Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Sulu İki fazlı sistemler kullanma Hücre Co-kültür desenlendirme

doi: 10.3791/50304 Published: March 26, 2013

Summary

Sulu de iki fazlı sistemlerde hücrelerin aynı anda birden fazla kalıp popülasyonları için kullanılmıştır. Hücre desenlendirme için bu hızlı ve kolay bir yöntem dekstran ve polietilen glikol ve iki polimer çözümleri arasında var arayüzey gerilimi sulu çözeltilerinin faz ayrışması yararlanır.

Abstract

Hızlı, kullanımı kolay ve uygun fiyatlı Hücre desenlendirme teknolojileri hücre-hücre etkileşimleri ve doku mühendislik sistemlerini incelemek için yüksek verimlilik hücresi tayinlerinde, platformların gelecekteki gelişimi için gerekli olacaktır. Bu ayrıntılı protokol eşik konsantrasyonu yukarıda kombine faz ayrı zaman ki dekstran (DEX) ve polietilen glikol (PEG) solüsyonları kullanılarak biyo-uyumlu hücre eş-kültür üretmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Hücreler bu yöntem kullanılarak çeşitli konfigürasyonlarda da desenli olabilir. Hücre dışlama modelleme bir alt tabaka üzerinde damlacıkların DEX baskı ve PEG içeren bir hücre, bir solüsyon ile kaplanması ile uygulanabilir. İki polimer çözeltileri arasında oluşan ara yüzey gerilimi DEX damlacık dış çevresinde düşme ve geçiş deneyleri için kullanılan bir dairesel açıklığa oluşturmak için hücreler neden olur. Hücre adalar PEG çözeltisi içine hücreden zengin DEX fazlı dağıtım veya DEX örterek desenli olabilirPEG çözeltisi ile damlacık. Eş-kültür DEX ada modelleme ile hücre çıkarma birleştirilmesi ile direkt olarak oluşturulabilir. Bu yöntemler, manuel micropipetting içeren sıvı işleme yaklaşımı, bir dizi ile uyumlu olan, ve hemen hemen herhangi bir yapışkan ile hücre tipi kullanılabilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Iki uyuşmayan polimerlerin çözeltileri yeterince yüksek konsantrasyonlarda karıştırılır Sulu iki fazlı sistemler (ATPSs) oluşturur. Faz ayırma molekül ağırlığı ve polarite polimerlerin, çözeltiler, pH ve sulu çözücü 1, 2, iyonik içeriğinin ısısı içeren çeşitli faktörler tarafından etkilenmektedir. Ayrı iki polimer çözeltileri seçilmiş fazlı bir sistemin fizyokimyasal özellikler ile belirlenmiştir, fakat hangi nokta genellikle ATPSs biyoteknolojide kullanılan izin vererek, denatüre edici olmayan koşullar altında düşük bir polimer konsantrasyonu (% 20 den az ağırlık / ağırlık) gerçekleşir uygulamalar 3-9.

Bugüne kadar en çok çalışılan ATP polietilen glikol (PEG) / dekstran (DEX) sistemidir. Bu pahalı olmayan ve biyolojik olarak uyumlu polimerler ile oluşturduğu ATP aslen moleküler bölümleme 2, 10 yolu ile biyomoleküllerin arıtma için tarif edilmiştir. Bölümlemefazlı sistemde katkıda olmayan ek moleküllerin veya parçacıkların PEG ve DEX ile karışık oluşur. DEX veya PEG ya da onların ilgili yakınlığa göre, moleküller veya parçacıklar tercihen iki faz biri içinde ya da ara yüzeyde yer alacaktır. PEG / DEX ATP diğer bir özelliği iki polimer fazlar arasındaki arayüzey gerilimi varlığıdır. PEG ve DEX oluşturduğu ATPSs genellikle yağ ve su gibi diğer sıvı-sıvı iki fazlı sistemlerde çok daha düşüktür arayüzey gerilimleri görüntüleyebilir, ancak arayüzey gerilimi kuvvetler hala, virüsler, hücre ve protein agrega 2 gibi küçük parçacıklar üzerinde etkileri bulunmaktadır , 11-13. Memeli hücreleri üzerinde herhangi bir zararlı etkilerini bu sahasına dahil Son olarak, yüksek bir moleküler ağırlık PEG ve DEX tuzlarının fizyolojik konsantrasyonlarının varlığında, düşük konsantrasyonlarda (% 5'inden az ağ / yüksek moleküler ağırlıklı polimerler çeşitleri için ağırlık) olarak ayrı bir yana, azdır sistemleri14-16.

Son zamanlarda, arayüzey özellikleri ve ATPSs bölümleme etkileri hücre desenlendirme 14, 16-20 için laboratuvar tarafından uygulanmıştır. Bu micropatterning, PEG varlığında, hücre kültürü yüzeyler üzerinde daha yoğun bir DEX çözelti gerçekleştirildi. Hücrelerin PEG fazına dahil edildiğinde, PEG / DEX arayüzey gerilimi 20 nedeniyle DEX damlacıkları girdikten dışındadır. Hücreler DEX faz olarak desenli, bunlar ara yüzey gerilimi ve bölümleme 16, 17, 19 ile hücre kültür substrat yüzeyine tutulur.

Hücre desenlendirme için diğer yöntemlerden farklı olarak, ATP hücre desenlendirme öğrenmesi kolay ve sadece polimerler kendilerini ve hücre kültürü gerçekleştirmek ve bir mikropipet kullanma yeteneği hakkında temel bilgi gerektirir. Hücre desenlendirme için diğer yöntemler genellikle kolayca inci tercüme edilmediyse özel ekipman ve eğitim gerektirire yaşam bilimleri. Örneğin, bazı yöntemler (mikrokontak baskı veya mürekkep püskürtmeli baskı) dolaylı sonradan hücre eki 21, 22 siteler olarak hizmet kültürü substrat hücre yapışkan biyomoleküllerin desenler uygulayarak desen hücreleri. Dolaylı yaklaşım, bazı hücre türleri için yararlı olmalarına rağmen, kullanıcı beceri ve modelleme araç imal etmek için özel ekipman yüksek derecede gerektirir, ve belirli hücre tipi / biyomolekül desenine bağlı olarak seçicilik eksikliği olabilir. Alternatif olarak, hücre laminer akış desenlendirme, neticede ve inkjet baskı 23-26 içeren doğrudan desenlendirme yaklaşımlar yoluyla yüksek desen özgüllük tevdi edilebilir. Ancak, bu teknikler aynı zamanda kullanıcı uzmanlık ve özel ekipman gerektiren ve yazdırma işlemi sırasında hücreler zarar verebilir. Bu yaklaşımlar genellikle yaşam bilimleri yararlı bir araç olarak hücre desenlendirme için hücreler, hassas desenleri üretmek olsa da, maliyeti etkili olmalıuygulamak basit nd.

Burada, daha önce yayınlanmış başvurular içerisinde açıklanmaktadır ATPSs kullanılarak desenli bir hücre kültürü üretmek için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Sadece Mikropipetler kullanarak, kullanıcılar göç deneyleri için hücre dışlama bölgeler veya hücre adaları üretebilir. Bu, ya DEX fazındaki hücrelerin korur veya DEX dan PEG faz içinde depolanmıştır hücreleri hariç PEG / DEX ara yüzey gerilimi yolu ile elde edilir. Bu iki temel modelleme teknikleri tarama olarak, bu hızla, karaciğer-fibroblast hücre ko-kültürler olarak hücrelerinin ko-kültürü üretmek mümkündür. Modelleme yöntemleri, ATP parametreleri ve beklenen sonuçlara ayrıntılı olarak tarif edilmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Faz Sistemi Karakterizasyonu: Faz Ayırma için belirlenmesi Eşikleri

  1. Istenilen tampon ya da hücre kültür aracı maddesi 15 ml, 50 ml konik bir tüp içinde Şekil 1 (mor nokta) 'de gösterildiği gibi, PEG ve DEX içeren solüsyonlar hazırlayın. Ahiret, PEG ve DEX 35 kDa PEG ve 500 kDa DEX sevk edecektir, ancak kritik konsantrasyonlarda kullanılan iki polimer bağlı olarak değişecektir. Her bir çözelti, PEG ve DEX kütle kaydedin. Yüksek konsantrasyonda polimer çözeltilerinin çözünmesi için birkaç saat sürebilir. Vorteks serumsuz çözümler için de kullanılabilir. Hem polimerler tamamen çözülene kadar protein veya serum içeren medya için bir sallanan sahnede tüpleri yerleştirin. Polimerlerin çözünmesi ve başlangıç ​​konsantrasyonları dikkat çekmek için kullanılan ortam ağırlığını kaydedin.
  2. Polimerler tamamen çözülür sonra, çözümleri bulutlu görünmelidir. Bu faz ayrışması meydana geldiğini ilk belirtisidir. Bunu doğrulamak için izinpolimer çözeltileri, 20 dakika için oda sıcaklığında, bir dikey konumda hareketsiz. 1,000 x g'de santrifüj faz ayırma işlemi hızlandırmak için kullanılabilir. Yoğun alt faz DEX-zengin olacak ve üst faz PEG-zengin olacak.
  3. Yavaşça tüpler için ek tampon veya ortam ekleyin. Küçük artışlarla aşmamak faz ayırma noktasına kadar kullanılmalıdır.
  4. Çözüm açık olur ve artık santrifüj sonra faz ayrımı için eşik ulaşılmıştır faz ayıran zaman. Tüpün son ağırlık kaydedin.
  5. Ortam eklendikten sonra faz ayrılması artık meydana geldiği her iki polimer ağ / ağ% belirlemek nihai ağırlık ile birlikte, polimerler için önceki kayıtlı ağırlıkları kullanılması.
  6. Bu değerler Konu x-ekseni üzerinde y-ekseni ve ağ / ağ% DEX üzerinde ağ / ağ% PEG. Binodal eğri olarak bilinen bu arsa, farklı konsantrasyon derecesinden için faz ayırma için eşik konsantrasyonu belirlemek için kullanılabilirlerBelirli bir hücre kültürü ortamında PEG / DEX ons.

2. Konfigürasyon 1: Dışlama desenlendirme (96-Plaka Biçimi)

  1. % 5.0 'hücre kültürü aracı maddesi içinde ağırlık / ağırlık PEG ve% 12.8 wt / wt DEX ayrı çözümler hazırlayın. Polimerleri birbirine göre dengelenmesi sonra bir ATP kalmasını sağlamak için en az iki kat kritik nokta ATP çözümleri kullanın. PEG-zengin faz ve bunun tersi içine DEX akı az miktarda bulunmaktadır, bu nedenle, kritik noktanın altındaki konsantrasyonlarda damla olarak fazlı bir sistemin kaybına neden olabilir kritik konsantrasyon çok yakın çalışma. Benzer şekilde, bir nem ve sıcaklık kontrollü bir kuluçka makinesi için hücre kültürü çanağı aktarma iki faz özelliklerinin değişmesine neden olur ve iki çözüm karıştırılabilir yapabilir. Not: Bazı hücrelerde diğer ATP formülasyonları ile daha iyi performans gösterebilir. Kabul edilebilir formülasyonlar Bölüm 1 ile belirlenen binodal eğrilerine göre seçilebilir.
  2. Dışlama patte için kullanılacak hücreler hasatrning. Mevcut hücrelerinin toplam sayısı / konsantrasyonunu belirleyin. İsteğe bağlı: CellTracker veya floresan mikroskobu için diğer non-sitotoksik etiketleri hücrelerin etiket.
  3. Pelet% 5.0 uygun bir hacim içinde hücreler ve pelet tekrar süspansiyon dışlama hücrelerin arzu edilen sayıda elde etmek için PEG. Örneğin, bir 96-kuyulu plakanın da bir 37,500 fibroblast hücreleri, ertesi gün kesişme noktası oluşturmak için PEG 200 ul içinde tekrar süspanse edilir olması gerekir. Diğer hücre türleri ve kültür substrat boyutları uygun olarak aşağıdaki numaraları Scale.
  4. Bir mikropipet kullanılarak, bir kuru hücre kültüründe bir alt tabaka üzerine DEX 0.5 ul damlacıkları dağıtın. Büyük hacimli damlacıkları büyük dışlama bölgeleri üretmek. 0.1 1 ul büyüklüğü arasında değişen damlacıklar dışlama micropatterning için tavsiye edilir. İsteğe bağlı: DEX damlacıkların vaktinden önce 24 saat çökelmiş ve oda sıcaklığında kurutmak için izin verilebilir. Bu temizleyici desenler üretebilir.
  5. T içine PEG hücre süspansiyonu 200 ul dağıtıno iyi DEX damlacıkları kapsayacak.
  6. 37. az 12 saat boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi ° C,% 5 CO2 içinde yerleştirin. Çanak elleçleme sırasında ve desenleri bozmamak için bir seviye inkübatör rafa yerleştirilen bu eğik olmadığından emin olun.
  7. PEG çözüm çıkarın ve kültür ortamı 200 ul ile üç kez yıkayın.
  8. Taze kültür ortamı ve inkübatör dönmek ekleyin.
  9. Yasak bölge içine hücre hareketi gözlemlemek için periyodik kültürler izleyin.

3. Yapılandırma 2: Island desenlendirme (96-Plaka Biçimi)

  1. % 5.0 üstünde olduğu gibi hücre kültür ortamı içinde ağırlık / ağırlık PEG ve% 12.8 wt / wt DEX çözeltiler hazırlanır.
  2. Ada modelleme için kullanılacak hücreler hasat etmek. Mevcut hücrelerinin toplam sayısı / konsantrasyonunu belirleyin.
  3. % 12.8 DEX uygun bir hacim içinde ve Pelet tekrar süspansiyon hücreleri ada modelleme için hücrelerin istenen bir konsantrasyon elde etmek için. 5.000 ce konsantrasyonlarılls / ul veya daha az kuvvetle yapışık hücre tipleri için tavsiye edilir. Için zorluk bağlamadan veya gevşek bir şekilde bağlı olan hücreler vardır hücreleri, 10,000 hücre / ml 'ye kadar konsantrasyonlarda olarak kabul edilebilir.
  4. Yukarıda anlatıldığı gibi, bir kuru hücre kültür alt tabaka üzerine DEX pipet 0.5 ul damlacıkları kurumasını önlemek için hızlı bir şekilde çalışmak. Damlacıkları kurumasına izin vermeyin. İsteğe: PEG çözeltisi 200 ul vaktinden önce oyuğa ilave edilebilir. DEX damlacıkları sonra dibine çöker ve kültür yüzeyi ile temas edecek PEG çözüm içine tevdi edilebilir. Bu temizleyici ada desenler üretebilir.
  5. PEG 200 ul DEX damlacıkları örtün.
  6. 37. az 12 saat boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi ° C,% 5 CO2 içinde yerleştirin. Çanak elleçleme sırasında ve desenleri bozmamak için bir seviye inkübatör rafa yerleştirilen bu eğik olmadığından emin olun.
  7. PEG çözüm çıkarın ve kültür ortamı 200 ul ile üç kez yıkayın.
  8. Taze kültür ekleorta ve inkübatör dönmek.
  9. Adalardan hücre hareketi ve proliferasyonu dışa gözlemlemek için periyodik kültürler izleyin.

4. Yapılandırma 3: Dışlama Co-kültürlerin (96-Plaka Biçimi)

  1. % 5.0 üstünde olduğu gibi hücre kültür ortamı içinde ağırlık / ağırlık PEG ve% 12.8 wt / wt DEX çözeltiler hazırlanır.
  2. Dışlama ve ada modelleme için kullanılacak hücreler hasat etmek. Her bir hücre tipi için mevcut hücrelerin toplam sayısını / konsantrasyonu tayin edilir. İsteğe Bağlı: Bazı cep eşlendirme ölçüde farklı proliferasyon indeksleri görüntüleyebilir. Ada desenli hücrelerin (özellikle uzun süreli kültürler için) overpopulating dan hücre dışı önlemek için 2 saat süreyle mitomisin C ile çıkarılması için kullanılan hücreler hasat tedavi etmek ya da daha önce onları ışın. Bu çoğalmasını önler. Floresan boya CellTracker gerekirse iki hücre popülasyonu ayırt etmek için kullanılabilir.
  3. Pelet exclusio için hücreleri ve pelet tekrar süspansiyonN% 5.0 PEG uygun bir hacim içinde modelleme yukarıda belirtildiği gibi, hücre istenilen sayıda elde etmek için. Yukarıda olduğu gibi, hücreler, istenen konsantrasyon elde etmek için% 12.8 DEX uygun bir hacim içinde ada desenleme için pelet yeniden süspanse edin.
  4. Bir mikropipet kullanılarak, bir kuru hücre kültüründe bir alt tabaka üzerine DEX hücre süspansiyonunun 0.5 ul damlacıkları dağıtın. Damlacıkları kurumasına izin vermeyin.
  5. PEG hücre süspansiyonu 200 ul ile DEX damlacıklar kaplayın.
  6. 37. az 12 saat boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi ° C,% 5 CO2 içinde yerleştirin. Çanak elleçleme sırasında ve desenleri bozmamak için bir seviye inkübatör rafa yerleştirilen bu eğik olmadığından emin olun.
  7. PEG çözüm çıkarın ve kültür ortamı 200 ul üç kez yıkayın.
  8. Taze kültür ortamı ve inkübatör dönmek ekleyin.
  9. Hücre popülasyonları arasındaki etkileşimi gözlemlemek için co-kültürler izleyin. İsteğe bağlı: Kontroller dışlama veya ada desenlendirme indiv gerçekleştirerek hazırlanabiliridually, etkileşmeyen ko-kültür hücreleri veya dokusunda önce ya da sonra bir ya da her iki hücre popülasyonlarının ilgi yollar engelleyerek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hücre desenlendirme için PEG ve DEX uygun bir kombinasyonu seçmek için bu binodal eğrisi belirlemek için önemlidir. Bu eğri bir ATP oluşabilir ve sıcaklık, pH ve iyonik polimer içeriğine göre verilen bir grubu için farklı olabilir hangi noktaları çizer. Özelleştirilmiş orta formüller gerektirmektedir hücreleri kültür için deneysel olarak binodal eğrisi belirlemek için gerekli olabilir. Bu kadar binodal ve PEG ve DEX içeriği arasında değişen (Şekil 1, mor daireler) elde edildi ATPSs bir dizi üreten gerçekleştirilir. Bir ATP mevcut olduğunda, polimer çözeltileri karıştırıldığında bulanık görünür ve rahatsız eğer sol ayrı evreye denge olacak. Polimer karışımı ilave çözücü ekleyerek, ATP 0% PEG / 0% DEX yaklaşım olacaktır. Bir noktada, karışım artık ayrı bir aşama olacaktır. Bu durumda hangi PEG / DEX konsantrasyon binodal eğri üzerinde bir nokta temsil eder; AT bu noktada yukarıdaPS oluşabilir ve bu noktanın altında olamaz. Şekil 1 'de eğrileri ile ve% 10 fetal bovin serumu (FBS) olmaksızın genel olarak üç hücre kültür ortamı için binodals temsil eder. Bir ATP oluşan edildiği FBS konsantrasyonları varlığında biraz daha yüksektir.

Daha önceki raporlarda, kritik bir noktadır (binodal noktayı hangi alışım PEG ve DEX formun eşit hacimlerde) 2.5% PEG 35 kDa/3.2% DEX 500 kDa. Dayalı ATPSs kullanılan Bizim binodal verilerden sonuçlar bu kritik nokta değeri yakın bulunmaktadır. Tablo 1'de görüldüğü gibi, desenlendirme için dokuz fazlı sistem kombinasyonları test. Bunlar kombine edilmektedir sonra PEG ve DEX saf polimer çözeltilerinin konsantrasyonlarına göre dengelenmesi için, bu çözümlerden bir kararlı ATPSs oluştururlar ve bu nedenle modelleme (Tablo 1a, x işareti) için kullanışlı olmayan yoktu. Diğer polimer kombinasyonları tanınabilir desenleri ürettiAncak deney için yeterli üniforma değildi (Tablo 1a x / ✓ işaretleri). Faydalı polimer formülasyonları dışlama bölge veya olmayan desenli bölgeleri (Tablo 1a, ✓ işaretleri) hücrelerin neredeyse yoksun idi adalar oluşur.

% 10 PEG ile, hücre kültürü yüzeyi (Tablo 1b, x işaretleri) takmak için bir güçlük görüntüleme ile, bu hücre morfolojisi anormal yuvarlak idi ve 24 saat sonra iğ gibi fark ettim. Morfoloji ve eki% 2.5 ve% 5 PEG (Tablo 1b, ✓ işaretleri) için normaldi. Biz% 10 PEG anormal hücre morfolojisi ve eki serum erişim ile ilgili sorunlar ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir, yüksek PEG konsantrasyonları (Tablo 1c, x işaretleri) de kültür ortamından serum çöktürülmüş görülmektedir. Buna ek olarak, PEG plazma zarları 27 bozmak için bilinmektedir. Bu etkiler sadece düşük mol yüksek konsantrasyonda gözlemlenmiştir olmasına rağmenecular ağırlık PEG, güvenilir desenlendirme ürettiği düşük PEG konsantrasyonu kullanmak en iyisidir.

Bizim önceki raporlar ile uyumlu olarak, biz% 5 PEG/6.4% DEX ve% 5 PEG/12.8% DEX de% 12.8 DEX daha düzgün desen üreten, hücre desenlendirme için uygun olduğu sonucuna varmıştır. Hücre kullanılarak, üç modelleme biçimleri için beklenen sonuç Tracker-etiketli HeLa hücreleri, Şekil 2'de gösterilmiştir. Her bir modelleme yaklaşım izleyerek, bu desenli alanların dışında çok az hücreleri ile, her tür üniform desenler oluşturmak mümkündür.

Dışlanma ve ada desenlendirme kullanarak desenli hücrelerinin çoğalması ve göç (Şekil 3) değerlendirmek mümkündür. Üç gün boyunca, HeLa hücreleri dışlama bölgeleri (Şekil 3a-c) doldurdu. Island-desenli hücrelerin başlangıç ​​desenleri (Şekil 3d-f) dışarıya doğru genişletti. Bu değişiklikler kullanılarak belirlenebilirStandart ImageJ ölçme araçları (Şekil 3 c, f). Birden fazla hücre popülasyonları co-kültürlü olduğunda (Şekil 2, Format 3), bir hücre popülasyonu üzerinden-prolifere olabilir unutmayın ve diğer değiştirmek için önemlidir. Dışlama desenlendirme ve ada desenlendirme bu bir sorun olması durumunda değerlendirmek için yararlı bir araç olabilir. Proliferasyon indeksi dramatik farklar ortaya durumlarda, bir hücre popülasyonun çoğalmasını önlemek için radyasyon veya kimyasal faktörler tarafından tedavi edilmesi önerilir. Bu, belirli bir hücre tipinin daha yavaş büyüyen daha hassas hücre tipi için hücre bir destek olarak kullanılan durumlarda yararlıdır.

Bu kültürleme HepG2 hücreleri, yaygın olarak mitomisin C (Şekil 4) kullanılarak tutuklandı NIH 3T3 fibroblastların ile, örnek hepatosit biyoloji etmek için kullanılan bir hepatoselüler karsinoma hücre hattı ile bu prensip gösterdi. Zamanla, HepG2 hücreleri kendi yerelleştirme korumakd koloni şekil (Şekil 4a). Aynı plaka birçok damlacıkları yerleştirerek ve fibroblast ile onları çevreleyen tarafından çoğaltılmış çalışmaları (Şekil 4b) için potansiyel olarak yararlı bir biçimde bu hücrelerin büyümesi mümkündür. Hücre ada monokültürler parakrin faktörleri (Şekil 4c) etkisi için bir kontrol olarak bu biçimde kullanılabilir.

Şekil 1
Şekil 1. Bir ATP oluşturabilir hangi polimer konsantrasyonu deneysel olarak tespit binodal eğrileri yola çıkılarak edilebilir. Bu binodal eğri hangi değişen PEG / DEX konsantrasyonları ile iki fazlı bir karışım (mor noktalarına ölçmek için ek çözücü eklenerek bulut noktası yöntemi kullanılarak inşa edildi çevreler) artık faz separati kabil edilding. Binodals ve serumsuz DMEM, F12 ve RPMI belirlenmiştir. Veri noktaları üç parametre rasyonel fonksiyonu ile donatılmış. Her veri noktası için N = 3.

Şekil 2,
Şekil 2. Polistiren plakaları üzerine ATP çözümler dağıtıcı olarak, hücre modelleme için üç biçimde imal edilebilir. Prosedür DEX damlacıkları a)) ve ardından PEG B ile kaplanır ki pipetleme ile başlar. Hücreler takmak sonra, ATP çözüm uzak yıkandı ve kültür ortamı (c, d) ile değiştirilebilir. Monokültürler için Floresans görüntüleri desenlendirme sonra CellTracker boyalarla boyandı. Co-kültürler için, hücreleri desenlendirme önce CellTracker boyalar ayrı boyandı. HeLa hücreleri, üç kültür biçimlerini üretmek için kullanıldı. Şekil 3
Şekil 3,. Dışlama desenlendirme ve ada desenlendirme hücre migrasyonu ve proliferasyonu değerlendirmek için kullanılabilir. A) Dışlama desenli HeLa hücreleri desenlendirme 1 gün sonra. B) Dışlama desenli HeLa hücreleri desenlendirme 3 gün sonra. C) Hücreler çoğalmaya başlar ve göç, önemli ölçüde boyutunu azaltarak yasak bölge. d) Adası desenli HeLa hücreleri desenlendirme 1 gün sonra e.) Adası desenli HeLa hücreleri 3 gün desenlendirme sonra. f) Hücreler anlamlı adanın boyutunu genişleterek, çoğalırlar ve dışa göç. Görüntüleri göç öncesi ve sonrası hücre takas ve hücre ada alanları ölçmek için ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü. Barlar demek temsil± en az üç bağımsız gözlemler SEM.

Şekil 4,
Şekil 4'e. Karaciğer hücre / fibroblast kültürlerinde ATP dışlama ko-kültür desenlendirme kullanılarak oluşturulabilir. A) Bu koloniler kültüründe en az 4 gün boyunca kendi organizasyonu sürdürmek. B) Birden adalar çoğaltılmış veya yüksek-throughput için potansiyeli olan bir tek tabak içinde dizilmiş olabilir deneyleri. c) non-ko-kültür adası desenleri ile karşılaştırıldığında, ko-kültür hücreleri albümin co-kültürler lekeli karşı monokültürler niteliksel karşılaştırma itibaren belirgin olarak albumin üretiminin biraz daha yüksek seviyelerde (kahverengi boyanma) görüntüler. Albumin karaciğer hücreleri tarafından üretilen bir proteindir. Bu nedenle, bu sonuç, ATP kullanılarak fibroblast ile birlikte kültive zaman karaciğer hücrelerinin fonksiyonunun gelişmiş olduğunu göstermektedir.

a) Desen Formed DEX 3.2% DEX 6.4% DEX% 12.8
PEG 2,5% x x x
PEG 5,0% x / ✓
PEG% 10.0 x / ✓
b) Morfoloji DEX 3.2% DEX 6.4% DEX% 12.8
PEG 2,5%
PEG 5,0% & # X2713;
PEG% 10.0 x x x
c) Serum Yağış DEX 3.2% DEX 6.4% DEX% 12.8
PEG 2,5%
PEG 5,0%
PEG% 10.0 x x x

Tablo 1. Modelleme için kullanılan a) ATP formülasyonlar kontrol işareti, x işareti ile gösterilir edemeyen ile gösterilir. B) normal hücre morfolojisi ve bağlanma özelliklerini muhafaza formülasyonlar b gösteriliry Onay işaretlerini x işaretleri ile gösterilir edemeyen. c) Formülasyonlar serum proteinlerinin yağış sonuçlandı x işaretleri ile gösterilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ATP hücre micropatterning yöntemi hücre kültürü teknikleri yeterlik ötesinde çok az uzmanlık gerektiren ve hızlı bir şekilde hakim olabilir. Bu yaklaşımın avantajı, ucuz ve hızlı hücre kültürü türleri ve çeşitli biçimlerde ile uyumlu olmasıdır. Bu nedenlerden dolayı, bizim protokol kolayca özellikle yaşam bilim adamları, hücre çoğalması, göç ve kemotaksis, ve hücre popülasyonları arasındaki juxtacrine ve parakrin etkileşim etkisini araştıran kişiler tarafından kabul edilmelidir. Burada sunulan analizler kolayca bu ImageJ gibi yazılım mevcut standart görüntü analizi prosedürleri kullanarak hücre popülasyonu düzeyde belirlenebilir.

Tutarlı desenleri oluşturmak için biz aşağıdaki önlemleri tavsiye ediyoruz. Her DEX damlacık daha tutarlı damlacık hacimleri sağlamak yatırılır sonra ilk, DEX solüsyonu dağıtmak için kullanılan pipet ucu değiştirilmelidir. DEX çözümü nispeten viskoz olduğuBu pipet ucu kısmının dış yüzeyi üzerinde mevcut olabilir ve bu DEX çıkar tüm hacmi uç sağlamak için ilave DEX yatırma önlemek için de önemlidir. PEG çok güçlü bir şekilde ilave edilir ise ya da çanak hareket ettirildiğinde, İkinci olarak, damlacıklar hareket edebilir. DEX kesintileri bir yüzeyde çanak tutmak ve PEG çözüm giderek damlacık parçası çıkarmak için PEG menisküs gelen büyük güçleri izin vermeden yukarıdaki damlacıkları kapsayacak sağlayarak minimize edilebilir. Damlacık kesintileri büyük DEX damlacıkları ile daha sık oluşur, bu nedenle eğer mümkünse damlacıkları ul 0.5 veya daha az kullanılmalıdır. Apart çözümleri dağıtma ile ilgili bu teknik konular dışında, bu teknik ile ilişkili çok az tuzaklar uygun polimer molekül ağırlıkları ve konsantrasyonları kullanılır koşuluyla vardır.

ATP desenlendirme kolayca mikropipet (burada sunulan) kullanılarak yapılabilir rağmen, daha sophi çeşitli vardırhızla daha karmaşık geometrik diziler (örneğin, sıvı taşıma robot ve akustik damlacık püskürtme) desenleri üretmek için kullanılabilir sticated yaklaşımlar, bizim daha önceki çalışmalarda olduğu gibi, 14, 15, 20 olarak sunulmuştur. Bu kılcal deliklerinin içinden ya da PEG 19 tarafından kaplanır akan DEX damlacıkları üretmek için bir mikrokanal içinde bir delik ile pnömatik olarak harekete çıkarma DEX hacim olarak çok daha küçük DEX damlacıkları üretmek de mümkündür. Bu yaklaşımlar, yüksek verim veya çoğaltılmış ko-kültür veya göç analizleri üretmek isteyenler için ilgi çekici olabilir. Buna ek olarak, mikroakışkan yaklaşımlar kullanılarak, bu küçük bir hücre sayısı ile deney yapmak mümkündür, ya da sıvı akışı ve saf etkilerini kontrol edilebilir olduğu bir mikrokanal hücreleri ile. Ancak bu gelişmiş yöntemlerle çoğu uygulamalar için gerekli değildir.

Hücrelerin sulu iki-fazlı modelleme basit ve kolay bir şekilde, tipik bir hücre için adapte edilmiş olankültürü ayarı. Bu metod, tipik bir hücre kültürü laboratuvar (a başlık erişim, CO2 kuluçka makinesi, ve mikropipetler) ve mono-kültür ve ko-kültür içinde tekrarlanabilir model hücrelere Yukarıda verilen polimerlerin erişimi olan herhangi bir araştırmacı izin verir. Bizim laboratuar yara iyileşmesi deneyini hücre göçü incelemek ve embriyonik hücreler 16, 17, 20 ayrımında juxtacrine ve parakrin sinyal etkilerini incelemek için hücrelerin diziler yazdırarak bu yeteneği göstermiştir. Ekstrasellüler matris 28, 25 microfluidic cihazlar laminer akış tarafından püskürtmeli baskı 29, ve şekillendirilmesinin desenler dahil olmak üzere diğer yöntemler, 26, aynı zamanda hücrelerin tespit etmek için kullanılmıştır. Bu diğer yöntemler hücrelerin iyi tanımlanmış desenler elde etmek için etkili yaklaşımlardır ve çoğunlukla tek hücreli hassasiyeti elde edebilirsiniz. Ancak, bu yöntemleri de son derece özel ekipman ve / veya temiz oda tesislerine erişim pr için kullanılan damgalar imal gerektirirint ekstrasellüler matriks proteinleri veya mikroakışkanları cihazları üretmek. Güç kaynakları, şırınga pompaları, ve diğer harici bileşenleri Onların bağlantı da bunu çalıştırmak için gerekli donanım ve kullanıcı beceri ile ilişkili maliyetleri nedeniyle bunların uygulanmasını engellemektedir.

Gelecekteki uygulamalar açısından bizim yöntemi hücre hareketi ve proliferasyon high-throughput analizi, yanı sıra birden fazla hücre popülasyonları arasındaki araştıran hücre-hücre etkileşimleri izin kültür sistemlerinin gelişimi için yararlı olacağını umuyoruz. Bu noktada, bizim raporlar seferde desenli hücrelerin sadece bir kaç tür etkileşimi inceleyerek odaklanmıştır. Ancak, hücrelerin birçok alt popülasyonlar tek bir hücre kültürü kurulumunda birlikte yetiştirilen birçok hücre tipleri parakrin ve juxtacrine sinyal etkisini araştırmak için ortak bir besleyici tabaka ile kültüre olabileceği düşünülebilir. Son olarak, doku mühendisliği uygulamaları sık gerekli mekansal LokalizasyonBir veya daha fazla hücre türleri. Bu, daha fazla fizyolojik olarak uygun mühendislik doku hastalık modeli üretecek ya da klinik uygulamaları için implante edilebilir malzemeler üzerinde kalıp hücreleri için modelleme hücrelerinde kullanılmak için teknik uyarlamak da mümkün olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir mali çıkarlarının rekabet var.

Acknowledgments

JBW için:; Bu çalışma Coulter Vakfı, Beyster Vakfı, Lisansta Araştırma Fırsat (UROP) ATA ve Ulusal Bilim Vakfı Yüksek Lisans Araştırma Bursu (2010101926. Kimlik Hibe hiçbir DGE 0718128) için yaz programı tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran 500,000 kDa Pharmacosmos, Denmark
Polyethylene Glycol 35,000 kDa Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3 ATCC, Manassas, VA
Cell Tracker Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM Gibco, Carlsbad, CA
RPMI Gibco, Carlsbad, CA
F12 Gibco, Carlsbad, CA
Fetal Bovine Serum Gibco, Carlsbad, CA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hatti-Kaul, R. Aqueous two-phase systems : methods and protocols. Methods in biotechnology. xiii, Humana Press. 440 (2000).
  2. Albertsson, P. A. k Partition of cell particles and macromolecules: separation and purification of biomolecules, cell organelles, membranes, and cells in aqueous polymer two-phase systems and their use in biochemical analysis and biotechnology. 3rd ed, Wiley. 346 (1986).
  3. Yamada, M., et al. Continuous cell partitioning using an aqueous two-phase flow system in microfluidic devices. Biotechnol. Bioeng. 88, (4), 489-494 (2004).
  4. Soohoo, J. R., Walker, G. M. Microfluidic aqueous two phase system for leukocyte concentration from whole blood. Biomed. Microdevices. 11, (2), 323-329 (2009).
  5. Hahn, T., Hardt, S. Concentration and size separation of DNA samples at liquid-liquid interfaces. Anal. Chem. 83, (14), 5476-5479 (2011).
  6. Hatti-Kaul, R. Aqueous two-phase systems. A general overview. Mol. Biotechnol. 19, (3), 269-277 (2001).
  7. Hustedt, H., Kroner, K. H., Menge, U., Kula, M. -R. Protein recovery using two-phase systems. Trends in Biotechnology. 3, (6), 139-144 (1985).
  8. Keating, C. D. Aqueous Phase Separation as a Possible Route to Compartmentalization of Biological Molecules. Acc Chem. Res. 45, (12), 2114-2124 (2012).
  9. Helfrich, M. R., et al. Partitioning and assembly of metal particles and their bioconjugates in aqueous two-phase systems. Langmuir. 21, (18), 8478-8486 (2005).
  10. Diamond, A. D., Hsu, J. T. Prote. Partitioning in PEG/Dextran Aqueous Two-Phase Systems. AIChE Journal. 36, (7), 1017-1024 (1990).
  11. Y-T,, Zhu, Z. -Q. Modeling of interfacial tension of aqueous two-phase systems. Chemical Engineering Science. 54, (4), 433-440 (1999).
  12. Liu, Y., Lipowsky, R., Dimova, R. Concentration dependence of the interfacial tension for aqueous two-phase polymer solutions of dextran and polyethylene glycol. Langmuir. 28, (8), 3831-3839 (2012).
  13. Rha, C. Interfacial Tension of Polyethylene Glycol/Potassium Phosphate Aqueous Two-Phase Systems. Physics and Chemistry of Liquids: An International Journal. 38, (1), 25-34 (2000).
  14. Fang, Y., et al. Rapid Generation of Multiplexed Cell Cocultures Using Acoustic Droplet Ejection Followed by Aqueous Two-Phase Exclusion Patterning. Tissue Eng. Part C. Methods. 18, (9), 647-657 (2012).
  15. Tavana, H., et al. Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells. Nat. Mater. 8, (9), 736-741 (2009).
  16. Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches. Adv. Mater. 22, (24), 2628-2631 (2010).
  17. Tavana, H., et al. Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. (2011).
  18. Tavana, H., Takayama, S. Aqueous biphasic microprinting approach to tissue engineering. Biomicrofluidics. 5, (1), 13404 (2011).
  19. Frampton, J. P., et al. Precisely targeted delivery of cells and biomolecules within microchannels using aqueous two-phase systems. Biomed. Microdevices. 13, (6), 1043-1051 (2011).
  20. Hossein Tavana, K. K., Bersano-Begey, T., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. Rehydration of Polymeric, Aqueous, Biphasic System Facilitates High Throughput Cell Exclusion Patterning for Cell Migration Studies. Advanced Functional Materials. 21, (15), 2920-2926 (2011).
  21. Falconnet, D., et al. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27, (16), 3044-3063 (2006).
  22. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Eng. 13, (8), 1879-1891 (2007).
  23. Ringeisen, B. R., et al. Jet-based methods to print living cells. Biotechnol. J. 1, (9), 930-948 (2006).
  24. Wright, D., et al. Generation of static and dynamic patterned co-cultures using microfabricated parylene-C stencils. Lab Chip. 7, (10), 1272-1279 (2007).
  25. Takayama, S., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, (10), 5545-5548 (1999).
  26. Berthier, E., et al. Pipette-friendly laminar flow patterning for cell-based assays. Lab Chip. 11, (12), 2060-2065 (2011).
  27. Davidson, R. L., O'Malley, K. A., Wheeler, T. B. Polyethylene glycol-induced mammalian cell hybridization: effect of polyethylene glycol molecular weight and concentration. Somatic Cell Genet. 2, (3), 271-280 (1976).
  28. Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).
  29. Moon, S., Lin, P., Keles, H. O., Yoo, S., Demirci, U. Title Cell Encapsulation by Droplets. J. Vis. Exp. (8), e316 (2007).
Sulu İki fazlı sistemler kullanma Hücre Co-kültür desenlendirme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems. J. Vis. Exp. (73), e50304, doi:10.3791/50304 (2013).More

Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems. J. Vis. Exp. (73), e50304, doi:10.3791/50304 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter