I picchi di emissione di diverse infezioni possono essere confrontati mediante citometria a flusso (BD FACS Calibur). Tripsinizzare gli infetti cellule THP-1 e delicatamente di lavaggio dai pozzetti mescolando in PBS con una pipetta.
- Piscina le cellule tipo versare in 15 ml Falcon tubi e pellet a 1.800 xg per 2min nella centrifuga piano del tavolo.
- Sospendere il pellet in 1 ml di PBS e trasferire ai tubi microcentrifuga da 1,5 ml.
- Centrifugare le sospensioni a 1.800 x g (Eppendorf 5424) e risospendere il pellet in 1 ml di PBS. Se le sospensioni risultanti sono altamente torbidi (OD 600 ≥ 1,0) devono essere diluiti in PBS supplementare (1:3) per impedire l'intasamento delle linee del citofluorimetro.
- Utilizzare sterile filtrata PBS per l'equilibramento della citometria a flusso e per le fasi di lavaggio tra le iniezioni del campione. Tracciare l'avanti / lato dispersione di cellule bersaglio infettate prima iniezione di campioni di cellule bersaglio di infezione.
- Raccogliere 20.000 eventi totali per ogni condizione con 488 nm di eccitazione laser e il canale FL1.
- Porta post-acquisizione popolazioni cellulari di escludere le cellule non infette e l'intensità trama fluorescenza in un istogramma (FlowJo) (Figura 1E).
5,3 CFU placcatura
- Esaminare l'efficienza of infezione mediante placcatura CFU delle cellule raccolte per citometria a flusso. Preparare diluizioni seriali dei campioni in ultra-filtrata H 2 O a 10 -1, 10 -2 e 10 -3.
- Piastra 20 pl di ciascuna diluizione su 1/3 di una piastra CYEA con 6,25 mg / ml CM.
- Incubare le piastre a 37 ° C per 72 ore.
- Contare le colonie con uno stuzzicadenti e contatore di cellule.
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Representative Results
Un risultato tipico per l'intero processo di infezione è descritto nella Figura 1. Vivo delle cellule al microscopio a fluorescenza che raffigurano monostrati di A.castellanii infettati con wild-type L. pneumophila durante la fase di adescamento è mostrato nella Figura 1A. Una misura di successo della fase di caricamento porterebbe ad una popolazione di circa il 90% delle cellule ospiti contenenti grandi vacuoli popolate con batteri GFP etichettati in questo MOI. A 18 ore dopo l'infezione, la maggior parte A. castellanii cellule hanno raggiunto massimi di carica batterica ancora lisi della popolazione è minima. In microscopia ottica, una infezione adescamento successo rivelerà amebe arrotondate e distaccato. Gentamicina [25 mcg / ml] può essere aggiunto al mezzo di coltura 30 minuti a 1 ora dopo l'infezione di eliminare il contributo dei batteri extracellulari. Il Δ Dota ceppo mutante, che non può sostenere Dot / Icm-mediata traslocazione di effettori, non dovrebbe crescere inA. castellanii e sebbene la coltura in vitro deve fluorescenza nonché il ceppo di tipo selvatico, fluorescenza minima deve essere rilevato con questo ceppo a 18 ore dopo l'infezione. Amebe appare piatto e il monostrato dovrebbe essere intatto.
Lisati totali ospitano L. pneumophila e detriti cellula ospite sono immediatamente sottoposti ad analisi spettrofotometrica per calcolare la concentrazione di batteri nel campione. MOI può essere calcolato utilizzando la curva di correlazione (Figura 1 *). Cellule bersaglio deve essere preparato per l'infezione da batteri innescate tale che vengono utilizzati meno di 30 minuti dopo lisi per preservare l'integrità dei profili di espressione genica. Una volta infettato, le cellule bersaglio sono incubate per 14-18 ore prima di essere trasformati. Microscopio a fluorescenza in Figura 1B dimostrare il vantaggio acquisito dal protozoo patogeno-sione wild-type L. pneumophila nelle infezioni delle cellule bersaglio fase di A. castellanii rispetto al ceppo identico che è stato limitato a colture in vitro prima dell'infezione. Destinatari infezioni stadio cellule sono meno robusti di fase di adescamento per l'inclusione di un lavaggio passo 1-2 ore post-infezione (target cellulare-dipendente). Questo passaggio rimuove la sostituzione dei supporti non invasivi batteri, sincronizzando l'infezione e ridurre la fluorescenza di base in applicazioni successive. Figure 1C-D dimostrano micrografie fluorescenza di una tipica wild-type L. pneumophila in due fasi scenario di infezione, dove i batteri vengono prima mano di fondo attraverso l'infezione di A. castellanii, raccolto da cellule lisate protozoi, quantificato utilizzando la curva di correlazione e utilizzato per infettare macrofagi THP-1 per 14 hr.
Dopo microscopio, le cellule vengono tripsinizzate per citometria a flusso (BD FACS Calibur). Cellule non infettate sono utilizzati per calibrare la macchina in avanti e scatter laterale. Le infezioni da ogni ceppo sono processied con 20.000 eventi registrati. FlowJo 7.6.1 il software viene utilizzato per analizzare i dati grezzi. Tipicamente, fluorescenza (eccitazione 488 nm) viene prima tracciato rispetto scatter laterale per identificare la fluorescenza di fondo della popolazione di cellule non infette. Personaggi sono gated per escludere questa popolazione e ri-tracciata come un istogramma di conteggi totali rispetto intensità di fluorescenza. Poiché ogni cellula batterica rappresenta un'unità di fluorescenza, l'intensità del segnale fornisce una rappresentazione del carico vacuolare in ciascuna cellula infettata. Un grafico tipico di un virus selvaggio è mostrato in Figura 1E. Nel complesso, il numero relativo di cellule infette rilevate dal citofluorimetro è inferiore al previsto nel confronto con i dati di microscopia. Vivo citometria a flusso delle cellule è abbastanza sensibile per rilevare tuttavia variazioni di deformazione.
Quantificazione del totale CFU nei campioni viene eseguita generando diluizioni seriali di cellule preparate per citometria di flusso e la successiva placcaturail CYEA media. Dopo 72 ore a 37 ° C, singole colonie dovrebbe essere evidente e rada abbastanza per il conteggio.
Figura 1. Protozoi adescamento e di destinazione infezioni stadio delle celle utilizzando Legionella pneumophila. A. wild-type o di secrezione di tipo IV carente (Δ DOTA) L. pneumophila ceppi sono stati indotti ad esprimere GFP mediante coltura in vitro (telaietti) e utilizzato per infettare A. monostrati castellanii per 18 ore a MOI = 20. Microscopio a fluorescenza di infezioni con ogni L. pneumophila ceppo sono mostrati (frame di grandi dimensioni) come una fusione di contrasto di fase e E 512 nm immagini di fluorescenza con un obiettivo 20x su un microscopio a fluorescenza (AMG EVOS fl). Mezzelune verdi sono rappresentativi della intracellulare vacuolesharboring L. pneumophila. B. GFP micrografie fluorescenza del 18 infezione bersaglio fase cellula ore di A. castellanii con wild-type L. pneumophila raccolti dal protozoo infezione fase di adescamento (in alto) o coltivate in vitro (in basso), dove il MOI = 10 per ogni stato calcolato usando l'equazione derivato dalla curva di correlazione mostrata (blu *). La curva è stata prodotta utilizzando diluizioni seriali di wild-type L. pneumophila esprimere GFP da un hr 18 in coltura in vitro. C. fluorescenza microscopio di una infezione adescamento fase di A. castellanii con wild-type L. pneumophila come in (A). D. al microscopio a fluorescenza di un infezione 14 bersaglio fase cellula ore di PMA differenziata THP-1 macrofagi di tipo selvaggio L. pneumophila raccolti dal protozoo infezione in fase di adescamento (C). La MOI = 20 è stata calcolata secondo l'equazione derivata dalla corcurva di relazione mostrata (* blu). Il telaio puo 'unione di contrasto di fase e fluorescenza E512 nm immagini come in (A). Grafico Istogramma E. dei dati di citometria a flusso confronto THP-1 non infette macrofagi (rosso) e le cellule infettate con protozoo innescato wild-type L. pneumophila (verde). Barra di scala = 100 micron. Clicca qui per ingrandire la figura.
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Discussion
Espressione genica batterico è strettamente controllata mediante una combinazione di progressione del ciclo di vita e di risposta ai segnali nel microambiente circostante. Vacuolare patogeni come L. pneumophila rispondere a una moltitudine di cellula ospite derivati spunti quando compartimenti stagni in un phagosome. Come risultato collettivo di esaurimento nutrienti nella cellula ospite, il batterio compensa esprimendo fattori richiesti per diffusione successo ad una cellula ospite successivo 25. L. pneumophila atto a parassitare efficacemente un'ampia varietà di cellule protozoarie ed ospita pertanto un catalogo di proteine effettrici per guidare questo processo. Queste proteine effettrici si trasferiscano direttamente nel citoplasma ospite in corso di infezione da Dot / Icm secrezione di sistema di tipo IVb 16. Traslocazione di proteine Effector è necessaria, come le mutazioni che si traducono in un trasportatore difettoso abrogare completamente la crescita intracellulare in qualsiasi tipo di cellula ospite. Raritàne ed, in particolare delezioni singole proteine effettrici raramente portato al rallentamento della crescita intracellulare. Quasi 300 proteine effettrici, o quasi il 10% del genoma codifica della proteina sono state validate come Dot / Icm substrati 14,15. Diverse ipotesi sono nate per spiegare la mancanza di fenotipi osservabili per delezioni effettrici, tra cui la presenza di copie paralogous o l'acquisizione orizzontale di enzimi ortologhi dovute alla gamma ospite gamma di L. pneumophila.
Perché L. pneumophila guadagna un vantaggio patogeno quando pre-coltivate in cellule protozoarie (Figure 1A-B), abbiamo concluso che in batteri coltivate in vitro non visualizzare lo stesso profilo di espressione genica in batteri apparente in uscita l'host protozoo. Pertanto, l'espressione di particolari proteine effettrici poteva essere indotto nel contesto della crescita intracellulare in cellule protozoi. Se un effettore particolare non è stata indotta per l'expression durante la coltura in vitro, che il contributo del effettore eliminato non poteva essere efficacemente valutata in uno scenario di infezione tradizionale. Fenotipi per fattori di virulenza importanti per la creazione di infezione o diffusione solo essere rilevati nelle infezioni prolungate che hanno permesso per la cella di diffusione delle cellule. Abbiamo quindi cercato di sviluppare un saggio che poteva misurare il contributo dei fattori di virulenza potenziali nel contesto di una infezione sequenziale. Nel caso di naturale L. pneumophila acquisizione, è probabile che un ospite umano di incontrare un batterio che era stato innescato per l'infezione in una cella protozoo; dove protozoi può essere più resistente alle pratiche di trattamento delle acque tradizionali 10.
Per ottimizzare la purificazione parziale di quantità sufficienti di batteri innescate, abbiamo prima stabilito un ceppo di L. visivamente trattabile pneumophila con IPTG inducibile GFP ucantare plasmide copie trasmesse del locus GFP. Abbiamo anche generato un singolo inserimento copia cromosomica di IPTG GFP inducibile del genoma wild-type. Sebbene entrambi i ceppi reagiscono in vitro e durante l'infezione, il più alto numero di copie del plasmide-borne GFP prodotta segnale sufficiente per applicazioni a valle nel saggio. Abbiamo stabilito che l'uso di brodo di coltura L. pneumophila ad una MOI = 20 era sufficiente per infettare pesantemente A. castellanii monostrati. Diciotto ore di incubazione è stata determinata come ottimale per visualizzare grandi vacuoli fluorescenti senza raggiungere una fase di lisi della cellula ospite (Figura 1A). Monostrati protozoi non sono rispettate alla plastica di coltura cellulare, e sono quindi facilmente disturbato con fasi di lavaggio. 12-pozzetti di coltura cellulare prodotti monostrati più stabili rispetto ad altre navi (6 o 24 pozzetti, 10 portata cm). Perché L. pneumophila non può crescere in mezzo infezione utilizzato in thadescamento e passo, abbiamo scelto di abbandonare ogni fase di lavaggio per rimuovere i batteri extracellulari. Questo migliora notevolmente la resa di ameba infetto nella monostrato. Gentamicina è anche spesso usato per uccidere i batteri extracellulari. Abbiamo trovato effetti tossici protozoi a concentrazioni superiori a 25 mg / ml, e non ha trovato differenze nel numero totale di batteri recuperati dal contagio adescamento palco a 18 ore. Lisi del monostrato cellulare protozoo stata eseguita con ghiaccio freddo ultra-filtrato H 2 O, un solvente che compromette osmoticamente la cellula ospite senza danneggiare L. pneumophila. Se adattato all'uso di agenti patogeni che non sono stabili in H 2 O, 0,1% Triton X-100 in PBS può essere utilizzato per lisare le amebe con risultati simili.
Al fine di confrontare direttamente ceppo a ceppo differenze successive infezioni cellule bersaglio, un'equazione è stato generato per correlare densità ottica a 600 nm batteri con emissione di fluorescenza di GFP a 512 nm (Figure 1 *). Abbiamo scelto di utilizzare emissione di fluorescenza come mezzo per la quantificazione grazie al grande contributo di detriti cellula ospite in OD 600 misurazioni da lisati di cellule eucariotiche. Questo sfondo alto contrasto con i valori osservati trascurabili per l'emissione a 512 nm dei lisati stessi. I valori di OD 600 = 1.0 = 1x10 9 CFU / ml sono stati predeterminato per L. pneumophila, consentendo il calcolo della concentrazione batterica in un ampio intervallo di valori di fluorescenza. Molti organismi hanno stabilito valori CFU per OD 600 = 1.0, che consenta di applicare questa tecnica a qualsiasi altro patogeno attraverso la generazione di una curva di correlazione sulla base di emissione di fluorescenza. Abbiamo scelto di evitare una fase di purificazione batterica durante la lisi delle cellule protozoi per 1) massimizzare la resa dei batteri innescato disponibile per l'infezione delle cellule bersaglio e 2) minimizzare il tempo tra raccolta e successiva infezione preservare globale p espressione genicaatterns.
In vitro colta wild-type L. pneumophila è stato indotto a esprimere GFP per 18 ore con 1 mM IPTG. Diluizioni seriali di questa cultura sono stati utilizzati per le misure spettrofotometriche. Utilizzando l'equazione derivata, le infezioni delle cellule bersaglio sono stati regolarmente effettuato da variabile MOI con output uniforme. Una MOI di 10 prodotta circa 1/2 il numero totale di cellule infettate rispetto alle infezioni che hanno ricevuto una MOI di 20 (Figure 1A-B). Abbiamo testato tre host cellule bersaglio con questo saggio; A. castellanii, murini J774 macrofagi e umani PMA dissociati THP-1 macrofagi. In ogni caso, l'infezione risultante non è mai stata robusta come l'infezione priming alla stessa MOI (Figure 1C-D). Abbiamo determinato che che un ulteriore fase di lavaggio durante la fase di infezione delle cellule bersaglio, che viene eseguita per sincronizzare sia l'infezione delle cellule bersaglio e ridurre i batteri extracellulari, è responsible per questa osservazione. Tuttavia, è fondamentale che l'esperimento sia internamente controllata con un ceppo selvatico sia per la mano di fondo e di destinazione infezioni stadio cellulari. Quantità batteriche recuperati nella fase di caricamento è piuttosto limitante per successive infezioni, quindi, un solo tipo di cellula bersaglio deve essere utilizzato per esperimento.
Quantificazione della infezione cellula bersaglio è stato raggiunto utilizzando tre metodi in questo saggio. Microscopia a fluorescenza è stato utilizzato con un obiettivo 20X. Immagini di vacuoli ospitano L. pneumophila sono stati contati manualmente da diversi settori per ogni ceppo testato. Analisi citofluorimetrica fornito una misura sensibile per le differenze di cellule totali infettate, così come approssimazione del carico vacuolar, dove un segnale maggiore fluorescenza è stata correlata con il contributo di segnale GFP da un numero crescente di L. pneumophila cellule. Diluizione in piastra di serie fornito valori quantitativi per il numero totaledel volume per CFU nei campioni cellulari raccolti per citometria a flusso. Collettivamente, questi metodi consentono risultati pienamente trattabili e quantificabile in uno scenario di infezione sequenziale.
Il saggio di adescamento è molto versatile ed è adatto per l'adattamento a qualsiasi batterio patogeno che utilizza acqua dolce protozoi come l'ambiente intermedio 29,3. La scelta della cella di destinazione possono essere soddisfatte per adattarsi al percorso naturale di infezione per l'agente patogeno specifico. Soprattutto, un modello sequenziale infezione può essere usato per esaminare i ceppi mutanti che non presentano un fenotipo di crescita in un modello di infezione tradizionale utilizzando batteri in vitro in coltura. Profilatura trascrizionale nei batteri coltivati in vitro per fattori di virulenza presunti potrebbe rivelare differenze fondamentali nel profilo di espressione nel host infetto intermedio. Questo potrebbe aprire una nuova linea di ricerca per la funzione delle proteine non caratterizzate e il loro contributo al naturaleinfezione percorsi.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dott. Craig Roy e il Dr. Dario Zamboni per fornire un modello per le infezioni delle cellule protozoi. Ringraziamo il Dott. Jagdeep Obhrai, Dr. Georgiana Purdy, il Dr. Fred Heffron e Todd Wisner per le attrezzature e reagenti, il dottor Lulu Cambronne per la revisione critica del manoscritto. La citometria a flusso è stata eseguita presso l'impianto di flusso di risorse OHSU Citometria condivisa. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione della Fondazione per la Ricerca Medica dell'Oregon e una sovvenzione del NIH R21 AI088275 (EDC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | antibiotic |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| ACES | Sigma | A9758-1KG | media component |
| ATCC medium: 712 PYG | ATCC | growth media for protozoans | |
| 1X PBS | Fisher Scientific | SH30256FS | phosphate buffered saline |
| activated charcoal | Fisher Scientific | C272-212 | media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | media component |
| peptone | BD Diagnostics | 211677 | media component |
| agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | media component |
| L-cysteine, 99%+ | Acros organics | 173601000 | media supplement |
| Ferric nitrate nonahydrate | Fisher Scientific | I110-100 | media supplement |
| Equipment | |||
| EVOS fl | AMG | EVOS fl | fluorescence microscope |
| Smart Spec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | spectrophotometer |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 22627023 | bench top centrifuge |
| Repeater plus | Eppendorf | 22230201 | repeating pipette |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | microplate reader | |
| Softmax Pro 5.3 | Molecular Devices | 0200-310 | microplate reader software |
| 5424 microfuge | Eppendorf | 22620401 | table top microcentrifuge |
| Fast-release pipette pump II | Scienceware | 379111010 | pipette aid |
| FACS Calibur | BD Bioscience | flow cytometer | |
| FlowJo 7.6.1 | FlowJo | license | flow cytometery software |
| 15 ml tube | BD Falcon | 352096 | polypropylene conical tube |
| 1.6 ml microfuge tube | Neptune | 3745.X | microcentrifuge tubes |
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