Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

수성 2 단계 시스템을 사용하여 셀 공동 문화 패턴

doi: 10.3791/50304 Published: March 26, 2013

Summary

수성 2 단계 시스템은 세포 동시에 패턴 여러 사람들에게 사용되었습니다. 세포 패터닝을위한이 빠르고 쉬운 방법은 dextran과 폴리에틸렌 글리콜 및 두 개의 폴리머 솔루션 사이에 존재 계면 장력의 수성 솔루션의 위상 분리의 장점을 걸립니다.

Abstract

빠르고, 사용하기 쉬운 저렴 세포 패터닝 기술은 세포 세포 상호 작용과 조직 엔지니어링 시스템을 공부 높은 처리량 세포 assays, 플랫폼의 미래 발전을 위해 필요합니다. 이 자세한 프로토콜은 임계 농도 위에 결합 상 별도의 때 dextran (DEX) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 biocompatible 솔루션을 사용 세포의 공동 문화를 생성하는 방법을 설명합니다. 세포는이 방법을 사용하여 구성 다양한 패턴 할 수 있습니다. 셀 제외 패턴은 기판에 DEX의 방울을 인쇄하고 PEG가 포함 된 셀의 솔루션을 다루는하여 수행 할 수 있습니다. 두 폴리머 솔루션을 사이에 형성 계면 장력은 DEX 비말의 바깥 주위에 빠지지 및 마이그레이션 assays에 사용 할 수있는 원형 개간를 형성 세포가 발생합니다. 셀 섬은 PEG 용액에 세포 풍부한 DEX 단계를 분배하거나 DEX를 덮고하여 패턴 할 수 있습니다PEG의 솔루션을 비말. 공동 문화는 DEX 섬의 패턴과 셀 제외를 조합하여 직접 형성 될 수있다. 이 방법은 수동 micropipetting 등의 액체 처리 방법, 다양한와 호환 있으며, 거의 모든 자기편 세포 유형으로 사용할 수 있습니다.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

이 호환되지 않는 고분자의 솔루션은 충분히 높은 농도에서 함께 혼합 수용액 2 단계 시스템 (ATPSs)는 형식입니다. 단계 분리는 분자량과 극성 고분자의, 솔루션, 산도 및 수성 용매 1, 2의 이온 콘텐츠의 온도를 포함 다양한 요소에 의해 영향을받습니다. 별도의 두 폴리머 솔루션 선택 단계 시스템의 physiochemical 특성에 의해 결정하지만,되는 시점은 일반적으로 ATPSs는 생명 공학에 사용 할 수 있도록, 비 denaturing 조건 하에서 낮은 폴리머 농도 (20 % 이하 중량 / 중량)에 발생 응용 프로그램 3-9.

지금까지 가장 광범위하게 연구 ATPS는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) / dextran (DEX) 시스템입니다. 이 저렴하고 biocompatible 폴리머에 의해 형성 ATPS는 원래 분자 파티션 2, 10에 의해 분자의 정화에 대한 설명되었다. 파티션상 시스템에 기여하지 않은 추가 분자 또는 입자 PEG와 DEX과 혼합 할 때 발생합니다. DEX 또는 PEG 중 대한 상대적 동질성을 바탕으로 분자 또는 입자는 우선적으로 두 단계 중 하나에 또는 인터페이스에있는 것입니다. PEG / DEX ATPS의 또 다른 속성은 두 폴리머 단계 사이의 계면 장력의 존재입니다. PEG 및 DEX에 의해 형성 ATPSs은 일반적으로 기름과 물 등의 액체 - 액체 2 상 시스템보다 훨씬 낮 계면 긴장을 표시하지만, 계면 장력 세력은 여전히 바이러스, 세포와 단백질을 합산이 같은 작은 입자에 효과를 발휘 , 11-13. 포유류의 세포에 대한 해로운 영향이 내에 포함되는 경우, 높은 분자량 PEG와 DEX 소금의 생리적 농도의 존재에 낮은 농도 (5 % 이하의 중량 / 고 분자량의 폴리머 종류에 대한 중량)에서 별도의 있기 때문에, 몇 있습니다 시스템14-16.

최근 계면 특성과 ATPSs의 파티션 효과를 세포 패터닝 14, 16-20 위해 우리 실험실에 의해 적용되었습니다. 이것은 micropatterning에 의해 PEG의 존재의 세포 배양 기판에 밀도가 DEX 솔루션을 달성했습니다. 세포 PEG 단계에 통합 될 때, 그것들은 PEG / DEX 계면 장력 20 인해 DEX의 방울을 입력에서 제외됩니다. 세포 DEX 단계에서 패턴 할 때, 그것들은 계면 장력과 분할 16, 17, 19에 의해 세포 배양 기판의 표면에 유지됩니다.

세포 패터닝을위한 다른 방법 대조적으로, ATPS 세포 패터닝은 배우기 쉽습니다 만 고분자 자체, 그리고 세포 배양을 수행하고 micropipettor를 사용할 수있는 기능에 대한 기초적인 지식이 필요합니다. 세포 패터닝을위한 다른 방법은 종종 쉽게 번째로 번역되지 않은 특수 장비 및 교육을 포함전자 생명 과학. 예를 들어, 일부 방법 (microcontact 인쇄 나 잉크젯 인쇄) 간접적 이후 휴대 첨부 파일 21, 22에 대한 사이트 역할을 문화 기판에 세포 접착 분자의 패턴을 적용하여 패턴 세포. 간접적 인 접근 방법은 몇 가지 세포 유형에 대한 유용한 있지만, 사용자 기술과 패터닝 도구를 제조하는 전문 장비의 높은 수준을 필요로하고, 특정 세포 유형 / 생체 분자 패턴에 따라 특이성이 부족 할 수 있습니다. 또한, 세포는 판상 흐름 패턴, stenciling 및 잉크젯 인쇄 23-26를 포함 직접 패터닝의 방식에 의해 높은 패턴 특이성으로 증착 될 수있다. 그러나 이러한 기술은 사용자의 전문 지식과 전문 장비를 필요로하고, 인쇄 과정에서 세포가 손상 될 수 있습니다. 이러한 접근 방법은 일반적으로 생명 과학에 유용한 도구가 될 세포 패터닝을위한 세포의 정확한 패턴을 생산하지만, 비용 효과적인이어야합니다구현하기 간단한 차.

여기 우리는 이전에 출판 응용 프로그램에 설명 된 ATPSs를 사용하여 패턴 배양 한 세포를 생성하는 자세한 프로토콜을보고합니다. 만 micropipettors를 사용하여 사용자는 마이그레이션 assays에 대한 셀 제외 지역 또는 셀 섬을 생성 할 수 있습니다. 이것은 어느 DEX 단계에서 세포를 유지하거나 DEX에서 PEG 단계에 입금 셀을 제외 PEG / DEX 계면 장력에 의해 달성된다. 이 두 기본 패턴 기술을 결합함으로써, 빠르게 등 간 섬유 아세포 세포 공동 문화와 같은 세포의 공동 문화를 생성 할 수 있습니다. 패터닝 방법, ATPS 매개 변수와 예상 결과가 자세히 설명되어 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. 단계 시스템 특성화 : 단계 분리에 대한 결정 임계 값

  1. 원하는 버퍼 또는 세포 배양 매체 15 ML 50 ML 원뿔 튜브에 그림 1 (보라색 점)와 같이에 PEG와 DEX를 포함하는 솔루션을 준비합니다. 향후, PEG와 DEX는 35 kDa의 PEG 500 kDa DEX를 참조 할 수 있지만, 중요한 농도는 사용 두 고분자에 따라 변경됩니다. 각 솔루션 PEG와 DEX의 질량을 기록합니다. 높은 농도 폴리머 솔루션은 분해하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. Vortexing는 혈청이없는 솔루션을 사용할 수 있습니다. 두 폴리머가 완전히 해소 될 때까지 단백질이나 혈청을 포함하는 미디어를 들어, 흔들 무대에서 튜브를 놓습니다. 중합체를 용해하고 초기 농도 관심을 가지고하는 데 사용되는 미디어의 무게를 기록합니다.
  2. 폴리머가 완전히 용해되면 솔루션은 구름 나타납니다. 이 단계 분리가 발생하는 첫 번째 표시입니다. 이를 확인하려면 허용폴리머 솔루션은 20 분 동안 실온에서 수직 위치에 말이다. 1000 XG에서 원심 분리가 상 분리 과정을 가속화하는 데 사용할 수 있습니다. 밀도가 바닥 단계 DEX 풍부한되며 상단 단계 PEG 풍부한 될 것입니다.
  3. 천천히 튜브에 추가 버퍼 나 미디어를 추가 할 수 있습니다. 작은 단위대로되지 오버 슈트 상 분리 지점을에 그렇게 사용되어야합니다.
  4. 솔루션은 분명해진다 더 이상 원심 분리 한 후, 위상 분리에 대한 임계 값에 도달 상 구분 없을 때. 관의 최종 무게를 기록합니다.
  5. 미디어를 추가 한 후, 위상 분리가 더 이상 발생하지있는 각 두 고분자의 %의 중량 / 중량을 결정하는 최종 무게와 함께 폴리머에 대한 이전 기록 가중치를 사용합니다.
  6. 이 값을 그리기 x-축에 Y 축 및 % 중량 / 중량 DEX의 % 중량 / 중량 PEG 있습니다. binodal 곡선으로 알려진이 플롯은, 다른 concentrati에 대한 위상 분리에 대한 임계 농도를 측정하는 데 사용하실 수 있습니다특정 세포 배양 매체에서 PEG / DEX의 기능.

2. 구성 1 : 제외 패턴 (96 - 잘 플레이트 형식)

  1. 5.0 % 세포 배양 매체의 중량 / 중량 PEG와 12.8 % 중량 / 중량 DEX 별도의 솔루션을 준비합니다. 폴리머가 서로에 대해 평형 후 ATPS이 상태를 유지하기 위해 두 배 이상 중요 지점의 ATPS 솔루션을 사용합니다. PEG 풍부한 위상 및 그 반대에 DEX의 자속의 작은 양의가 있습니다, 따라서, 중요 지점 아래의 농도 드롭으로 위상 시스템의 손실이 발생할 수있는 중요한 농도 근처도 노력하고있어. 마찬가지로, 습도 및 온도 조절 보육에 세포 배양 접시를 전송하면 2 단계 등록 정보를 변경하고 두 솔루션은 miscible 할 수 있습니다. 참고 : 일부 세포가 다른 ATPS 공법과 더 나은 수행 할 수 있습니다. 사용할 수있는 공법은 1 부에서 결정된 binodal 곡선에 따라 선택 될 수있다.
  2. 제외 patte에 사용되는 세포를 수확rning. 사용 가능한 세포의 총 수 / 농도를 결정합니다. 선택 사항 : CellTracker 또는 형광 현미경을위한 기타 비 세포 독성 라벨과 셀을 레이블을 붙입니다.
  3. 펠렛 5.0 %의 적절한 볼륨에있는 세포와 펠렛을 resuspend는 제외 할 셀의 원하는 번호를 달성하기 위해 PEG. 예를 들어, 96 - 웰 플레이트의 잘 하나 37,500 섬유 아세포 세포는 다음날 합류를 생성하기 위해 PEG 200 μl에 resuspended해야합니다. 다른 세포 유형과 문화 기판 크기에 맞게 이러한 숫자를 확장.
  4. micropipettor를 사용하여 건조 세포 배양 기판에 DEX의 0.5 μl 방울을 투여. 큰 볼륨 방울 더 큰 제외 영역을 생산하고 있습니다. 0.1에서 1 μl로 크기까지 방울는 제외 micropatterning하는 것이 좋습니다. 옵션 : DEX의 방울은 미리 24 시간을 입금하고 실온에서 탈수 할 수 할 수 있습니다. 이 깔끔한 패턴을 생성 할 수 있습니다.
  5. t에 PEG 세포 현탁액 200 μl을 투여그는 잘 DEX의 방울을 커버합니다.
  6. 37 번 12 시간의 humidified 인큐베이터 ° C, 5 % CO 2의 장소. 요리는 취급 중에 있으며이 패턴을 방해하지 않도록 수준의 보육의 선반에 배치되는 기울하지 않았는지 확인합니다.
  7. PEG 용액을 제거하고 배지 200 μl로 세 번 씻어.
  8. 신선한 문화 매체와 보육에 대한 수익을 추가합니다.
  9. 제외 지역으로 세포의 움직임을 관찰 정기적으로 문화를 모니터링 할 수 있습니다.

3. 구성 2 : 아일랜드 패터닝 (96 - 잘 플레이트 형식)

  1. 5.0 % 위의 세포 배양 매체에 중량 / 중량 PEG와 12.8 % 중량 / 중량 DEX의 솔루션을 준비합니다.
  2. 섬의 패터닝에 사용되는 세포를 수확. 사용 가능한 세포의 총 수 / 농도를 결정합니다.
  3. 12.8 % DEX의 적절한 볼륨의 펠렛 및 resuspend은 세포 섬 패턴에 대한 세포의 원하는 농도를 달성합니다. 5000 CE의 농도재편 / μl 이하는 강력하게 자기편 세포 유형에 권장합니다. 에 대한 어려움을 부착하거나 느슨하게 준수 세포가 세포 만 세포 / μl까지 농도가 고려 될 수 있습니다.
  4. 위의 설명에 따라 건조 세포 배양 기판에, DEX의 피펫 0.5 μl 방울을 건조 방지하기 위해 신속하게 작업. 작은 물방울이 건조 허용하지 않습니다. 선택 사항 : PEG 용액 200 μl를 미리 잘에 추가 할 수 있습니다. DEX의 방울 그런 다음 그 아래로 가라 앉을과 문화의 표면 연락을 드릴 것입니다 PEG 용액에 증착 될 수있다. 이 청소기 섬 패턴을 생성 할 수 있습니다.
  5. PEG 200 μl과 DEX의 방울을 다룹니다.
  6. 37 번 12 시간의 humidified 인큐베이터 ° C, 5 % CO 2의 장소. 요리는 취급 중에 있으며이 패턴을 방해하지 않도록 수준의 보육의 선반에 배치되는 기울하지 않았는지 확인합니다.
  7. PEG 용액을 제거하고 배지 200 μl로 세 번 씻어.
  8. 신선한 문화를 추가매체와 인큐베이터으로 돌아갑니다.
  9. 섬에서 셀 이동 및 확산 바깥쪽으로를 관찰하기 위해 정기적으로 문화를 모니터링 할 수 있습니다.

4. 구성 3 : 배제 공동 문화 (96 - 잘 플레이트 형식)

  1. 5.0 % 위의 세포 배양 매체에 중량 / 중량 PEG와 12.8 % 중량 / 중량 DEX의 솔루션을 준비합니다.
  2. 제외하고 섬의 패터닝에 사용되는 세포를 수확. 각각의 셀 타입에 사용할 수 세포의 총 수 / 농도를 결정합니다. 선택 사항 : 일부 세포 pairings는 크게 다른 확산 지수를 표시 할 수 있습니다. 섬 패턴 세포를 (특히 장기의 문화를) overpopulating에서 제외 세포를 방지하기 위해 2 시간에 미토 마이신 C와 배제에 사용 된 세포를 치료하거나 수확 전에 비추다. 이 확산을 방지 할 수 있습니다. 형광 CellTracker 염료가 필요한 경우 두 세포 집단을 구분하는 데 사용할 수 있습니다.
  3. 펠렛 exclusio의 세포와 펠렛을 resuspendN 5.0 %의 PEG의 적절한 볼륨의 패턴은 위 세포의 원하는 번호를 달성합니다. 위와 같이, 세포의 원하는 농도를 달성하기 위해 12.8 % DEX의 적절한 볼륨으로 섬의 패턴에 대한 펠렛을 Resuspend.
  4. micropipettor를 사용하여 건조 세포 배양 기판에 DEX 세포 현탁액의 0.5 μl 방울을 투여. 작은 물방울이 건조 허용하지 않습니다.
  5. PEG의 세포 현탁액 200 μl로 DEX의 방울을 다룹니다.
  6. 37 번 12 시간의 humidified 인큐베이터 ° C, 5 % CO 2의 장소. 요리는 취급 중에 있으며이 패턴을 방해하지 않도록 수준의 보육의 선반에 배치되는 기울하지 않았는지 확인합니다.
  7. PEG 용액을 제거하고 배지 200 μl에 세 번 씻는다.
  8. 신선한 문화 매체와 보육에 대한 수익을 추가합니다.
  9. 세포 인구 사이의 상호 작용을 관찰하기 위해 공동 문화를 모니터링 할 수 있습니다. 선택 사항 : 컨트롤은 배제 나 섬 패터닝 개인을 수행하여 준비 할 수 있습니다idually, 상호 작용하지 않는 공동 문화 셀이나 패터닝 전이나 후에 하나 또는 둘 모두 세포 인구의 관심 경로를 차단합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

세포 패터닝을위한 PEG와 DEX의 적절한 조합을 선택하려면이 binodal 곡선을 결정하는 것이 중요합니다. 이 곡선은 ATPS가 형성 수 있으며, 온도, 산도 및 이온 콘텐츠를 기반으로 고분자의 주어진 세트에 따라 다를 수의 점을 delineates. 사용자 정의 중간 공법을 필요로 배양 세포의 경우는 실험적으로 binodal 곡선을 결정하기 위해 필요할 수 있습니다. 이것은 멀리 binodal과 PEG와 DEX 내용에 변화 (그림 1, 보라색 원) 출신 ATPSs 일련의를 생성하여 수행됩니다. ATPS이있는 경우, 폴리머 솔루션은 혼합하면 흐린 나타나며 방해받지 왼쪽 경우 별도의 단계로 평형합니다. 폴리머 혼합물에 추가 용매 추가하여 ATPS은 0 % PEG / 0퍼센트 DEX에 접근합니다. 어떤 시점에서, 혼합물은 더 이상 별도의 폐지하지 않습니다. 이 문제가 발생되는 PEG / DEX 농도는 binodal 곡선의 한 지점을 나타냅니다, AT 그 시점 위PS는 형성 할 수 있으며 그 시점 아래 없어요. 그림 1의 곡선은 다음과와 10 % 태아 소 혈청 (FBS)이없는 세 가지 일반적인 세포 배양 미디어 binodals을 나타냅니다. ATPS가 형성되는 농도는 FBS의 존재에서 약간 높다.

이전 보고서에서, 우리는 중요한 포인트 (binodal에 그 어떤에서 평균 한 후 PEG와 DEX 형태의 동일한 볼륨) 2.5 % PEG 35 kDa/3.2 % DEX 500 kDa의.에 따라 ATPSs를 사용 우리 binodal 데이터에서 결과가 중요한 포인트 값 가까이에 있습니다. 표 1에 도시 된 바와 같이 우리는 패터닝을위한 아홉 단계 시스템 조합을 실험했다. 그들이 결합 된 후 PEG와 DEX의 순수한 솔루션의 폴리머 농도와 관련하여 평형 때문에, 이러한 솔루션 중 일부는 안정적인 ATPSs를 형성하고, 따라서 패턴 (표 1A, X 표시)에 유용하지 못했습니다 없습니다. 기타 폴리머 조합은 인식 패턴을 제작하지만, 실험만큼 균일하지 못했습니다 (표 1A X / ✓ 표시한다). 유용한 폴리머 공법은 제외 영역 또는 비 패턴 영역 (표 1A, ✓ 마르크)에 세포의 거의 결여 있었다 섬을 만들었다.

10 % PEG를 통해, 우리는 세포가 문화의 표면 (표 1B, X 표시)에 첨부 할 감소 능력을 표시와 함께, 그 세포 형태가 비정상적으로 앞, 24 시간 후 스핀들과 같은났습니다. 형태론과 첨부 파일은 2.5 %와 5 %의 PEG (표 1B, ✓ 마르크)의 정상이었다. 우리는 10 % PEG의 비정상적인 세포 형태와 첨부 파일이 혈청 액세스 할 수있는 문제와 관련 될 수 있다는 제안, 높은 PEG 농도 (표 1C, X 표시)에있는 문화 매체에서 그 혈청 유발을 관찰했다. 또한, PEG는 플라즈마 멤브레인에게 27 방해하는 것으로 알려져 있습니다. 이러한 효과는 낮은 몰의 높은 농도에서 관찰되어 있지만ecular 체중 PEG는, 그것은 신뢰할 수있는 패턴을 생산하고 가장 낮은 PEG 농도를 사용하는 것이 가장 좋습니다.

이전 보고서에 의거하여, 우리는 5 % PEG/6.4 % DEX 5 % PEG/12.8 % DEX가 잘 12.8 % DEX가 더 균일 한 패턴을 생산과 세포 패턴에 적합한 것으로 결론을 내렸다. 셀로 3 패턴 형식의 예상 결과는 추적자 - 표시 헬러 전지는 그림 2에 표시됩니다. 각 패터닝 방식에 따라,이 패턴 영역 이외의 거의 세포로, 각 유형의 균일 한 패턴을 만들 수 있습니다.

제외하고 섬 패턴을 사용하면이 패턴 세포의 증식 및 마이그레이션 (그림 3)을 평가 할 수 있습니다. 3 일에 걸쳐, 헬러 세포는 제외 영역을 (그림 3A-C) 가득 찼다. 섬 패턴 전지는 초기 패턴 (그림 3D-F)에서 외부되었다. 이러한 변경 사항은 사용 정량화 할 수표준 imageJ 측정 도구 (도 3 C, F). 그것은 여러 세포 집단이 공동 배양 할 때 (그림 2, 서식 3) 하나의 세포 인구가 밖으로 세포 분열 따위에 의해 번식 수 있습니다 및 다른 대체하는 것이 중요합니다. 제외 패터닝과 섬의 패턴이 문제가 될 수있을 평가하는 유용한 도구가 될 수 있습니다. 확산 색인의 극적인 차이가 발생하는 상황에서, 하나의 셀 인구가의 확산을 제한하는 방사선이나 화학 물질 요인에 의해 치료를하는 것이 좋습니다. 이 특정 한 셀 유형은 느린 성장보다 민감한 세포 유형에 대한 지원 전지로 사용하는 경우에 유용합니다.

우리는 배양 HepG2 세포, 일반적으로 미토 마이신 C를 (그림 4)를 사용하여 체포되었다 NIH 3T3 섬유 아세포와 함께, 모델 간세포 생물학에 사용되는 간세포 암 세포주하여이 원칙을 보여 주었다. 시간이 지남에 HepG2 세포는 자신의 현지화를 유지d 개의 식민지 모양 (그림 4A). 같은 판에서 많은 방울을 배치하고 섬유 아세포과 함께 주변으로는 멀티 플렉스 연구 (그림 4B)를 잠재적으로 유용 형식으로이 세포 성장을 할 수 있습니다. 셀 섬 monocultures은 paracrine 요소 (그림 4C)의 영향에 대한 제어로이 형식에 사용할 수 있습니다.

그림 1
1 그림. ATPS이 형성 할 수있는에 폴리머 농도는 실험적으로 결정 binodal 곡선에서 추정 할 수 있습니다.이 binodal 곡선이되는 다양한 PEG / DEX 농도의 2 상 혼합물 (자주색 점을 측정하기 위해 추가 용매를 추가하여 클라우드 점 방법을 사용하여 건설되었습니다 원)은 더 이상 위상 separati 할 수 없었다것이다. Binodals이 함께하고 혈청이없는 DMEM, F12 및 RPMI에 결정됩니다. 데이터 포인트는 3 매개 변수 합리적인 기능을 갖추고 있었다. 각 데이터 포인트 N = 3.

그림 2
그림 2. 폴리스티렌 판에 ATPS 솔루션을 분배함으로써, 세포 패터닝을위한 세 가지 형식이 생성 될 수 있습니다. 절차는 DEX의 방울에게) 다음에) PEG B로 코팅되어 있다고 pipetting하여 시작합니다. 세포가 첨부되면, ATPS 솔루션은 씻어 문화 매체 (C, D)로 대체 할 수 있습니다. monocultures에 형광 이미지 패터닝 후 CellTracker 염료 물들했다. 공동 문화를 들어, 세포 패터닝 전에 CellTracker 염료와 개별적으로 얼룩 져 있었다. 헬러 세포는 세 가지 문화 형식을 생성하는 데 사용되었습니다. 그림 3
그림 3. 제외 패터닝과 섬의 패턴은 셀 마이그레이션과 확산을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.) 제외 패턴 헬러 세포 패터닝 후 일일. b)는 제외 패턴 헬러의 세포 패터닝 후 3 일. C) 셀을 분아 따위에 의해 중식 및 마이그레이션 크게의 크기를 감소 제외 지역. D) 섬 패턴 헬러 세포 패터닝 후 일일. 전자) 섬 패턴 헬러 세포 삼일 패턴 후. F) 세포가 크게 섬의 크기를 확대, 세포 분열 따위에 의해 번식과 외측을 마이그레이션합니다. 이미지는 마이그레이션 이전과 이후 셀 삭제 및 셀 섬 지역을 측정하기 위해 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량 하였다. 바 뜻을 나타냅니다± 적어도 세 독립적 인 관찰 SEM.

그림 4
4 그림. 간 세포 / 섬유 아세포 문화가 ATPS 제외 공동 문화 패턴을 사용하여 생성 할 수 있습니다.)이 식민지 문화에서 적어도 4 일 동안 자신의 조직을 유지하고 있습니다. b)는 여러 개의 섬이 멀티 플렉스 또는 높은 처리량에 대한 가능성이있는 하나의 접시에 배열 될 수있다 assays. C)이 아닌 공동 배양 섬 패턴에 비해 공동 배양 세포는 알부민 공동 문화 스테인드 대 monocultures의 질적 비교에서 분명 같은 알부민 생산의 약간 높은 수준 (갈색 착색)을 표시합니다. 알부민은 간 세포에 의해 생산 단백질입니다. 따라서이 결과는 ATPS를 사용하여 섬유 아세포와 공동 배양시 간 세포의 기능이 향상하는 것이 좋습니다.

) 패턴 결성 DEX 3.2 % DEX 6.4 % DEX 12.8 %
PEG 2.5 % 엑스 엑스 엑스
PEG 5.0 % X / ✓
PEG 10.0 % X / ✓
B) 형태론 DEX 3.2 % DEX 6.4 % DEX 12.8 %
PEG 2.5 %
PEG 5.0 % & # X2713;
PEG 10.0 % 엑스 엑스 엑스
C) 세럼의 강수량 DEX 3.2 % DEX 6.4 % DEX 12.8 %
PEG 2.5 %
PEG 5.0 %
PEG 10.0 % 엑스 엑스 엑스

표는 1. 패턴에 사용할 수 있습니다) ATPS 공법은 체크 마크, X 표시로 표시되는 그 사람들에 의해 표시됩니다. b)는 일반 세포 형태학 및 첨부 파일 속성을 유지 공법은 B를 표시됩니다Y 체크 마크, X 표시로 표시되는 그 사람들. C) 공법 혈청 단백질의 강수량 결과 X 마크가 표시됩니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ATPS 셀 micropatterning 방법은 세포 배양 기술의 능력 이외의 거의 전문 지식을 필요로 신속하게 마스터 할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 저렴한 신속하고 세포 유형과 문화 다양한 형식의와 호환되는지입니다. 이러한 이유로, 우리의 프로토콜은 쉽게 특히 생명 과학자, 세포 증식, 이주 및 chemotaxis, 그리고 세포 인구 중 juxtacrine 및 paracrine 상호 작용의 영향을 연구하는 사람들에 의해 채택되어야한다. 여기에 제시된 assays는 쉽게 등 ImageJ와 같은 소프트웨어에서 사용할 수있는 표준 이미지 분석 절차를 사용하여 셀 인구 수준에서 정량화 할 수 있습니다.

일관성있는 패턴을 생성하기 위해 우리는 다음과 같은주의 사항을 권장합니다. 각 DEX 비말 더 일관성있는 비말 볼륨을 제공하기 위해 입금 한 후 우선, DEX 솔루션을 분배하는 데 사용되는 피펫 팁을 변경해야합니다. DEX 솔루션은 상대적으로 점성이기 때문에, 그것은 피펫 팁의 바깥 쪽 표면에 존재있을 그 DEX가 종료의 전체 볼륨이 팁 보장하기 위해 초과 DEX를 입금하지 않도록하는 것도 중요합니다. PEG 너무 강력하게 추가 된 경우 또는 요리를 기울 경우 둘째, 방울는 이동할 수 있습니다. DEX의 중단은 수준의 표면에 요리를 유지 PEG 솔루션은 점차 비말의 일부를 제거하기 위해 PEG 초승달 모양의 큰 힘을 허용하지 않고 위의 물방울을 커버 할 수 있도록하여 최소화 할 수 있습니다. 비말 장애는 큰 DEX의 방울을 더 자주 발생하므로, 가능한 경우에 물방울이 μl 0.5 이하를 사용해야합니다. 이외에도 솔루션을 분배와 관련이 기술적 인 문제에서이 기술과 관련된 거의 함정 적절한 폴리머 분자 무게와 농도가 사용되는 경우들이 있습니다.

ATPS의 patterning 쉽게 micropipette를합니다 (여기에 제시된)를 사용하여 수행 할 수 있지만, 더 많은 sophi 다양한 있습니다빠르게 더 복잡한 기하학적 배열 (예 : 액체 처리 로봇 및 음향 비말 ​​방출)의 패턴을 생성하는 데 사용할 수 있습니다 sticated 접근 방법은 당사 이전 연구 14, 15, 20로 표시. 이 모세관 구멍을 통해 또는 PEG 19 끼 우고 흐르는 DEX의 방울을 생산 microchannel에 구멍을 활성화하여 pneumatically 꺼내기 DEX에 의해 볼륨에서 훨씬 작은 DEX의 방울을 생성하는 것도 가능합니다. 이러한 접근법은 높은 처리량 또는 멀티 플렉스 공동 문화 또는 마이그레이션 assays를 생산하고자하는 분들을 위해 관심이있을 것으로 생각됩니다. 또한, 마이크로 접근 방식을 사용하여, 그것은 세포의 작은 숫자와 함께 실험을 수행 할 수 있습니다, 또는 유체 흐름과 깎아 지른듯한의 영향을 검토 할 수있는 microchannel에서 세포를 가지고. 그러나, 이러한 고급 방법은 대부분의 응용 프로그램에 필요하지 않습니다.

세포의 수성 2 상 패턴은 간단하고 쉽게 전형적인 셀에 적응합니다문화 설정입니다. 이 방법은 일반적인 세포 배양 연구소 (후드에 액세스, CO 2 인큐베이터, 그리고 micropipettes)와 monoculture 및 공동 문화에 reproducibly 패턴 셀에 상기 고분자에 액세스 권한이있는 연구자 수 있습니다. 우리 연구실은 상처 치유 분석에서 셀 마이그레이션을 연구하고 배아 세포 16, 17, 20 차별화에 juxtacrine 및 paracrine 신호의 효과를 검토하는 셀의 배열을 인쇄하여이 기능을 보여주었습니다. 세포 외 기질 28 일, 마이크로 유체 장치 25 층류로 잉크젯 프린팅 29과 패턴의 패턴 등 다른 방법,, 26도 세포를 현지화하는 데 사용되었습니다. 다른 방법은 세포의 잘 정의 된 패턴을 달성하기위한 효과적인 방법이며, 종종 단일 셀 정밀도를 얻을 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법은 매우 전문 장비 및 / 또는 청정실 시설을 이용할 수는 PR에 사용 된 우표를 조작 할 필요INT 세포 외 기질 단백질 또는 microfluidics 장치를 생산하고 있습니다. 전원 공급 장치, 주사기 펌프, 및 다른 외부 구성 요소에 그들의 연결은 또한 작동하는 데 필요한 장비와 사용자의 기술과 관련된 비용으로 인해 구현을 방해.

미래의 응용 프로그램의 관점에서 우리는 우리의 방법은 세포의 움직임과 확산의 높은 처리량 분석뿐만 아니라 여러 세포 인구 중 조사 셀 셀 상호 작용을 활성화 문화 시스템을 개발하기 위해 도움이 될 것으로 기대합니다. 이 시점까지 우리 보고서는 한 번에 무늬가 세포의 몇 종류의 상호 작용을 조사에 초점을 맞추고 있습니다. 그러나, 세포의 많은 subpopulations는 하나의 세포 배양 설정에서 함께 성장 많은 세포 유형의 paracrine과 juxtacrine 신호의 영향을 조사하기위한 일반적인 피더 레이어로 배양 될 수 있다고 생각할 수 있습니다. 의 마지막으로, 조직 공학 응용 프로그램은 자주 필요한 공간 현지화하나 이상의 셀 유형입니다. 그것은 더 많은 생리 학적 관련성이 높은 조직 엔지니어링 질병 모델을 제작하거나, 임상 응용 프로그램에 대한 implantable 자료에 패턴 세포에하기 위해 패턴 셀에서 사용하기위한 우리의 기술을 적용 할 수도 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 재정 이익을 경쟁 없습니다.

Acknowledgments

JBW에 대한 :;이 작품은 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 재단, Beyster 재단, 학부 연구 기회 (UROP) ATA와 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원 학생 연구 휄로 십 (2,010,101,926. ID 부여없이 당선 0718128) 여름 프로그램에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran 500,000 kDa Pharmacosmos, Denmark
Polyethylene Glycol 35,000 kDa Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3 ATCC, Manassas, VA
Cell Tracker Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM Gibco, Carlsbad, CA
RPMI Gibco, Carlsbad, CA
F12 Gibco, Carlsbad, CA
Fetal Bovine Serum Gibco, Carlsbad, CA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hatti-Kaul, R. Aqueous two-phase systems : methods and protocols. Methods in biotechnology. xiii, Humana Press. 440 (2000).
  2. Albertsson, P. A. k Partition of cell particles and macromolecules: separation and purification of biomolecules, cell organelles, membranes, and cells in aqueous polymer two-phase systems and their use in biochemical analysis and biotechnology. 3rd ed, Wiley. 346 (1986).
  3. Yamada, M., et al. Continuous cell partitioning using an aqueous two-phase flow system in microfluidic devices. Biotechnol. Bioeng. 88, (4), 489-494 (2004).
  4. Soohoo, J. R., Walker, G. M. Microfluidic aqueous two phase system for leukocyte concentration from whole blood. Biomed. Microdevices. 11, (2), 323-329 (2009).
  5. Hahn, T., Hardt, S. Concentration and size separation of DNA samples at liquid-liquid interfaces. Anal. Chem. 83, (14), 5476-5479 (2011).
  6. Hatti-Kaul, R. Aqueous two-phase systems. A general overview. Mol. Biotechnol. 19, (3), 269-277 (2001).
  7. Hustedt, H., Kroner, K. H., Menge, U., Kula, M. -R. Protein recovery using two-phase systems. Trends in Biotechnology. 3, (6), 139-144 (1985).
  8. Keating, C. D. Aqueous Phase Separation as a Possible Route to Compartmentalization of Biological Molecules. Acc Chem. Res. 45, (12), 2114-2124 (2012).
  9. Helfrich, M. R., et al. Partitioning and assembly of metal particles and their bioconjugates in aqueous two-phase systems. Langmuir. 21, (18), 8478-8486 (2005).
  10. Diamond, A. D., Hsu, J. T. Prote. Partitioning in PEG/Dextran Aqueous Two-Phase Systems. AIChE Journal. 36, (7), 1017-1024 (1990).
  11. Y-T,, Zhu, Z. -Q. Modeling of interfacial tension of aqueous two-phase systems. Chemical Engineering Science. 54, (4), 433-440 (1999).
  12. Liu, Y., Lipowsky, R., Dimova, R. Concentration dependence of the interfacial tension for aqueous two-phase polymer solutions of dextran and polyethylene glycol. Langmuir. 28, (8), 3831-3839 (2012).
  13. Rha, C. Interfacial Tension of Polyethylene Glycol/Potassium Phosphate Aqueous Two-Phase Systems. Physics and Chemistry of Liquids: An International Journal. 38, (1), 25-34 (2000).
  14. Fang, Y., et al. Rapid Generation of Multiplexed Cell Cocultures Using Acoustic Droplet Ejection Followed by Aqueous Two-Phase Exclusion Patterning. Tissue Eng. Part C. Methods. 18, (9), 647-657 (2012).
  15. Tavana, H., et al. Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells. Nat. Mater. 8, (9), 736-741 (2009).
  16. Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches. Adv. Mater. 22, (24), 2628-2631 (2010).
  17. Tavana, H., et al. Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. (2011).
  18. Tavana, H., Takayama, S. Aqueous biphasic microprinting approach to tissue engineering. Biomicrofluidics. 5, (1), 13404 (2011).
  19. Frampton, J. P., et al. Precisely targeted delivery of cells and biomolecules within microchannels using aqueous two-phase systems. Biomed. Microdevices. 13, (6), 1043-1051 (2011).
  20. Hossein Tavana, K. K., Bersano-Begey, T., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. Rehydration of Polymeric, Aqueous, Biphasic System Facilitates High Throughput Cell Exclusion Patterning for Cell Migration Studies. Advanced Functional Materials. 21, (15), 2920-2926 (2011).
  21. Falconnet, D., et al. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27, (16), 3044-3063 (2006).
  22. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Eng. 13, (8), 1879-1891 (2007).
  23. Ringeisen, B. R., et al. Jet-based methods to print living cells. Biotechnol. J. 1, (9), 930-948 (2006).
  24. Wright, D., et al. Generation of static and dynamic patterned co-cultures using microfabricated parylene-C stencils. Lab Chip. 7, (10), 1272-1279 (2007).
  25. Takayama, S., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, (10), 5545-5548 (1999).
  26. Berthier, E., et al. Pipette-friendly laminar flow patterning for cell-based assays. Lab Chip. 11, (12), 2060-2065 (2011).
  27. Davidson, R. L., O'Malley, K. A., Wheeler, T. B. Polyethylene glycol-induced mammalian cell hybridization: effect of polyethylene glycol molecular weight and concentration. Somatic Cell Genet. 2, (3), 271-280 (1976).
  28. Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).
  29. Moon, S., Lin, P., Keles, H. O., Yoo, S., Demirci, U. Title Cell Encapsulation by Droplets. J. Vis. Exp. (8), e316 (2007).
수성 2 단계 시스템을 사용하여 셀 공동 문화 패턴
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems. J. Vis. Exp. (73), e50304, doi:10.3791/50304 (2013).More

Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems. J. Vis. Exp. (73), e50304, doi:10.3791/50304 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter