Rastreo Selectivo de Fibras auditivo en el nervio vestíbulo coclear aviar embrionarias

Summary

Aquí describimos una técnica de microdisección seguida de la inyección de tinte fluorescente en el ganglio de la acústica de los primeros embriones de pollo para el seguimiento selectivo de las fibras auditivas axones en el nervio y cerebro posterior.

Abstract

El embrión de pollo es un modelo ampliamente utilizado para el estudio de las proyecciones de células ganglionares centrales y periféricas. En el sistema auditivo, el etiquetado selectivo de los axones en el nervio auditivo craneal VIII aumentaría el estudio del desarrollo central de circuito auditivo. Este enfoque es un reto porque varios órganos sensoriales del oído interno contribuir al nervio VIII ^1. Además, los marcadores que distinguir confiablemente auditivo frente a los grupos vestibulares de los axones a la aviar nervio VIII aún no se han identificado. Vías auditivas y vestibular no pueden distinguirse funcionalmente en los embriones tempranos, como sensoriales evocados por las respuestas no están presentes antes de los circuitos se forman. Centralmente se proyectan axones del nervio VIII han sido localizados en algunos estudios, pero auditivo etiquetado axón fue acompañado por el etiquetado de otros componentes nerviosos VIII ^2,3. Aquí se describe un método para la anterógrada trazado del ganglio acústico para selectivamente label axones del nervio auditivo dentro VIII desarrollo. En primer lugar, después de la disección parcial de la región cefálica anterior de un embrión de pollo de 8-día sumergido en fluido cerebroespinal artificial oxigenado, el conducto coclear es identificado por puntos de referencia anatómicos. A continuación, una micropipeta fina tira de cristal está posicionado para inyectar una pequeña cantidad de rodamina dextrano amina en la región profunda del conducto y adyacente donde las células ganglionares de la acústicos se encuentran. Dentro de los treinta minutos después de la inyección, los axones auditivos se remontan centralmente en el cerebro posterior y más tarde se puede visualizar después de la preparación histológica. Este método proporciona una herramienta útil para los estudios de desarrollo de periféricos al centro de formación de circuito auditivo.

Protocol

1. Preparar las herramientas de disección tras y Reactivos

• Líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa; 130 mM NaCl, 3 mM de KCl, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 20 mM NaHCO _3, 3 mM de HEPES, 10 mM de glucosa, 2 mM CaCl _2, 1,3 mM MgSO ₄₎ continuamente infundido con 95% de O _2/5% CO ₂ a temperatura ambiente. Para la infusión, llene hasta 2/3 a 500 ml de boca ancha frasco Nalgene con un agujero perforado en la tapa. Tanque se fijan por medio de un tubo de vidrio vástago burbujeador, que penetra en el LCRa a través del agujero en la tapa del frasco. Ajustar la presión para obtener una corriente constante de burbujas que llegan a aproximadamente 1/3 del líquido, pero no son lo suficientemente fuerte como para causar salpicaduras sobre el borde. Sumergir 5 viales de vidrio ml (hasta 6) en el frasco Nalgene para separar las muestras individuales el uno del otro y de la turbulencia de flujo de gas. ACSF debe ser oxigenada durante al menos 20 min antes de cualquier tejido incubación.
• Silicona pequeña placa de disección (35 mm x 10mm recubierto de Petri utilizando Sylgard élastomère Kit) con dos pernos de disección colocados en poliestireno hexagonal pequeño (47 mm inferior) pesan barco.
• Dos pinzas de punta fina, una curva de punta de pinzas, un vaso de precipitados de 50 ml, y un contenedor para los residuos de tejido.
• Sacó micropipeta de vidrio (1,2 OD / ID 0,9) rota a aproximadamente 20-50 micras abertura en la punta y se llena con rodamina dextrano amina (RDA, MW = 3.000, Invitrogen) en una solución de 6,25% con 0,4% Triton X-100 en PBS . Conecte mediante un tubo fino para picospritzer y estabilizar a micromanipulador.

2. Micro-disección de revelar Papilla basilar en ^4,5 E8

1. Con pinzas curvas, corte E8 embrión justo debajo del tronco cerebral, colocando la cabeza directamente sobre la placa de disección recubierto de silicona dentro peso barco.
2. Con los pernos de disección, la posición de la cabeza con una vista ventral por lo que el oído del lado de interés es ligeramente visible, la cabeza ligeramente inclinada hacia dorsal y apuntando 10-30 grados fuera de center (Figura 2A). Inmediatamente fijar el cabezal con pernos. Si se desea una localización bilateral, el centro de la cabeza a los 0 grados, o una vista ventral completo por lo que ambas partes pueden tener acceso. Del mismo modo, para una inyección del lado izquierdo, asegurar la cabeza de -10 a -30 grados desde el centro de manera que el lado izquierdo es accesible.
3. Usando el vaso de precipitados de 50 ml, transferir 30 ml de LCRa oxigenada en el plato, sumergiendo completamente el tejido.
4. Pellizque suavemente hacia abajo y la cáscara de la mandíbula inferior con unas pinzas de punta fina, luego retire el párpado inferior del lado de los intereses.
5. Retire el tejido vascular suprayacente, incluyendo cualquier paladar restante y garganta. Estos tejidos blandos pueden despegarse revelar la superficie lisa de desarrollar condrocráneo con las arterias vertebrales distintivas en su superficie. En este punto, la característica masa otoconial blanco debe ser visible.
6. Diseccionar cuidadosamente la piel alrededor del meato externo, el cartílago de la articulación de la mandíbula, y el oído medio, mientras que en el dejandoner oído intacto. Utilice las pinzas para cortar suavemente lejos estas estructuras cartilaginosas.
7. Quite las arterias vertebrales y la acumulación de sangre mediante un movimiento de barrido suave con las puntas de las pinzas finas. La sangre puede oscurecer vista y la coagulación puede tapar la abertura de la pipeta de inyección.
8. El conducto coclear con epitelio adyacente sensorial (papila basilar) y el ganglio acústico encuentra directamente debajo de la condrocráneo ⁶ y se puede visualizar como una forma alargada en forma de dedo saliente que se extiende desde el oído interno ventralmente, con la punta más distal (ápice) cerca de la anterior línea media ^5. Puede haber una pequeña acumulación de sangre (roja) de la disección y / o calcificaciones otolíticos (blanco) en el vértice de la cóclea del conducto (Figura 2B) que puede ayudar en la visualización. En el vértice es la mácula lagenar, un parche sensorial cree que la función vestibular ^7,8.

3. Etiquetado selectiva de CN VIII fibras auditivas

1. Baje lentamente la micropipeta para perforar primero el cráneo. Esta región craneal es más delgada que las zonas circundantes y requiere menos fuerza para penetrar. La micropipeta ahora debe estar en el interior del conducto coclear. Opcional: una pequeña inyección de tinte trazado se puede hacer para ayudar en la visualización de la papila basilar.
2. Sin tener que reposicionar la micropipeta, seguir bajando hasta que sólo rompe la frontera profunda del conducto coclear (Figura 1). Realizar una inyección y repetir aquí en varias regiones a lo largo de la longitud de la papila basilar (figuras 2C, 2D), con exclusión de la punta más proximal donde la vestibular lagena se encuentra. Con la picospritzer establecido entre 10-30 psi, varias inyecciones se hacen. El volumen de fluido que se inyecta medio de contraste varía, y depende de la extensión de etiquetado deseado. Cada inyección debe dar lugar a un tinte fluorescente-lapunto Beled de aproximadamente 200 a 400 m de diámetro (Figura 2D).
3. Una vez que la inyección se ha completado, el uso de fórceps para seccionar la muestra por encima del tronco cerebral y el uso de una pipeta de transferencia para colocar la porción caudal en un pequeño frasco dentro del recipiente de LCRa continuamente se perfundieron con 95% O _2/5% CO _2.
4. Para cada embrión, 20-30 min para permitir la transferencia de colorantes, en función de la distancia del centro de trazado deseado.
5. Quitar el tejido y prepararse para el seccionamiento histológico. En el ejemplo que se muestra aquí, el tejido se sumerge en 4% de paraformaldehído (en 1X PBS) durante la noche sacarosa,% 30 (en 1X PBS) durante la noche.

4. Contratinción y Análisis

1. Contratinción es útil para ayudar a orientar al observador a la ubicación anatómica, así como la identificación de regiones particulares de interés. Una tinción de contraste eficaz en esta preparación es immunolabeling neurofilamentos (figuras 1, 3B, 3E), que fuertemente lAbels axones y permite la demarcación de las vías axonales en el SNC.
2. Análisis debe ser realizado en toda la región etiquetada, como las proyecciones pueden extenderse varios cientos de micras o más a lo largo del eje rostrocaudal. Algunos ejemplos de los análisis básicos son: las tasas de error de orientación, el tiempo y / o cambios en los patrones de divergencia de proyección. Axones marcados RDA-se visualizan en el sistema nervioso periférico y central con alta resolución (Figuras 3A, 3D).

Representative Results

Los componentes del nervio VIII y la anatomía del propio nervio son complejas y enrevesadas (Figuras 1, 3). Por selectivamente rastreo de fibras que surgen a partir de células ganglionares de la acústicos, los segmentos del nervio VIII, así como los aferentes primarios auditivas dentro del tronco encefálico puede ser limpiamente trazado y distinguirse de sus homólogos vestibulares (Figuras 2, 3). Del mismo modo, esta técnica podría ser utilizada para estudiar proyecciones periféricas de las células ganglionares de la acústicos (Figura 3G), o modificados para estudiar proyecciones individuales derivadas de órganos vestibulares. Debido a que los axones están claramente trazada a lo largo de toda su longitud, precisos análisis cuantitativos se pueden realizar auditiva distintiva de las proyecciones vestibulares durante el desarrollo, incluyendo la sincronización exacta y patrones de inervación inicial, dirigidos a las tasas de error, etc Además, a diferencia del enfoque anterior de etiquetado auditivo fibra, este enfoque es desempeñomed en no fijo, tejido vivo y por lo tanto se puede utilizar simultánea a otro en la experimentación in vitro.

Aunque esta técnica es adecuada para los embriones de E6-E9, los mejores resultados comenzará a E8 cuando los axones auditivos han inervado sus objetivos principales centrales ^3. En contraste, las proyecciones vestibulares llegar en el tronco cerebral anterior ^9,10 y serviría así como los mejores candidatos para el rastreo anterior, aunque técnicamente difícil debido al pequeño tamaño y relativa inmadurez del aparato vestibular a esta edad. Los cortes histológicos se examinaron para confirmar la localización de la inyección de medio de contraste, como la región apical, la mayoría de la papila basilar contiene un pequeño parche sensorial cree que la función vestibular y si la etiqueta potencialmente podrían contaminar los resultados.

Una vez que el investigador está familiarizado con la anatomía, tres de los problemas más comunes son como sigue:

• La du coclearct está lleno de rastreo de tinte, pero los axones de células ganglionares no están etiquetados. Este problema probablemente indica que la inyección no se realizó profunda al conducto coclear, donde las células ganglionares y fibras nerviosas residen. Este problema se puede corregir al garantizar que las punciones micropipeta de inyección de la primera condrocráneo, entonces se avanza suavemente con el fin de sólo punción a través del otro lado del conducto. Alternativamente, la pipeta de inyección puede haber sido colocado correctamente pero se entregan cantidades insuficientes de colorante. El aumento de la presión de inyección o el número de inyecciones también pueden superar este problema.
• El nervio se secciona inadvertidamente como consecuencia de una tracción excesiva en el laberinto cartilaginoso durante la disección. Esta dificultad se puede evitar mediante el uso de técnicas de disección finas y disección limitada del oído medio.
• La inyección es demasiado extenso y sin darse cuenta las etiquetas de otras células ganglionares sensoriales o fibras derivadas de componentes nerviosas. ThSe problema se puede minimizar mediante la optimización de los protocolos de inyección, y puede requerir la reducción de la presión de inyección o el número de impulsos, o cambiando la ubicación de las inyecciones.

Dos ejemplos de los análisis posibles son:

1. La divergencia de los modelos de proyección: determina la extensión de axones marcados a lo largo de un eje determinado, y cómo les puede afectar la experimentación siguiente. Rostrocaudal divergencia puede ser descrito como:

(Número de secciones que contiene axones marcados) x (grosor de cada sección) Esta medida se puede corregir para la extensión de la etiqueta de colorante como una proporción de la papila basilar, o en el tejido counterstained, para la proporción de los axones del nervio VIII etiquetados. Esta es una herramienta útil para analizar las proyecciones topográficos, como los axones marcados pueden ser limpiamente trazadas a sus campos terminales en la parte posterior del cerebro. Para las mediciones de tonotopy, inyecciones de colorante se debe limitar a la región de interés a lo largo de la basilar papila.

2. Errores de focalización: determina la frecuencia de los axones mistargeted para cada región predeterminada de tejido analizado (puede ser por sección, por embrión, etc.) Las perturbaciones pueden resultar en los axones después de una ruta de proyección anormal o que termina en una región no apropiado. Al cuantificar los errores, los números deben ser normalizados para tener en cuenta diferencias en cantidades de inyección entre los embriones. Más pequeñas inyecciones son más probable que resulte en la habilidad para anotar los axones individuales. Un análisis básico de focalización error puede ser descrito como:

Figura 1. Vista coronal del tronco cerebral E6 de simplificación conganglios acústica bilateral intacta. esquematizada pipeta rojo ilustra una orientación precisa de las células ganglionares de la acústica de un punto de entrada dorsolateral. Las secciones se immunolabeled con anti-neurofilamentos para resaltar las proyecciones axonales. Órganos vestibulares son rostral a secciones mostradas. Región de la inyección de dosis diaria recomendada de fibra auditiva selectiva rastreo demostrado con ilustración pipeta rojo. VIII nervio vestíbulo coclear =, AG = ganglio acústico, VG = ganglio vestibular. Dorsal está arriba. Barra de escala = 300 micras.

Figura 2. Microdisección y la inyección de región de destino. (A) posición apropiada del embrión en el plato de disección, vista ventral con la cabeza inclinada hacia dorsalmente y se volvió ligeramente hacia un lado para permitir un mejor acceso a la parte derecha. Derecha ear se muestra y papila basilar subyacente se indica con una línea discontinua. Punta de flecha en (A) y (B) ilustra la posición inicial de la pipeta de inserción (B) Después de la disección, una masa otoconial blanco es visible, delimitando el borde apical de la papila basilar (flecha). (C, D) Primera inyección debe proporcionar una el contorno del conducto coclear. (D) inyecciones posteriores deben hacerse justo por debajo de la papila del conducto coclear y basilar en la región del ganglio acústico. Fluorescencia RDA es útil en la mejora de la percepción de profundidad de inyección y cada inyección individual debe crear una mancha fluorescente marcada con colorante de aproximadamente 200 a 400 m de diámetro como se ve aquí. Barra de escala = 2 mm.

Figura 3. Imágenes representativas de fibra auditiva selectiva rastreo en un embrión E8. (AC) Y BAJA POTENCIA (DG) de alta potencia 25 micras secciones coronales recogidas del mismo embrión en diferentes planos. (A) RDA etiquetados axones pueden ser rastreados desde el sitio de inyección (punta de flecha ), a través del nervio craneal (flecha) y caudalmente hacia los objetivos núcleos primarios auditivas (doble punta de flecha). (B) inmunomarcaje con reflejos de anticuerpos anti-neurofilamentos todas las proyecciones axonales y las fibras trazados RDA-de (A) están dentro de la proyección auditivo vía. Superposición de separado (A) y (B) canales mostrados como un color se funden en (C). (DF) Imagen de alta potencia del mismo embrión en una posición más caudal muestra (A) de alta resolución de las fibras en el punto de entrada del nervio ( flecha) y a lo largo de la vía central (punta de flecha doble). (E) </ Strong> neurofilamentos mancha de todos los axones permite demarcación de PNS-CNS, así como auditivo putativo frente a proyecciones vestibulares. Ap y Vp indicar auditivo respectivos componentes y vestibulares periféricos hasta el punto de entrada del nervio, mientras que Ac y Vc indican auditivo respectivo y proyecciones vestibulares centrales para el punto de entrada del nervio. Superposición de separado (D) y (E) canales mostrados como un color se funden en (F). (G) El examen histológico del ganglio acústica revela la ubicación de la etiqueta de las células ganglionares de la acústicos (rastreo se muestra en (AF) y sus proyecciones periféricas asterisco) se trazan forma retrógrada a la papila basilar. (H) de una vía de 700 micras rastreo auditivo espera con rotulación específica VIII a E8. Lugar de la inyección (círculo rojo) está a punto de nervio caudal de entrada, y las proyecciones centrales viajar rostral y caudalmente una vez en la parte posterior del cerebro. Vp = chaleco periféricoibular, Ap = periférico auditivo, Vc = vestibular central, Ac = auditivo central, AG = ganglio acústico, BP = basilar papila, LM = mácula lagenar, SVG = ganglio vestibular superior, IVG = vestibular ganglio inferior. Barra de escala = 300 m para AC, 100 m para DF, a 100 micras y 500 micras G en H.

Discussion

Estudios sobre el desarrollo temprano del nervio VIII se han limitado, en parte debido a la dificultad en la identificación de los axones embrionarias derivadas de los ganglios de distinta múltiple. Varios estudios han explorado las señales moleculares que guían auditivo y vestibular célula sensorial y destinos de células ganglionares durante el desarrollo temprano, ^5,11,12 pero los procesos que regulan la inervación central tienen todavía por determinar. Informes de acústicos proyecciones de células ganglionares típicamente describen procesos periféricos a ^13-15 epitelio sensorial, mientras que se sabe menos sobre los procesos centrales que se proyectan hacia núcleos primarios. Estudios de forma centralizada salientes subdivisiones VIII durante la embriogénesis son a menudo electrofisiológicos, tales como grabaciones ópticas en cerebro posterior de embriones de pollo ¹⁶ o imágenes de calcio en una lámina de tejido de mamífero ¹⁷ pero no se puede realizar antes de la finalización de los circuitos neuronales. El uso de marcadores inmunológicos de etiquetaaxones en el nervio auditivo chica VIII no es actualmente factible. Mientras que distintos grupos de factores de transcripción se han identificado y que se correlacionan con auditivo frente a las neuronas vestibulares ^18-23, la expresión de estos factores está excluido de los axones. En ratones, se han encontrado diferencias entre los ganglios en espiral y en los ganglios vestibular en la expresión de genes, incluyendo algunos candidatos prometedores que podrían diferenciar entre las modalidades de crecimiento del axón. ²³ El estudio adicional de estos productos génicos pueden producir herramientas importantes para estudios tanto de mamíferos y aves. Con los métodos descritos aquí, fibras auditivas en el tejido vivo de embriones con un circuito auditivo intacto puede ser selectivamente trazadas a sus objetivos centrales.

El embrión de pollo es un sistema vertebrado especialmente útil para los biólogos del desarrollo y es capaz de superar algunas de las limitaciones que se encuentran en sistemas de mamíferos. Regulación del patrón temprano del oído interno y morfogénesis enaves muestra una similitud notable con los mamíferos ^1,12, mientras que los embriones de pollo son más grandes y más fácilmente accesible que embriones de roedores en las primeras etapas, cuando el sistema auditivo periférico se está formando. El método que aquí se presenta para el rastreo selectivo de fibras auditivas facilita la experimentación temprana en las proyecciones centrales del oído interno en desarrollo.

Hemos desarrollado este protocolo en un esfuerzo para identificar diferencialmente salientes centrales del nervio auditivo VIII, pero igualmente puede ser modificado para etiquetar selectivamente fibras de otros órganos sensoriales del oído interno. En contraste con los métodos descritos anteriormente, este procedimiento se realiza en un tejido vivo con el circuito intacto entero. Un método similar se realizó usado para describir el tiempo de VIII inervación aferente auditiva durante la embriogénesis aviar, sin embargo, las fibras vestibulares fueron también inadvertidamente etiquetada ³ Aquí se proporciona un método para identificar claramente región de o.igin resolución y terminación, así como alta sola fibra de select centralmente que se proyecta aferentes auditivos durante la embriogénesis de vertebrados.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polystyrene Weigh Dish	Fisher Scientific	02-202-101
Petri Dish, 35 X 10 mm	Fisher Scientific	50820644	Use to make silicone dissection dish
Sylgard Silicone Elastomer Kit	World Precision Instruments	SYLG184	Coat Petri to make dissection dish
Dissection Pins	Various		Holds embryo in place during dissection
NaCL	Various		part of aCSF recipe
KCl	Various		part of aCSF recipe
KH2PO4	Various		part of aCSF recipe
NaHCO3	Various		part of aCSF recipe
Glucose	Various		part of aCSF recipe
CaCl2	Various		part of aCSF recipe
MgSO4	Various		part of aCSF recipe
Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid.	CPLabSafety	QP-PLC-03717	Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid
Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial	American Pharmaceutical Partners, Inc	6332300105	Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream
Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler	Various		Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF
Glass stem bubbler	Various		To infuse carbogen into aCSF
Curved-tip forceps	World Precision Instruments	501008	To remove embryo head from egg
Two fine-tip forceps	World Precision Instruments	501985	For micro-dissection
50 ml Beaker	various
Rhodamine Dextran Amine (RDA)	Invitrogen	various	Fluorescent axon tracer
Triton X-100	ICN Biomedicals
Phosphate Buffered Saline, (1X PBS)	Various		Standard lab reagent
Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4" (100 mm) length	World Precision Instruments	TW120F-4	Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes
Needle / Pipette puller	David Kopf Instruments	Model 720	Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2
Picospritzer	Parker Instrumentation	various	Attach by fine tubing to glass micropipette
Micromanipulator	Narishige	various
Dissection microscope with fluorescence	Various
4% Paraformaldehyde	Various		Standard lab reagent
anti-Neurofilament antibody, optional	Millipore	AB1991	Follow histological protocol recommended by manufacturer
Cryostat and associated materials for sectioning	Leica	various
Epifluorescent microscope for imaging	Zeiss, various