水性二相系を用いた細胞の共培養パターニング

Summary

水性二相系が細胞のパターンを同時に複数の集団に使用されていました。セルパターニングのためのこの迅速かつ簡単な方法は、デキストランとポリエチレングリコールと2ポリマー溶液との間に存在する界面張力の水溶液の相分離を利用しています。

Abstract

、速く、使いやすく、手頃な価格であり、細胞パターニング技術は、ハイスループット細胞アッセイ、細胞間相互作用や組織工学システムを研究するためのプラットフォームの将来の発展のため必要となります。この詳細なプロトコルは、閾値濃度の上に組み合わせた相分離することデキストラン（DEX）とポリエチレングリコール（PEG）の生体適合性のソリューションを用いて細胞の共培養を生成する方法を説明します。細胞は、このメソッドを使用して、さまざまな構成でパターニングすることができる。セルの除外パターニングは、基板上にDEXの滴を印刷して、PEGを含有する細胞のソリューションでそれらをカバーすることによって行うことができる。 2ポリマー溶液との間に形成される界面張力はDEXの液滴の外側に落下してマイグレーションアッセイに使用することができる円形のクリアを形成する細胞が発生。細胞島はPEG溶液に細胞が豊富なDEXフェーズを分配することによって、またはDEXを覆うことによりパターニングすることができるPEGの溶液を用いて滴。共培養はDEX島パターニングによる細胞除外を組み合わせることによって直接形成することができる。これらの方法は、マニュアルmicropipetting含む液体処理アプローチの様々な互換性があり、実質的に任意の接着細胞タイプで使用することができます。

Introduction

水性二相系（ATPSs）互換性のない2つのポリマーの溶液は十分に高い濃度で一緒に混合される形。相分離は、ポリマー、溶液の温度、pH、および水性溶媒^、1,2のイオン含有量の分子量と極性を含む様々な要因に影響されます。 2ポリマー溶液が別々にある点は、選択された相系の物理化学的特性によって決まりますが、一般に、非変性条件下で低いポリマー濃度（20％未満の重量/重量）で発生し、ATPSsはバイオテクノロジーを使用することができるようにすることですアプリケーション^3-9。

これまでで最も広範囲に研究ATPSは、ポリエチレングリコール（PEG）/デキストラン（DEX）のシステムです。これらの安価で、生体適合性ポリマーによって形成ATPSはもともと分子ショニング^2、10を介して生体分子の精製の ​​ために記述されていた。分割相系に寄与しない付加的な分子や粒子をPEGとDEXと混合している場合に発生します。 DEXまたはPEGのどちらかのためにそれらの相対的な親和性に基づいて、分子や粒子が優先的に二つの相の一つの中に、またはインターフェイスに属します。 PEG / DEX ATPSの別のプロパティには、2つのポリマー相の間の界面張力の存在である。 PEGとDEXによって形成ATPSsは、一般的に、水と油のような他の液-液二相系よりもはるかに低い界面張力を表示していますが、界面張力軍はまだそのようなウイルスは、細胞やタンパク質凝集体²のような小さな粒子に効果を発揮^{、11月13日} 。哺乳類細胞上の任意の有害な影響は、これらの内に組み込まれた場合は最後に、塩の生理的濃度の存在下で低濃度（高分子量ポリマーの品種のための5％未満の重量/重量）で、より高い分子量のPEGとDEXが個別以来、いくつかありますシステム^{14から16。}

最近では、界面特性とATPSsのパーティショニング効果が細胞パターニング^{14、16から20}のための私達の研究室で適用されている。これは、PEGの存在下で細胞培養基板上に微細緻密なDEXのソリューションによって達成された。細胞は、PEG相に組み込まれている場合、それらは、PEG / DEX界面張力²⁰によるDEX滴に入るから除外されます。細胞はDEXのフェーズにパターニングされている場合、それらは界面張力とパーティション^16、17、19で細胞培養基板の表面に保持されます。

セルパターニングのための他の方法とは対照的に、ATPS細胞のパターニングは、学ぶことは簡単であり、唯一のポリマー自体、および細胞培養を行い、マイクロピペッターを使用する機能に関する初歩的な知識を必要とします。セルパターニングのための他の方法は、多くの場合、簡単に目に翻訳されていない特殊な機器と訓練を伴う電子生命科学。たとえば、いくつかの方法（マイクロコンタクト印刷やインクジェット印刷）間接的に続いて細胞接着^21,22のための部位としての役割を果たす培養基質への細胞接着性生体分子のパターンを適用することにより、パターンセル。間接的なアプローチには、いくつかの細胞型のために有用であるが、それらはユーザスキルとパターニングツールを製作するための特殊な装置の高度を必要とし、特定の細胞型/生体分子のパターンに応じて特異性を欠くことができます。あるいは、細胞を層流パターニング、ステンシルやインクジェット印刷^{23から26を}含むダイレクトパターニングのアプローチの方法によって高いパターン特異性で成膜することができる。しかしながら、これらの技術はまた、ユーザーの専門知識と特殊な装置を必要とし、印刷処理中に細胞を損傷することがあります。これらのアプローチは一般に、細胞パターニングのための生命科学分野の有用なツールであることが、細胞の正確なパターンを生成するが、それは費用対効果がなければなりません実装が簡単でND。

ここで我々は、以前に公開された出願に記載されてATPSsを用いてパターン化培養細胞を生成するための詳細なプロトコルを報告している。 micropipettorsのみを使用して、ユーザーは移動アッセイのための細胞除外ゾーンまたはセルの島を生成することができます。これはどちらかDEX期における細胞を保持またはDEXからのPEG相に堆積セルを除外PEG / DEX界面張力の方法によって達成される。これら2つの基本的なパターニング技術を組み合わせることによって、それは急速にそのような肝臓の線維芽細胞の共培養などの細胞の共培養を生成することが可能である。パターニング方法、ATPSパラメータと期待される結果を詳細に説明されています。

Protocol

1。位相システムの特性解析：相分離のための決定しきい値目的のバッファまたは細胞培養培地15 mlまたは50 mlコニカルチューブに図1（紫ドット）に示すようにPEGとDEXを含む溶液を調製します。以下、PEGとDEXは35 kDaのPEGおよび500kDaのDEXを参照しますが、臨界濃度は、使用される2つのポリマーに応じて変化します。各溶液中のPEGとDEXの質量を記録する。高濃度ポリマー溶液?…

Representative Results

セルパターニングのためのPEGとDEXの適切な組み合わせを選択するには、それはbinodal曲線を決定することが重要です。この曲線はATPSが形成でき、温度、pHおよびイオン内容に基づいて、ポリマーの特定のセットで異なる場合がありますする点を区別します。カスタマイズされた培地の処方を必要とする細胞を培養するためには、実験的にbinodal曲線を決定する必要があるかもしれません。これ?…

Discussion

ATPSセルの微細化方法は、細胞培養技術における習熟度を超えて非常に少ない専門知識を必要とし、速やかに習得することができます。このアプローチの利点は、それが、安価で迅速かつ細胞型および文化の様々なフォーマットと互換性があることです。これらの理由から、我々のプロトコルは、簡単に、特に生命科学、細胞の増殖、遊走および走化性、および細胞集団の間でjuxtacrineおよび?…

Materials

Reagent	Manufacturer
Dextran 500,000 kDa	Pharmacosmos, Denmark
Polyethylene Glycol 35,000 kDa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela	ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A	ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3	ATCC, Manassas, VA
Cell Tracker	Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM	Gibco, Carlsbad, CA
RPMI	Gibco, Carlsbad, CA
F12	Gibco, Carlsbad, CA
Fetal Bovine Serum	Gibco, Carlsbad, CA