Summary
כאן אנו מתארים טכניקת microdissection אחרי הזרקת הצבע פלואורסצנטי לגנגליון אקוסטית של עוברי חומוס מוקדמים לאיתור סלקטיבי של סיבים שמיעתיים האקסון בעצבים והמוח האחורי.
Abstract
האפרוח העוברי הוא מודל שימוש נרחב למחקר של תחזיות תא גנגליון היקפיות ומרכזיות. במערכת השמיעה, תיוג סלקטיבית של אקסונים שמיעתיים בתוך עצב גולגולת המחנה השמיני היה לשפר את המחקר של התפתחות מעגל שמיעתי המרכזית. גישה זו מאתגרת, כי אברי חישה מרובים של האוזן הפנימית לתרום לעצב המחנה השמיני 1. יתרה מזאת, סמנים שמבדילים אמין שמיעתי לעומת קבוצות שיווי משקל של אקסונים בתוך עצב המחנה השמיני עופות עדיין לא זוהו. מסלולים שמיעתיים ושיווי משקל לא ניתן להבדיל באופן פונקציונלי בעוברים מוקדמים, כתגובה חושית מעוררת אינן נוכחת לפני המעגלים נוצרים. אקסונים עצב מחנה שמיניים מרכזי מקרינים אותרו בחלק מהמחקרים, אבל תיוג האקסון השמיעתי לווה על ידי תיוג ממרכיבי עצב מחנה שמיני אחרים 2,3. כאן, אנו מתארים שיטה למעקב האנטרוגרד מגנגליון אקוסטי לסלקטיבי Labeאקסונים שמיעתיים הליטר בתוך המחנה השמיני העצבים המתפתחים. ראשית, לאחר נתיחה חלקית של אזור cephalic הקדמי של עובר אפרוח 8-יום שקוע בנוזל השדרתי מלאכותי חומץ, את צינור השבלול מזוהה על ידי ציוני דרך אנטומיים. בשלב בא, micropipette זכוכית משך קנס ממוקם להזריק כמות קטנה של rhodamine dextran אמין לאזור העמוק הדביק וצמוד בו תאי גנגליון אקוסטיים נמצאים. בתוך שלושים דקות לאחר ההזרקה, אקסונים שמיעתיים הם נעוצים מרכזיים למוח האחורי, ומאוחר יותר ניתן דמיינו לאחר הכנה היסטולוגית. שיטה זו מספקת כלים שימושיים למחקרים התפתחותיים של ציוד היקפי להיווצרות מעגל שמיעתי מרכזית.
Protocol
1. הכן את כלי הנתיחה בעקבות ריאגנטים
- נוזל השדרתי מלאכותי (aCSF; 130 המ"מ NaCl, 3 המ"מ KCl, 1.2 mM KH 2 4 ת.ד., 20 המ"מ 3 NaHCO, 3 HEPES מ"מ, גלוקוז 10 מ"מימ, 2 המ"מ CaCl 2, 1.3 המ"מ 4 MgSO) חדור ברציפות עם 95% O 2/5% CO 2 בטמפרטורת חדר. לעירוי, למלא כדי 2/3 צנצנת 500 מ"ל Nalgene פה רחב עם חור במכסה. טנק יצורף בצינור לזכוכית גזע bubbler, החודר את aCSF דרך החור במכסת הצנצנת. התאם לחץ להשגת זרם בלתי פוסק של בועות שמגיעות כ 1/3 מכמות הנוזלים, אבל הם לא חזקים מספיק כדי לגרום להתזה מעל לשפה. הצף 5 בקבוקוני זכוכית מ"ל (עד 6) לצנצנת Nalgene להפריד דגימות בודדות אחד מהשני וממערבולות זרימת הגז. ACSF יש חמצן במשך לפחות 20 דקות לפני כל דגירת רקמות.
- מנת נתיחת סיליקון קטנה (35 x 10 מ"ממצופה מ"מ פטרי באמצעות Sylgard Elastomere קיט) עם שתי סיכות נתיחה להציב לתוך קלקר משושה קטן (47 מ"מ תחתון) שוקל סירה.
- שני מלקחיים-מחט דקה, אחד קצה מעוגל מלקחיים, כוס מ"ל 50, ומכל לפסולת רקמות.
- משך הזכוכית micropipette (1.2 OD / 0.9 ID) נשבר לכ 20-50 מיקרומטר פתיחה בקצה ומלא בrhodamine dextran אמין (RDA, MW = 3000, Invitrogen) בפתרון 6.25% עם 0.4% Triton X-100 ב PBS . צרף ידי צינור דק לpicospritzer ולייצב לmicromanipulator.
2. מייקרו נתיחה כדי לחשוף פטמית basilar בE8 4,5
- עם מלקחיים מעוקלים, לחתוך E8 עובר מתחת לגזע המוח, מניח את הראש ישירות על גבי צלחת נתיחת סיליקון מצופה במשקל סירה.
- שימוש בסיכות נתיחה, למקם את הראש עם נוף גחון כך האוזן בצד של עניין היא מעט גלויה, הראש מוטה מעט dorsally ומצביע מרחק 10-30 מעלות מcenter (איור 2 א). מייד לאבטח את הראש עם סיכות. אם הבילטרלי מעקב הוא רצוי, מרכז הראש ב0 מעלות, או נוף גחון מלא, כך ששני הצדדים יכול להיות נגיש. בדומה לכך, להזרקת צד שמאל, לאבטח את הראש ב-10 מעלות ל-30 ממרכז כך בצד השמאל הוא נגיש.
- שימוש בכוס המ"ל 50, להעביר 30 מ"ל של aCSF חומץ לתוך התבשיל, משקע את הרקמה באופן מלא.
- עדינות לתפוס ולקלף את הלסת התחתונה באמצעות מלקחיים-מחט דקה, ואז להסיר את העפעף התחתון בצד של עניין.
- הסרת רקמת כלי הדם שמעליו, לרבות כל חיך וושט שנותר. רקמות רכות אלה צריכות לקלף חושפות את משטח החלק של פיתוח chondrocranium עם עורקי החוליות הייחודיים בשטח שלו. בשלב זה, מסת otoconial הלבנה האופיינית צריכה להיות גלויה.
- זהירות לנתח את העור סביב meatus החיצוני, הסחוס של מפרק הלסת, והאוזן התיכונה תוך השארה באוזן נר שלמה. השתמש במלקחיים בעדינות כדי לחתוך מבני סחוס אלה.
- הסר עורקי חוליות ודם וריכוז באמצעות תנועה גורפת עדינה עם טיפי מלקחיים העדינים. דם יכול לטשטש נוף וקרישה עשויה לסתום את פתח פיפטה הזרקה.
- צינור השבלול עם האפיתל סמוך חושי (basilar פטמית) וגנגליון אקוסטית נמצא ישירות מתחת chondrocranium 6 ויכול להיות דמיינו כמו הקרנת אצבע דמוית מוארכת המשתרעת מהאוזן הפנימית ventrally, עם הדיסטלי ביותר טיפ (שיא) ליד הקדמי קו אמצע 5. אולי יש איגום קטן של דם (אדום) מהנתיחה ו / או הסתיידויות otolithic (לבן) בקודקודו של צינור השבלול (איור 2 ב ') שיכול לסייע בהדמיה. בשיא היא המקולה lagenar, תיקון חושי חשב להיות פונקציה של שיווי משקל 7,8.
3. תיוג סלקטיבי של סיבים שמיעתיים שמיניים CN
- לאט לאט להוריד את micropipette לנקב 1 הגולגולת. אזור גולגולת זו הוא דק יותר מאזורים סמוכים ודורש פחות כוח לחדור. Micropipette צריך עכשיו להיות בתוך צינור השבלול. אופציונלי: זריקה קטנה של העתקת צבע יכולה להתבצע כאן כדי לסייע בהמחשת פטמית הבסיס.
- מבלי למקם מחדש את micropipette, להמשיך ולהוריד עד שהוא רק פרות הגבול העמוק של צינור השבלול (איור 1). לבצע הזרקה כאן ולחזור בכמה אזורים לאורך basilar פטמית (התרשימים 2C, 2D), למעט הקצה הפרוקסימלי ביותר בי lagena שיווי המשקל הוא ממוקם. עם picospritzer נקבע בין 10-30 psi, כמה זריקות נעשות. נפחיו של נוזל צבע מוזרק משתנים, ותלויים במידה של תיוג רצוי. כל זריקה אמורה לגרום פלורסנט לצבוע להנקודת beled של כ 200-400 קוטר מיקרומטר (האיור 2D).
- לאחר ההזרקה היא מוחלטת, להשתמש במלקחיים ויחצו המדגם מעל גזע המוח ולהשתמש פיפטה העברה למקום חלק הזנב לתוך צנצנת קטנה בתוך המכל של aCSF הרף perfused עם 95% O 2/5% CO 2.
- לכל עוברים, לאפשר 20-30 דקות להעברת צבע, בהתאם למרחק ממרכז המעקב הרצוי.
- הסרת רקמה ולהתכונן לחתך היסטולוגי. בדוגמא שמוצגת כאן, רקמה היא שקועה בparaformaldehyde 4% (ב1X PBS) סוכרוז הלילה, 30% (ב1X PBS) למשך הלילה.
4. Counterstaining וניתוח
- Counterstaining שימושי שיעזרו לכוון את הצופה למיקום האנטומי כמו גם לזהות אזורים מסוימים של עניין. Counterstain יעיל בהכנה הזאת היא immunolabeling neurofilament (איורים 1, 3B, 3E), אשר בתוקף labels אקסונים ומאפשר לתיחום של שטחי axonal במערכת העצבים המרכזיים.
- ניתוח צריך להתבצע בכל האזור שכותרתו, כמו את התחזיות יכולות להאריך כמה מאה מיקרונים או יותר לאורך ציר rostrocaudal. להלן כמה דוגמאות לניתוחים בסיסיים הן: שיעורי שגיאת מיקוד, עיתוי ו / או שינויים בסטייה של דפוסי הקרנה. אקסונים RDA כותרת-הם דמיינו במערכת העצבים ההיקפית ומרכזית ברזולוציה גבוהה (3A דמויות, 3D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המרכיבים של עצב המחנה השמיני ואת האנטומיה של העצב עצמו מורכבים ומפותלים (איורים 1, 3). על ידי התחקות סיבים הנובעים מתאי הגנגליון אקוסטיים סלקטיבי, קטעים של עצב המחנה השמיני, כמו גם afferents השמיעתי העיקרי בתוך גזע המוח ניתן לייחס באופן נקי ונבדלים ממקביליהם שיווי משקל (איורים 2, 3). כמו כן, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור תחזיות היקפיות של תאי הגנגליון אקוסטיים (איור 3G), או שונה ללמוד תחזיות נובעות מאיברי שיווי משקל בודדים. בגלל האקסונים הם נעוצים נקיים לכל אורכם, ניתוחים כמותיים מדויקים ניתן לבצע הבחנה שמיעתית מתחזיות שיווי משקל במהלך התפתחות, כולל תזמון מדויק ודפוסים של עצבוב ראשוני, שיעורי שגיאת מיקוד, וכו 'כמו כן, בניגוד לגישה הקודמת של תיוג סיבים שמיעתיים, גישה זו היא ביצועיםתרופה על רקמות שאינן קבועות, פרנסה ובכך ניתן להשתמש בו זמנית לשני ניסויים במבחנה.
למרות שטכניקה זו מתאימה לעוברים מE6-E9, תוצאות הטובות ביותר להתחיל בE8 כאשר אקסונים שמיעתיים שinnervated היעדים המרכזיים העיקריים שלהם 3. לעומת זאת, תחזיות סטיבולריות מגיעות בגזע מוח 9,10 מוקדם יותר ובכך תשמשנה כמועמדים טובים יותר לאיתור מוקדם יותר, אם כי מאתגר מבחינה טכנית בשל גודלו הקטן יחסית והחוסר בגרה של מנגנון שיווי המשקל בגיל זה. סעיפים היסטולוגית יש לבחון כדי לאשר את המיקום של הזרקת צבע, כהאפיקלי ביותר של אזור פטמית basilar מכיל תיקון חושי קטן חשב להיות פונקציה של שיווי משקל ואם כותרתו עלולה לזהם את התוצאות.
ברגע שהחוקר הוא מכיר את האנטומיה, שלוש מהבעיות הנפוצות ביותר שבם נתקלו הנם כדלקמן:
- השבלול duct מלא בהתחקות צבע, אבל האקסונים של תאי הגנגליון אינם מסומנים. בעיה זו צפויה מצביעה על כך שהזריקה לא בוצעה עמוקה לצינור השבלול, שבו תאי גנגליון וסיב עצב מתגוררים. בעיה זו עלולה להיות מתוקנת על ידי הבטחה כי נקבי הזרקת micropipette 1 chondrocranium, אז הוא מתקדם בעדינות כדי לנקב רק דרך הצד השני של הצינור. לחלופין, פיפטה ההזרקה ייתכן שממוקמת כראוי אך נמסרה כמויות בלתי מספיקות של צבע. הגדלת לחץ הזרקה או מספר הזריקות יכולה גם להתגבר על בעיה זו.
- עצב הצניעות הצטלב בטעות כתוצאה ממשייכת יתר במבוך הסחוסים במהלך נתיחה. קושי זה יכול להימנע על ידי שימוש בטכניקות עדינות נתיחה ונתיחה מוגבלת של האוזן התיכונה.
- ההזרקה היא נרחבת מדי וטעות תוויות בתאים אחרים חושיים גנגליון או סיבים הנובעים ממרכיבי עצב אחרים. ההיא בעיה ניתן למזער על ידי אופטימיזציה של פרוטוקולי הזרקה, ועשוי לדרוש הפחתת לחץ ההזרקה או מספר הפעימות, או הסטת המיקום של זריקות.
שתי דוגמאות של ניתוחים פוטנציאליים הן:
- סטייה של דפוסי הקרנה: קובעת את המידה של אקסונים שהכותרת לאורך ציר מסוים וכיצד הם עשויים להיות מושפעים הניסויים הבאים. סטיית Rostrocaudal ניתן לתאר:
(קטעים המכילים מספר האקסונים שכותרתו) (עוביו של כל סעיף) x צעד זה עשוי להיות מתוקן למידה של תווית לצבוע כאחוז מbasilar פטמית, או ברקמות counterstained, לשיעור של אקסונים עצב המחנה השמיני שכותרתו. זה הוא כלי שימושי לניתוח תחזיות טופוגרפיות, כפי שניתן לייחס את האקסונים שהכותרת נקיה לשדותיהם במסוף המוח האחורי. למדידות של tonotopy, זריקות צבע צריכות להיות מוגבלות לאזור של עניין לאורך basilar גבשושיות.
- מיקוד שגיאות: קובע את התדירות של אקסונים mistargeted לכל אזור נקבע מראש של רקמה מנותחת (יכול להיות לסעיף, לעובר, וכו '). הפרעות עלולות לגרום לאקסונים בעקבות נתיב הקרנה נורמלית או הפסקה באזור שאינו הולם. כאשר כימותי שגיאות, מספרים צריכים להיות מנורמלים לחשבון לפערים בסכומי הזרקה בין עוברים. זריקות קטנות יותר יש סיכוי גבוהות יותר לגרום ליכולת להבקיע אקסונים בודדים. ניתוח שגיאת מיקוד בסיסי ניתן לתאר:
איור 1. נוף עטרה של E6 גזע מוח לפישוט עםגרעינים הבילטרלי אקוסטית ללא פגע. פיפטה האדומה Schematized ממחישים מדויקים מיקוד של תאי הגנגליון אקוסטיים מנקודת כניסת דורסולטרלי. מקטעי immunolabeled עם אנטי neurofilament להדגיש תחזיות axonal. איברי שיווי משקל הם מקוריים לקטעים המוצגים. האזור של הזרקת RDA עבור סיבים שמיעתיים סלקטיבית Tracing הפגין עם איור פיפטה האדומה. ח = vestibulocochlear עצב, AG = גנגליון אקוסטי, VG = גנגליון שיווי משקל. הגבה הוא למעלה. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר.
איור 2. Microdissection והזרקה לאזור מיקוד. () עמדה ראויה של עובר על צלחת נתיחה, נוף גחון עם ראש מוטה dorsally ופנו מעט לצד כדי לאפשר גישה טובה יותר לצד ימין. דואר ימניar מוצג ופטמית basilar בסיסית מסומנת בקו מקווקו. ראש החץ ב() ו (ב) ממחיש את העמדה ראשונית של (B) נתיחת פיפטה ההכנסה להלן, מסת otoconial לבנה גלוי לעין, התוחם את גבול הקודקוד של basilar פטמית (חץ). (C, D) ההזרקה ראשונה אמורה לספק קווי מתאר של צינור השבלול. (ד ') זריקות עוקבות צריכות להיעשות רק עמוק לפטמית הדביקה וbasilar השבלול אל אזור גנגליון אקוסטית. פלואורסצנטי RDA שימושי בתפיסת עומק הזרקת שיפור וכל הזרקת אדם צריכה ליצור נקודת צבע כותרת-ניאון של כ 200 - מיקרומטר קוטר 400 כפי שניתן לראות כאן. סרגל קנה מידה = 2 מ"מ.
Figure 3. תמונות מייצגות של סיבים השמיעתיים סלקטיבית התחקות בE8 עובר. (AC) צריכת חשמל נמוך וכוח (DG) בגובה של 25 מיקרומטר סעיפי עטרה שנאספו מאותו העובר במישורים שונים. () האקסונים RDA כותרתו יכולים להיות נעוצים מאתר הזרקה (ראש החץ ), דרך עצב הגולגולת (חץ) וcaudally לעבר מטרות גרעינים השמיעתיים הראשוניות (ראש החץ כפול). (ב) Immunolabeling עם פסי נוגדנים נגד neurofilament כל תחזיות axonal וסיבי RDA לייחס-מ () נמצאות בהשלכה השמיעתית מסלול. שכבה של נפרד () ו (ב) ערוצים מוצגים כצבע להתמזג ב( C). תמונה (DF) גבוהה כוחו של אותו העובר בעמדת זנב יותר מדגימה () ברזולוציה גבוהה של סיבים בנקודת כניסת העצב ( חץ) ולאורך המסלול המרכזי (ראש החץ כפול). (E) </ Strong> Neurofilament כתם של כל האקסונים מאפשר תיחום PNS-CNS כמו גם שמיעה משוערת לעומת תחזיות שיווי משקל. Ap והסמנכ"ל מצביעים שמיעתי מתאימים ורכיבים היקפיים לשיווי משקל נקודת כניסת העצב, בעוד Ac וVc מצביעים שמיעתי מתאימים ותחזיות שיווי משקל מרכזית לנקודת הכניסה בעצבים. שכבה של נפרד (D) ו( E) ערוצים מוצגים כצבע להתמזג ב( F). (G) בדיקה היסטולוגית של גנגליון אקוסטית מגלה מיקום של תאי הגנגליון אקוסטיים שכותרת ממעקב שמוצג ב( AF) והתחזיות ההיקפיות ( כוכבי) הם נעוצים retrogradely לפטמית basilar. (H) איור של מסלול 700 מיקרומטר התחקות צפוי עם תיוג שמיני שמיעתי ספציפי בE8. אתר הזרקה (העיגול אדום) הוא זנב לנקודת כניסה בעצבים, ותחזיות מרכזיות לנסוע מקוריות וcaudally פעם אחת במוח האחורי. Vp = אפוד היקפיibular, Ap = היקפי שמיעתי, VC = מרכזי שיווי משקל, Ac = מרכזי שמיעתי, AG = גנגליון אקוסטי, BP = basilar פטמית, LM = המקולה lagenar, SVG = גנגליון שיווי משקל מעולה, IVG = גנגליון שיווי משקל נחות. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר לAC, 100 מיקרומטר לDF, 100 מיקרומטר בG ו 500 מיקרומטר בשעות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקרים על ההתפתחות המוקדמת של עצב המחנה השמיני היו מוגבלים בחלקו בשל הקושי בזיהוי האקסונים עובריים הנובעים מגרעינים מובחנים מרובים. מספר מחקרים בחנו את האותות המולקולריים המנחים שמיעתי ותא חושי שיווי משקל וגורל תאי הגנגליון במהלך ההתפתחות המוקדמת, אבל 5,11,12 התהליכים ויסות עצבוב מרכזי עדיין לא נקבעו. דיווחים על תחזיות תא גנגליון אקוסטיים בדרך כלל מתארים את התהליכים היקפיים לאפיתל חושי 13-15, ואילו פחות ידוע על התהליכים המרכזיים מקרינים לגרעין ראשוני. מחקרים מרכזיים, מקרינים מחוזות VIII במהלך התפתחות עוברת הם לעתים קרובות אלקטרו, כגון הקלטות אופטיות במוח האחורי העוברי אפרוח 16 או הדמית הסידן בפרוסת רקמת יונקי 17, אך לא ניתן לבצע לפני השלמת מעגלים עצביים. השימוש בסמנים אימונולוגיים לתוויתאקסונים שמיעתיים בעצב המחנה השמיני החומוס הוא לא כרגע ריאליים. בעוד קבוצות שונות של גורמי שעתוק זוהו ואשר תואמים שמיעתי לעומת נוירונים שיווי משקל 18-23, הביטוי של הגורמים הללו נמצא מחוץ לאקסונים. בעכברים, נמצאו הבדלים בין גרעיני ספירלה וגרעיני שיווי משקל בביטוי גנים, כוללים כמה מועמדים מבטיחים שיכולים לבדל את צמיחת האקסון בין שיטות. מחקר נוסף של 23 מוצרי גן אלה עשוי להניב כלים חשובים למחקרים גם יונקים ועופות. עם השיטות שתוארו כאן, סיבים שמיעתיים ברקמת חיה עוברית עם מעגל שמיעתי שלם יכולים להיות נעוצים באופן סלקטיבי למטרות המרכזיות שלהם.
עובר העוף הוא מערכת החולייתנים שימושית במיוחד עבור ביולוגים התפתחותיים והוא מסוגל להתגבר על חלק מהמגבלות שנמצאו במערכות יונקים. רגולציה של דפוסים מוקדמים אוזן פנימיים והמורפוגנזה בציפור מראות דמיון מדהים ליונקים 1,12, בעוד עוברי חומוס גדולים יותר ויותר נגישים בקלות מעוברים מכרסמים בשלבים מוקדמים, כאשר מערכת השמיעה ההיקפית ונוצרה. השיטה שהוצגה כאן להעתקה סלקטיבית של סיבים שמיעתיים מסייעת ניסוי תחילה על התחזיות המרכזיות של האוזן הפנימית מתפתחת.
פתחנו פרוטוקול זה במאמץ באופן דיפרנציאלי כדי לזהות תחזיות שמיעתיות מרכזיות של עצב המחנה השמיני, אבל גם את זה ניתן לשנות באופן סלקטיבי לתייג סיבים מאיברי חישה אחרים של האוזן הפנימית. בניגוד לשיטות שתוארו לעיל, הליך זה מבוצע ברקמה חיה עם כל המעגל השלם. שיטה דומה בוצעה הייתה בשימוש כדי לתאר את התזמון של עצבוב מביא שמיני שמיעתי במהלך התפתחות עוברת עופות, עם זאת, סיבי שיווי משקל היו גם כותרתו בשוגג 3 הנה אנו מספקים שיטה לזהות בבירור אזור של או.igin וסיום, כמו גם ברזולוציה גבוהה של סיב בודדה בחר מרכזי, מקרינה afferents השמיעתי במהלך התפתחות עוברת חוליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים מוכרזים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לד"ר קנדיס היישה להצעות וסיוע בטכניקות הדמיה ודוריס ד"ר וו במומחיות על האנטומיה של אוזן פנימית אפרוח במהלך ההתפתחות עוברת מוקדם. עבודה זו נתמכה על ידי NSF IOS-0642346, NIH-T32 DC010775, NIH-T32 GM008620, NIH R01-DC010796, וDOE GAANN P200A120165.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene Weigh Dish | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| Petri Dish, 35 X 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | Use to make silicone dissection dish |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Coat Petri to make dissection dish |
| Dissection Pins | Various | Holds embryo in place during dissection | |
| NaCL | Various | part of aCSF recipe | |
| KCl | Various | part of aCSF recipe | |
| KH2PO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| NaHCO3 | Various | part of aCSF recipe | |
| Glucose | Various | part of aCSF recipe | |
| CaCl2 | Various | part of aCSF recipe | |
| MgSO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid |
| Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial | American Pharmaceutical Partners, Inc | 6332300105 | Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream |
| Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler | Various | Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF | |
| Glass stem bubbler | Various | To infuse carbogen into aCSF | |
| Curved-tip forceps | World Precision Instruments | 501008 | To remove embryo head from egg |
| Two fine-tip forceps | World Precision Instruments | 501985 | For micro-dissection |
| 50 ml Beaker | various | ||
| Rhodamine Dextran Amine (RDA) | Invitrogen | various | Fluorescent axon tracer |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
| Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) | Various | Standard lab reagent | |
| Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4" (100 mm) length | World Precision Instruments | TW120F-4 | Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes |
| Needle / Pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2 |
| Picospritzer | Parker Instrumentation | various | Attach by fine tubing to glass micropipette |
| Micromanipulator | Narishige | various | |
| Dissection microscope with fluorescence | Various | ||
| 4% Paraformaldehyde | Various | Standard lab reagent | |
| anti-Neurofilament antibody, optional | Millipore | AB1991 | Follow histological protocol recommended by manufacturer |
| Cryostat and associated materials for sectioning | Leica | various | |
| Epifluorescent microscope for imaging | Zeiss, various |
References
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139, 245-257 (2012).
- Pflieger, J. F., Cabana, T. The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica. Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).
- Molea, D., Rubel, E. W. Timing and topography of nucleus magnocellularis innervation by the cochlear ganglion. The Journal of Comparative Neurology. 466, 577-591 (2003).
- Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of Comparative Neurology. 368, 620-630 (1996).
- Brigande, J. V., Kiernan, A. E., Gao, X., Iten, L. E., Fekete, D. M. Molecular genetics of pattern formation in the inner ear: do compartment boundaries play a role. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11700-11706 (1073).
- Bellairs, R., Osmond, M. The atlas of chick development. , 2nd Edn, Elsevier. (2005).
- Manley, G. A., Haeseler, C., Brix, J. Innervation patterns and spontaneous activity of afferent fibres to the lagenar macula and apical basilar papilla of the chick's cochlea. Hearing Research. 56, 211-226 (1991).
- Code, R. A. Efferent neurons to the macular lagena in the embryonic chick. Hearing Research. 82, 26-30 (1995).
- Maklad, A., Fritzsch, B. Development of vestibular afferent projections into the hindbrain and their central targets. Brain Research Bulletin. 60, 497-510 (2003).
- Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Lineage analysis of inner ear cells using genomic tags for clonal identification. Methods Mol. Biol. 493, 47-63 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 521-533 (2007).
- Appler, J. M., Goodrich, L. V. Connecting the ear to the brain: Molecular mechanisms of auditory circuit assembly. Progress in Neurobiology. 93, 488-508 (2011).
- Bulankina, A. V., Moser, T. Neural circuit development in the mammalian cochlea. Physiology (Bethesda). 27, 100-112 (2012).
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 549-556 (2007).
- Momose-Sato, Y., Glover, J. C., Sato, K. Development of functional synaptic connections in the auditory system visualized with optical recording: afferent-evoked activity is present from early stages. Journal of Neurophysiology. 96, 1949-1962 (2006).
- Marrs, G. S., Spirou, G. A. Embryonic assembly of auditory circuits: spiral ganglion and brainstem. The Journal of Physiology. 590, 2391-2408 (2012).
- Milo, M., et al. Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear. PloS One. 4, e7144 (2009).
- Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).
- Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain. Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).
- Huang, E. J., et al. Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons. Development. 128, 2421-2432 (2001).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).
- Lu, C. C., Appler, J. M., Houseman, E. A., Goodrich, L. V. Developmental profiling of spiral ganglion neurons reveals insights into auditory circuit assembly. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 10903-10918 (2011).
