Summary
Этот метод предоставляет метод для сбора, нормализации и количественного роста внутриклеточных бактериальных патогенов, которые предварительно выращивают в естественных клеток-хозяев простейших до инфекциями клеток млекопитающих. Этот метод может быть модифицирован, чтобы приспособить широкий спектр клеток-хозяев для грунтования этапе, а также типы клетки-мишени.
Abstract
Многие внутриклеточные бактериальные патогены использовать пресноводных простейших как естественный резервуар для распространения в окружающей среде. Legionella легионелл, возбудителя легионеллеза пневмонией, получает преимущество над патогенными в пробирке культурных бактерий при первом собирают из простейших клеток до заражения млекопитающих макрофагов. Это говорит о том, что важным фактором вирулентности не может быть надлежащим образом выраженного в пробирке. Мы разработали послушный системы для грунтования L. легионелл через свой естественный хозяин простейших Acanthamoeba castellanii до млекопитающих инфекции клетки. Вклад любого фактора вирулентности могут быть рассмотрены путем сравнения внутриклеточного роста мутантного штамма дикого типа бактерий, простейших после грунтования. GFP-экспрессирующих дикого типа и мутанта L. легионелл штаммы используются для заражения простейшими монослоев в грунт шагом и позволило достичь поздних стадиях внутриклеточного роста. Флуоресцентные бактерий, затем собирают из этих инфицированных клеток и нормированы спектрофотометрии для получения сопоставимого количества бактерий для последующей инфекции в млекопитающих макрофагов. Для количественного определения, живые бактерии контролируются после заражения с помощью флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии, и колонии покрытия. Этот метод выдвигает на первый план и зависит от вклада клетки-хозяина экспрессии генов путем имитации окружающей среды, которые будут встречаться в естественный путь приобретения. Этот подход может быть изменена, чтобы приспособить любую бактерию, которая использует промежуточного хозяина, как средство для получения патогенных преимущество.
Introduction
Многие патогенные бактерии приспособились обобщенных стратегий для использования клеток-хозяев для выживания и репликации внутриклеточных отсеке. Во многих случаях, патогенетические механизмы аналогичны между простейшими и многоклеточными клеток. Однако, эти два микросреды очень разные и могут привести к дифференциальной экспрессии факторов вирулентности 1-4. Болезнь легионеров бактерия Legionella легионелл является повсеместно, связанных с пресноводной среде по всему миру 5. Важно отметить, что L. легионелл выращивают в простейших клеток до заражения человеческих моноцитов получить патогенных преимущество, предполагая, что глобальные профили экспрессии генов бактерии выхода клетки простейших отличаются, чем в пробирке выращивают 6-8 организма. В природе, пресноводных амеб обеспечивают богатые питательными веществами пределы для быстрого усиления вторжения бактерий. Человека приобретении L. pneumophила наиболее часто связывают с вдыханием загрязненного капель воды, которые содержат бактерии. Вполне вероятно, что эти капли гавани простейших клеточно-ассоциированных бактерий, простейших, где клетки более устойчивы к обычной воды практик 9,10. Инфекция легких альвеолярные макрофаги доходы таким образом, практически идентична внутриклеточной жизненный цикл бактерий в простейших клеток-хозяев 11-13.
Для того чтобы выжить и размножаться в клетках эукариот, L. легионелл использует специализированный тип секреции IVb система называется Dot / ICM, чтобы доставить почти 300 «эффекторные» белков в цитоплазме клетки-хозяина 14-16. Эти эффекторные белки коллективно работать, чтобы разрушить клеточные процессы в целях получения разрешительной репликации отсек для бактерий 17,18. Удаления в любом из 26 генов, которые составляют Dot / ICM транспортера приводит к дефектных штаммов для внутриклеточных мультiplication 19-23. Исторически сложилось, что удаление отдельных эффекторных генов, кодирующих редко в результате ослабленного штамма для внутриклеточного роста. Это явление было приписано несколько гипотез, в том числе избыточных функций и паралогичных копии эффекторов.
Некоторые факторы вирулентности, только выраженная в контексте клетки-хозяина связанного внутриклеточного роста 24. Мы рационализировать, что если тот или иной эффекторных только выражается в контексте инфекции простейших, то вклад эффекторных не может быть по сравнению с штамма дикого типа, когда оба культивировали в пробирке. L. легионелл переходы от репликативной к пропускающий фазе, поскольку это входит стационарная фаза в культуре 25. Фенотип фазы переключения представляет истощение питательных веществ, возникших в ходе внутриклеточного роста и является примером по сборке жгутиков для подвижности 26. Поскольку L. легионелл более инваSIVE и опасной, когда собирают из простейших клеток, мы стремились разработать тест, который более точно представляют патогенные состояния бактерию, когда он встречается множество макрофагов.
С этой целью мы разработали универсальный тест грунтовки простейших, которые могут вместить любой подходящей принимающей как для первого (заливка ячейки) и второй (клетки-мишени) инфекции этапе. Инфекционный процесс является послушным за счет использования бактерий, стабильно экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP). Инфекции модели для простейших Acanthamoeba castellanii следует методология широко используется в области 27. Для грунтования шаг, Л. легионелл штаммы выращиваются в пробирке в стационарной фазы в жидкую среду, чтобы произвести как 'пропускающего »бактерии (рис. 1А). Бактерии следующий использовали для инфицирования монослоев A. castellanii в течение 18 часов для достижения поздней стадии внутриклеточного жизненного цикла. Большие вакуоли содержатния бактерий могут быть визуализированы в этот момент времени с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 1А). Протозойные Затем клетки лизируются и бактерии извлекают из лизатов измеряется выбросов при 512 нм с использованием флуоресценции ридере. Флуоресценции коррелирует с оптической плотности для расчета кратности-оф-инфекции (MOI) для заражения клетки-мишени (рис. 1, * Корреляция кривой). После вторжения (T 0) и 18 ч после вторжения (T 18), клетки-мишени количественно для флуоресценции, представляющих внутриклеточных бактерий. Флуоресценции можно контролировать с помощью микроскопии и проточной цитометрии и жизнеспособных микроорганизмов может быть измерена через колонию покрытия. Грунтовка анализ всегда сопровождается инфекции дикого типа L. легионелл и деформации дефекты Dot / ICM Тип IV секреторной системы (Δ DotA) (рис. 1А). Это важно обеспечивает внутренний контроль за прямое сравнение между дикого типаой любом изогенных мутантные штаммы, используемые в процессе заражения. Включение авирулентным Δ DotA напряжение во время заливки этапа устанавливает порог для наблюдения ослабленный рост фенотипы, связанные с изогенных мутантные штаммы, которые культивируются в лабораторных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Legionella культуры легионелл для инфекций Грунтовка этап
- Преобразование всех L. легионелл штаммы, используемые в анализе плазмидой pAM239, кодирующий изопропилового β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) индуцибельной зеленого флуоресцентного белка (GFP) 28. Подряд бактериальных штаммов на железо и цистеина дополнен N-(2-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновая кислота (ACES) буфером угля дрожжевой экстракт агар (CYEA), содержащий 6,25 мкг / мл хлорамфеникола (CM) (для плазмиды обслуживания) и инкубировать в течение 72 ч при 37 ° C.
- Передача посевной бактериального штамма в дополнено ACES буфер бульон дрожжевого экстракта (Ай) с 6,25 мкг / мл CM и 1 мМ IPTG и культивировать в стационарную фазу (O / N) на орбитальном шейкере при 37 ° C.
- Подтвердите GFP выражение в культурах в пробирке с помощью флуоресцентной микроскопии. Передача 10 мкл культуры на предметное стекло под крышкойскольжения и изображения, используя 60X объектив с возбуждением GFP / выбросов куба (AMG EVOS П).
- Развести в 100 мкл каждого из них в культуре пробирке до 1:10 с использованием стерильной H 2 O. Сделать пустым, используя 100 мкл AYE средствах массовой информации с 1 мМ IPTG и 6,25 мкг / мл см и воды. Возьмите OD600 измерений разведения с использованием спектрофотометра (Bio-Rad Смарт-Spec Plus). Рассчитать объем необходимых для заражения также в МВД = 20 для каждой культуры в пробирке: V = [(амебы посева) х МВД России] / [OD 600 х (коэффициент разбавления) х (постоянное)] = [(1 х 10 6 ) х (20)] / [OD 600 х (10) х (1 х 10 6)] = 2/OD 600. Концентрация бактерий определяется как OD 600 = 1,0 = 1 × 10 9 КОЕ / мл.
2. Грунтовка стадии инфекции, используя Acanthamoeba castellanii
- Поддерживать и развивать амеб в ATCC 712 PYG среду в 175 см 2 колбы при комнатной температуре.
- Заменить СМИ в амеб культурывания 24 часа до начала бактериальная жидкость культур. В тот же день жидких бактериальных культур начался сбор и подсчет клеток на световом микроскопе с помощью гемоцитометра.
- Развести амеб свежей средой до конечной концентрации 1 х 10 6 клеток / мл. Семенной 12-а культура клеток пластин с 1 мл аликвоты из амеб помощью пипетки повтор и инкубировать при комнатной температуре O / N.
- После инкубации промыть лунки 12-луночных культуре клеток пластины 3 раза с 1 мл стерильной PBS с использованием 10 мл серологической пипетки и эксплуатации помощью пипетки.
- После стремление PBS, добавить 1 мл инфекции СМИ (ATCC 712 PYG СМИ минус глюкоза, пептон и дрожжевой экстракт) с 1 мМ IPTG и 6,25 мкг / мл см в каждую лунку. Инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Infect скважин на MOI = 20. Центрифуга пластины при 400 мкг в течение 5 мин (Eppendorf 5810R) и плавать в 37 ° С водяной бане в течение 5 мин. Передача пластины на 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе в течение 18 часов.
- Подтвердите инфекции использованием изображений живых клеток на флуоресцентного микроскопа до проведения лизиса клеток и урожай бактерий.
3. Посев ТНР-1 клеток для целевой инфекции клеточной стадии
- (Начало этому процессу 24 часа до создания жидких бактериальных культур). Развивайте ТНР-1 клеток в 75 см 2 колбы с культурой почти до слияния в RPMI 1640, содержащей 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS).
- Граф суспензии клеток с помощью гемоцитометра, развести ТНР-1 клеток в RPMI 1640, с 10% FBS и 100 нг / мл форболового-12-миристат-13-ацетат (PMA) в концентрации 1 х 10 6 клеток / мл , и пластина в 1 мл аликвоты по 12-луночных культуре клеток. Инкубируйте пластины в течение 48 ч при температуре 37 ° C, 5% CO 2.
4. Обработка Бактерии для целевой инфекции клеточной стадии после заражения этап Грунтовка
- Аспирируйте средств массовой информации из загрунтовать амеб.
- Lysemoebae использованием 500 мкл ледяной, стерильные ультра-фильтром (UF) H 2 O и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Бассейн лизатов в соответствии с типом напрягаться и принимать E 512 нм измерений для каждого из объединенных лизатов использованием флуоресцентного планшет-ридера (Molecular Devices Spectramax Близнецы EM).
- Рассчитать OD 600 измерений для объединения лизатов: calcOD 600 = 0,0008 (E 512 - лизат фоне) + 0,0019. Эта формула была ранее определена путем построения графика прямое сравнение обеих OD 600 и E 512 нм измерений разведения L. легионелл дикого типа выражения GFP из стационарной фазы в пробирке культуру (рис. 1 *). Лизатов неинфицированных амебы, с учетом тех же экспериментальных условиях, зараженных амеб, которые используются в качестве пустого и при условии коррекции значения (например, лизат фоне), которая была включена в уравнение. Объем необходимых тO заразить а в МВД = 20 рассчитывается для каждого лизата бассейна: V = [(THP-1 посева) х МВД России] / [calcOD 600 х (постоянное)] = [(1 х 10 6) х (20)] / [calcOD 600 х (1 х 10 6)] = 20 / calcOD 600.
- Вымойте ТНР-1 клеток 3x с PBS и добавляют 1 мл свежей RPMI 1640 (10% FBS) в каждую лунку. Инкубируйте ТНР-1 клеток в течение 1 часа при 37 ° C, 5% CO 2.
- Infect ТНР-1 клеток при расчетной МВД использованием объединенных лизатов. Разрешить множество скважин оставаться неинфицированных, выступающей в качестве отрицательного контроля для проточной цитометрии. Обработка грунтовки этап должен быть завершен менее чем за 30 мин. Лизатов хранятся на лед, чтобы ограничить любые изменения в экспрессии генов бактериальной перед инфекцией.
- Центрифуга пластины, плавать поднять температуру, и инкубировать как в заливной этапе.
- Через час после инфекции, удалить СМИ, стремление и мыть скважин 3x с PBS для удаления внеклеточных бактерий.
- Добавить 1 мл частотыШ. RPMI 1640 (10% FBS) в скважинах и вернуть пластину в инкубатор. Время сразу после замены носителя служит нулевой момент времени (T 0). Инкубируйте ТНР-1 клеток в течение 14-16 ч при 37 ° C, 5% CO 2.
5. Экспериментальный анализ
5,1 изображений живых клеток
Изображение инфицированных скважин с помощью флуоресцентного микроскопа (AMG EVOS Флорида) на 10х или 20х увеличении (рис. 1А-D). Изображения можно сравнить качественно или количественно определить уровни инфекции в обоих стадии грунтовки и целевых инфекций клеточной стадии.
5,2 проточной цитометрии
- Выбросы пиков различных инфекций можно сравнить с помощью проточной цитометрии (BD FACS Calibur). Trypsinize инфицированных ТНР-1 клеток и аккуратно промойте их из скважины путем смешивания в PBS с помощью пипетки.
- Бассейн клеток штамма типа в 15 мл Сокол труб и гранул при 1800 мкг в течение 2мин в центрифуге столешницы.
- Приостановить гранул в 1 мл PBS и передать пробирки на 1,5 мл микроцентрифуге.
- Центрифуга суспензий при 1800 х г (Eppendorf 5424) и вновь приостановить гранул в 1 мл PBS. Если в результате суспензии очень мутная (OD 600 ≥ 1,0) они должны быть разведены в дополнительных PBS (1:3), чтобы предотвратить засорение линии в проточной цитометрии.
- Использование стерильной фильтрации PBS для уравновешивания проточной цитометрии и для промывания между образцом инъекции. Постройте вперед / стороны разброс неинфицированных клеток-мишеней до введения целевых образцы клеток инфекции.
- Соберите 20000 Всего событий, для каждого условия использования 488 нм лазерного возбуждения и канала FL1.
- Ворота после захвата клеточных популяций, чтобы исключить неинфицированных клеток и земельный участок интенсивности флуоресценции в гистограмме (FlowJo) (рис. 1E).
5,3 КОЕ покрытием
- Изучить эффективность выводаF инфекции КОЕ покрытием из клетки, собранные для проточной цитометрии. Подготовка серийные разведения образцов в ультра-фильтром H 2 O в 10 -1, 10 -2 и 10 -3.
- Пластина 20 мкл каждого разведения на 1/3 от пластины CYEA с 6,25 мкг / мл CM.
- Инкубируйте пластины при температуре 37 ° C в течение 72 часов.
- Подсчет колоний помощью зубочистки и клеточной счетчика.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Типичный результат для всего процесса инфекция указаны на рисунке 1. Жить флуоресценции клеток микрофотографии изображающие монослоев A.castellanii инфицированных дикого типа L. легионелл в грунт этап показан на рисунке 1а. Успешная мера грунтовки шаг привел бы к населению около 90% клеток-хозяев, содержащих большие вакуоли заполнены GFP меченых бактерий в этой МВД. В 18 часа после заражения, большинство A. castellanii клетки достигли максимального бактериальной нагрузки еще лизис населения минимальна. При световой микроскопии, успешного заражения грунтовки покажет округлые и отдельные амебы. Гентамицин [25 мкг / мл] могут быть добавлены в культуральной среде 30 мин до 1 ч после инфекции устранить вклад внеклеточных бактерий. Δ DotA мутантный штамм, который не может поддерживать Dot / ICM-опосредованной транслокации эффекторов, не должны расти вА. castellanii и, хотя в культуре пробирке должна светиться, а также штамма дикого типа, минимальной флуоресценции должны быть обнаружены с помощью этого штамма в 18 часа после заражения. Амебы появятся плоские и монослоя должна быть неповрежденной.
Всего лизатов укрывательстве Л. легионелл и мусора клетка-хозяин сразу же подвергаются спектрофотометрического анализа для расчета концентрации бактерий в образце. МВД может быть рассчитана с использованием корреляции кривой (рис. 1 *). Клетки-мишени должны быть готовы к инфекции, такие, что загрунтовать бактерии используются менее чем через 30 минут после лизиса, чтобы сохранить целостность профилей экспрессии генов. После заражения клетки-мишени инкубируют в течение 14-18 ч до их обработки. Флуоресценция микрофотографий на рисунке 1b продемонстрировать преимущества патогенных простейших, приобретенных грунтовка дикого типа L. легионелл в клетку-мишень стадии инфекции A. Сastellanii по сравнению с идентичным штамм, который был ограничен в пробирке до выращивания инфекции. Целевые инфекции клеточной стадии являются менее надежными, чем грунтовка этапе в связи с включением промывания 1-2 часа после заражения (клетки-мишени-зависимые). Этот шаг медиа замены удаляет неинвазивной бактерий, синхронизация инфекции и снижения фоновой флуоресценции в последующих приложений. Цифры 1С-D продемонстрировать флуоресценции микрофотографии типичный дикого типа L. легионелл двухступенчатой инфекции сценарий, где бактерии сначала загрунтовать через заражение A. castellanii, собранный из лизированных клеток простейших, количественно с помощью корреляционной кривой и использовали для заражения THP-1 макрофагов в течение 14 часов.
После микроскопии, клетки трипсином для проточной цитометрии (BD FACS Calibur). Неинфицированных клеток используются для выверки машины для вперед и в стороны разбегаются. Инфекции каждого штамма являются процессомред с 20.000 зарегистрированных событий. FlowJo 7.6.1 Программное обеспечение для анализа исходных данных. Как правило, флуоресценции (488 нм возбуждения) сначала заговор против стороне разброс для определения фоновой флуоресценции из незараженных клеточной популяции. Участки закрытого чтобы исключить это население и вновь построены в виде гистограммы от общего подсчета по сравнению с интенсивностью флуоресценции. Поскольку каждая бактериальная клетка представляет собой блок флуоресценции, интенсивность сигнала дает представление о вакуолярной нагрузки в каждой зараженной клетке. Типичный сюжет дикого типа инфекции показано на рисунке 1E. В целом, относительное число инфицированных клетках обнаруживаются проточной цитометрии ниже, чем ожидалось при сравнении с данными микроскопии. Онлайн проточной цитометрии клетки достаточно чувствителен, однако для выявления штамма отклонений.
Количественное от общего числа в КОЕ в образцах осуществляется путем генерации серийных разведений клеток подготовлены для проточной цитометрии и последующее покрытиена CYEA СМИ. Через 72 часа при 37 ° C, отдельные колонии должны быть очевидны и достаточно редкие для подсчета.
Рисунок 1. Протозойные грунтовки и клетки-мишени стадии инфекции использованием Legionella легионелл. А. дикого типа или секреции типа IV недостаточным (Δ DotA) L. легионелл штаммы индуцируют экспрессию GFP через в пробирке культуру (небольшие кадров) и используется для заражения A. castellanii монослоя в течение 18 ч при MOI = 20. Флуоресценция микрофотографии инфекции с каждым L. легионелл штамма показали (большие кадры) как слияние фазового контраста и E 512 нм флуоресцентных изображений с 20-кратным цели по флуоресцентного микроскопа (AMG EVOS П). Зеленый полумесяцы являются репрезентативными для внутриклеточных vacuolesharboriН. Л. легионелл. B. флуоресценции GFP микрофотографии 18 часов клетки-мишени стадии заражения A. castellanii дикого типа L. легионелл собирают из простейших инфекций этапе заливки (вверху) или в пробирке культурный (внизу), где MOI = 10 для каждого рассчитывается с помощью уравнения, полученные из корреляционной кривой, изображенной (синий *). Кривая была произведена с использованием серийных разведений дикого типа L. легионелл выражения GFP с 18 часов в культуре пробирке. C. флуоресценции микрофотография инфекции грунтовки стадии А. castellanii дикого типа L. легионелл, как и в (A). D. флуоресценции микрофотография 14 часов клетки-мишени стадии инфекции PMA дифференцированы THP-1 макрофагов дикого типа L. легионелл собирают из простейших инфекций этапе заливки в (С). МВД = 20 была рассчитана с помощью уравнения, полученные из соответствуюотношения кривой, изображенной (синий *). Кадре показана слияния фазового контраста и E512 нм флуоресцентные изображения, как и в (A). Е. Гистограмма участок проточной цитометрии данных по сравнению неинфицированных THP-1 макрофагов (красный) и клеток, инфицированных простейших загрунтовать дикого типа L. легионелл (зеленый). Шкала бар = 100 мкм. Нажмите, чтобы увеличить цифру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Бактериальная экспрессия гена жестко контролируется посредством сочетания жизнь цикла и ответ на сигналы в окружающей микросреде. Вакуолярной патогенов, таких как L. легионелл ответить на множество клетки-хозяина полученные сигналы, когда разобщенным в фагосомы. В коллективном результате истощения питательных в клетку-хозяина, бактерия компенсирует выразив факторов, необходимых для успешного распространения в последующем клетки-хозяина 25. L. легионелл адаптированы к эффективной паразитируют широкого спектра простейших клеток и, следовательно, таит в себе обширный каталог эффекторных белков управлять этим процессом. Эти эффекторные белки перемещаются непосредственно в цитоплазме хозяин во время инфекции Dot / ICM Тип IVb системы секреции 16. Effector транслокации белка требуется, так как мутации, которые приводят к дефектным транспортера полностью отменить внутриклеточного роста в любой тип клеток-хозяев. Антикварная вещьusly, удаление отдельных, в частности, эффекторные белки редко приводили к внутриклеточным ослабление роста. Около 300 эффекторных белков, или почти 10% генома кодирования белка были утверждены в качестве Dot / ICM субстратов 14,15. Несколько гипотез были созданы, чтобы объяснить отсутствие наблюдаемых фенотипов для эффекторных удалений, в том числе наличие паралогичных копий или горизонтальной приобретение ортологичных ферментов, в результате широкий спектр множества L. легионелл.
Поскольку L. легионелл приобретает патогенные преимущество, когда предварительно культивируют в клетках простейших (рис. 1А-B), мы рассудили, что в пробирке культурных бактерий не будет отображаться тот же профиль экспрессии генов у бактерий очевидным выходом из простейших хозяина. Таким образом, выражение частности эффекторных белков могут быть вызваны только в контексте внутриклеточного роста простейших клеток. Если конкретный эффекторных не было индуцированной для электроннойXpression во время культивирования пробирке, чем вклад удален эффекторных не могут быть эффективно оценены в традиционном сценарии инфекции. Фенотипы для важных факторов вирулентности для создания или распространения инфекции бы быть обнаружены только при длительных инфекций, которые позволили клетки к клетке распространения. Поэтому мы стремились разработать тест, который может измерять вклад потенциальных факторов вирулентности в контексте последовательной инфекции. В случае природных L. легионелл приобретения, вполне вероятно, что хозяина-человека было бы столкнуться с бактериями, которые были нацелены на инфекции в клетки простейших, где простейшие могут быть более устойчивыми к традиционным муниципальным воды практики 10.
В целях оптимизации частичной очистки достаточных количеств загрунтовать бактерий, мы сначала создали визуально послушный штамм L. легионелл использовании IPTG индуцибельной GFP ипеть плазмиды происхождения копий локус GFP. Мы также генерируется одну копию хромосомных вставки IPTG индуцибельной GFP на дикого типа генома. Хотя оба штамма светиться в пробирке и во время инфекции, тем выше число копий плазмиды происхождения GFP производится достаточный сигнал для последующего применения в анализе. Мы установили, что с помощью отвара культурного L. легионелл в МВД = 20 было достаточно, чтобы заразить сильно A. castellanii монослоев. Восемнадцать часов инкубации был определен как оптимальный для визуализации больших флуоресцентных вакуоли, не достигнув стадии лизиса клетки-хозяина (рис. 1А). Протозойные монослоев не привязаны к пластмассам культуре клеток, и, следовательно, легко нарушается со стиральной шаги. 12-луночных культуре клеток производится наиболее стабильных монослоев по сравнению с другими судами (6 или 24 и 10 см блюдо). Поскольку L. легионелл не могут расти в среде инфекция, используемых в гостадии е грунтовки, мы решили отказаться от любой стадии промывания для удаления внеклеточных бактерий. Это значительно повышает доходность зараженных амеб в монослое. Гентамицин также часто используется, чтобы убить внеклеточных бактерий. Мы обнаружили, что эффект простейших токсичности при концентрации выше 25 мкг / мл, и не обнаружили никаких различий в общем количестве бактерий оправился от инфекции всасывающей ступенью в 18 час. Лизис монослоя клетки простейших проводился с ледяной ультра-фильтром H 2 O, растворитель, который ставит под угрозу осмотически клетки-хозяина без вреда для L. легионелл. Если адаптированы для использования с патогенными микроорганизмами, которые не являются стабильными в H 2 O, 0,1% Тритон Х-100 в PBS может быть использован для лизиса амеб с аналогичными результатами.
Для того, чтобы непосредственно сравнить штамма к штамму различия в последующие инфекции клетки-мишени, уравнения была создана соотнести оптическая плотность бактерий на 600 нм с флуоресцентным излучением GFP при 512 нм (Figurэлектронной 1 *). Мы решили использовать флуоресценции в качестве средства для количественной оценки в связи с большим вкладом принимающей мусором ячейки в OD 600 измерений от эукариотических клеточных лизатов. Такой высокий фон контрастирует с незначительным значений, наблюдавшихся выбросов при 512 нм от той же лизатов. Значения OD 600 = 1,0 = 1x10 9 КОЕ / мл были предопределены для L. легионелл, что позволяет для расчета концентрации бактерий в широком диапазоне флуоресценции значения. Многие организмы создали КОЕ значения OD 600 = 1,0, что позволит применения этой техники на любой другой возбудитель через поколение корреляционной кривой на основе флуоресценции. Мы выбрали, чтобы избежать бактериальной стадии очистки во время лизиса простейших клеток для того, чтобы 1) максимизировать выход загрунтовать бактерии доступны для заражения клетки-мишени и 2) минимизировать время между сбором урожая и последующей инфекции сохранить глобальное р экспрессии геновatterns.
В пробирке культурного дикого типа L. легионелл был вынужден выразить GFP в течение 18 часов с 1 мМ IPTG. Серийные разведения этой культуры были использованы для спектрофотометрического измерения. Используя полученные уравнения, инфекции клетки-мишени были регулярно проводится при переменной МВД с последовательным выходом. МВД России от 10 производится примерно 1/2 от общего числа инфицированных клеток по сравнению с инфекциями, которые получила МВД 20 (фиг.1А-B). Мы протестировали три хозяева клетки-мишени с этим анализом; А. castellanii, мышиных макрофагов J774 и человеческого PMA-дифференцированные THP-1 макрофагов. В каждом случае, в результате инфекции никогда не был так надежен, как грунтовка инфекции в то же МВД (рис. 1С-D). Мы определили, что дополнительный шаг стирки на стадии инфекции клетки-мишени, которая выполняется как синхронизировать инфекции клетки-мишени и уменьшить внеклеточных бактерий, соответственноonsible для этого наблюдения. Тем не менее, очень важно, что эксперимент внутренне контролируется штамма дикого типа и для грунтования и целевых инфекций клеточной стадии. Бактериальные количествах обнаруживается в грунт шаг, а предельная для последующих инфекций, поэтому только один тип клетки-мишени должны быть использованы в эксперименте.
Количественное определение инфекции клетки-мишени были достигнуты с помощью трех методов в этом анализе. Люминесцентной микроскопии был использован с 20-кратным цели. Изображения вакуоли укрывательстве Л. легионелл были вручную, считая с несколькими полями для каждого штамма испытания. Проточной цитометрии анализа, чувствительная мера различия в общем клетки, инфицированные, а также приближение вакуолярной нагрузки;, где более высокий сигнал флуоресценции был связан с вкладом сигнала GFP с увеличением числа L. легионелл клеток. Серийный покрытия разведения представили количественные значения для общего количествав единице объема КОЕ в клетке образцы, собранные для проточной цитометрии. В совокупности эти методы позволяют полностью послушным и измеримых результатов в последовательном сценарий инфекции.
Грунтовка анализ является достаточно универсальным и подходит для адаптации к любым бактериальным возбудителем, который использует пресноводных простейших, как экологические промежуточного 29,3. Выбор клетки-мишени могут быть обслужены в соответствии с естественным путем инфекции для конкретного возбудителя. Важно отметить, что последовательная модель инфекции может быть использован для изучения мутантных штаммов, которые не представляют с ростом фенотипа в традиционной модели инфекции, используя в пробирке культурных бактерий. Транскрипции профилирования в пробирке культурных бактерий для предполагаемых факторов вирулентности могли бы выявить основные различия в профиле выражение в зараженных промежуточного хозяина. Это может открыть новое направление для функции охарактеризованных белков и их вклад в природнойинфекции маршрутов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим д-р Крейг Рой и доктор Дарио Zamboni за предоставление шаблона для инфекций, простейших клеток. Мы благодарим доктора Jagdeep Obhrai, доктор Джорджина Парди, доктор Фред Heffron и Тодд Wisner на оборудование и реагенты; доктор Лулу Cambronne для критического обзора рукописи. Проточной цитометрии была выполнена в цитометрии OHSU потока динамические объекта ресурса. Эта работа была частично поддержана грантом из Медицинского научно-исследовательского фонда Орегон и грант NIH R21 AI088275 (EDC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | antibiotic |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| ACES | Sigma | A9758-1KG | media component |
| ATCC medium: 712 PYG | ATCC | growth media for protozoans | |
| 1X PBS | Fisher Scientific | SH30256FS | phosphate buffered saline |
| activated charcoal | Fisher Scientific | C272-212 | media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | media component |
| peptone | BD Diagnostics | 211677 | media component |
| agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | media component |
| L-cysteine, 99%+ | Acros organics | 173601000 | media supplement |
| Ferric nitrate nonahydrate | Fisher Scientific | I110-100 | media supplement |
| Equipment | |||
| EVOS fl | AMG | EVOS fl | fluorescence microscope |
| Smart Spec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | spectrophotometer |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 22627023 | bench top centrifuge |
| Repeater plus | Eppendorf | 22230201 | repeating pipette |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | microplate reader | |
| Softmax Pro 5.3 | Molecular Devices | 0200-310 | microplate reader software |
| 5424 microfuge | Eppendorf | 22620401 | table top microcentrifuge |
| Fast-release pipette pump II | Scienceware | 379111010 | pipette aid |
| FACS Calibur | BD Bioscience | flow cytometer | |
| FlowJo 7.6.1 | FlowJo | license | flow cytometery software |
| 15 ml tube | BD Falcon | 352096 | polypropylene conical tube |
| 1.6 ml microfuge tube | Neptune | 3745.X | microcentrifuge tubes |
References
- Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues. Science. 259, 686-688 (1993).
- Mahan, M. J., et al. Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).
- Rankin, S., Isberg, R. R. Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment. Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).
- Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth. Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).
- Fields, B. S. The molecular ecology of legionellae. Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).
- Cirillo, J. D., et al. Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion. Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).
- Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages. Front Microbiol. 2, 60 (2011).
- Kilvington, S., Price, J. Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure. J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).
- King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination. Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).
- Horwitz, M. A. Formation of a novel phagosome by the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).
- Horwitz, M. A. Phagocytosis of the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil. Cell. 36, 27-33 (1984).
- Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes. J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).
- Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638 Forthcoming.
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Front Microbiol. 2, 136 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Shin, S., Roy, C. R. Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila. Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).
- Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
- Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).
- Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
- Segal, G., Shuman, H. A. Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila. Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Haghjoo, E., Galan, J. E. Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi. Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).
- Molofsky, A. B., Swanson, M. S. Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle. Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).
- Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).
- Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation. Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).
- Neild, A. L., Roy, C. R. Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation. Immunity. 18, 813-823 (2003).
- Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
- Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA. Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).
