Summary
نحن هنا وصف تقنية تسليخ مجهري تليها حقن صبغة الفلورسنت في العقدة الصوتية للأجنة الكتكوت المبكر للانتقائية تتبع من ألياف المحور العصبي السمعي في الدماغ المؤخر والعصب.
Abstract
فرخ الجنينية هو نموذج يستخدم على نطاق واسع لدراسة الطرفية والمركزية التوقعات خلية العقدة. في الجهاز السمعي، ووضع العلامات الانتقائي للمحاور عصبية السمعية داخل العصب القحفي VIIIth تعزيز دراسة السمعية المركزية التنمية الدائرة. هذا النهج من الأمور الصعبة نظرا الحواس متعددة من الأذن الداخلية والعصب المساهمة في VIIIth 1. وعلاوة على ذلك، علامات التي تميز بشكل موثوق السمعية مقابل مجموعة من المحاور العصبية الدهليزي داخل العصب VIIIth الطيور لا يزال يتعين تحديدها. لا يمكن السمعية والدهليزية مسارات يمكن تمييزها وظيفيا في الأجنة في وقت مبكر، كما الحسية استجابات ليست موجودة قبل تشكيل الدوائر. وقد تتبعت إسقاط مركزيا بالخلايا العصبية VIIIth في بعض الدراسات، ولكن رافق السمعية محور عصبي وضع العلامات من قبل المكونات الأخرى من وضع العلامات العصبية VIIIth 2،3. هنا، نحن تصف طريقة لتتبع تقدمي من العقدة الصوتية لابي انتقائيمحاور عصبية ل السمعية داخل العصب VIIIth النامية. الأولى، بعد تشريح جزء من المنطقة الأمامية من الرأس الجنين الفرخ يوم 8-منغمسين في الاوكسيجين السائل النخاعي الاصطناعي، تم تحديد قناة القوقعية من المعالم التشريحية. المقبل، يتم وضع غرامة micropipette الزجاج سحبت لحقن كمية صغيرة من الأمينات رودامين ديكستران في المنطقة العميقة لاصق والمجاورة حيث توجد خلايا العقدة الصوتية. في غضون ثلاثين دقيقة بعد الحقن، وتتبع محاور عصبية السمعي في الدماغ المؤخر مركزيا ويمكن أن تكون في وقت لاحق بعد إعداد تصور نسيجية. هذا الأسلوب يوفر أداة مفيدة للدراسات الإنمائية من الطرفية إلى وسط السمعية تشكيل الدائرة.
Protocol
1. إعداد أدوات تشريح التالية والكواشف
- السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF؛ 130 مم كلوريد الصوديوم، 3 مم بوكل، 1.2 ملي KH 2 PO 4 و 20 ملي NaHCO 3 و 3 HEPES مم، 10 مم الجلوكوز، 2 مم CaCl 2، 1،3 ملي MgSO 4) غرست باستمرار مع 95٪ O 2/5٪ CO 2 في درجة حرارة الغرفة. للتسريب، وملء إلى 3/2 ألف 500 مل جرة Nalgene واسعة الفم مع وجود ثقب حفر في الغطاء. وسوف تعلق دبابات من أنابيب الزجاج إلى عوامات الجذعية، والتي تخترق ACSF من خلال ثقب في الغطاء جرة. ضبط ضغط للحصول على تيار مستمر من الفقاعات التي تصل إلى حوالي 1/3 من السائل ولكنها ليست قوية بما يكفي للتسبب الرش على الحافة. يغرق 5 قوارير الزجاج مل (إلى 6) في جرة Nalgene لفصل العينات الفردية عن بعضها البعض والغاز من الاضطراب التدفق. وينبغي المؤكسج ACSF مدة لا تقل عن 20 دقيقة قبل أي حضانة الأنسجة.
- طبق صغير تشريح سيليكون (35 × 10 مممم بيتري Sylgard المغلفة باستخدام Elastomere كيت) مع دبابيس تشريح 2 وضعها في البوليسترين سداسية صغيرة (47 مم أسفل) تزن القارب.
- اثنين غرامة ملقط غيض، واحدة منحني ملقط غيض، دورق 50 مل، وحاوية للنفايات الأنسجة.
- سحبت الزجاج micropipette (1.2 OD / 0.9 ID) إلى حوالي 20-50 كسر ميكرومتر فتح في الطرف ومليئة رودامين ديكستران أمين (RDA، MW = 3،000، إينفيتروجن) في محلول 6.25٪ مع 0.4٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني . بواسطة أنابيب إرفاق غرامة لpicospritzer واستقرار لمياداة مجهرية.
2. الدقيقة لكشف تشريح الحليمة قاعدي في E8 4،5
- مع ملقط المنحني، وقطع E8 الجنين أقل بقليل من الدماغ، ووضع الرأس مباشرة على طبق تشريح سيليكون المغلفة داخل تزن القارب.
- إمالة الرأس باستخدام دبابيس تشريح، ضع الرأس بهدف بطني حتى الأذن على جانب الفائدة مرئيا قليلا، قليلا وظهريا مشيرا 10-30 درجة بعيدا عن مnter (الشكل 2A). تأمين على الفور الرأس مع الدبابيس. إذا هو المطلوب الثنائية تتبع، رئيس مركز في 0 درجة، أو مرأى ومسمع بطني بحيث يمكن الوصول إليها كلا الجانبين. وبالمثل، لحقن في الجانب الأيسر من الرأس في تأمين -10 إلى -30 درجة من وسط الجانب الأيسر حتى يمكن الوصول إليها.
- باستخدام الدورق 50 مل، 30 مل من نقل الاوكسيجين في ACSF الطبق، غمر تماما الأنسجة.
- فهم بلطف وقشر أسفل الفك السفلي باستخدام ملقط غرامة تلميح، ثم إزالة الجفن السفلي على جانب الفائدة.
- إزالة الأنسجة الوعائية المغطي، بما في ذلك أي الحنك المتبقية والمريء. وينبغي لهذه الأنسجة الرخوة قشر بعيدا الكشف عن سطح أملس تطوير القحف الغضروفي مع الشرايين الفقري مميزة في سطحه. من هذه النقطة، يجب السمة الشامل otoconial بيضاء تكون مرئية.
- تشريح بعناية الجلد حول الصماخ الخارجي، غضروف مفصل الفك، وإلى الأذن الوسطى مع ترك فيالمجموع الأذن سليمة. استخدام ملقط لخفض بلطف بعيدا هذه الهياكل الغضروفية.
- إزالة الشرايين الفقري وتجمع الدم باستخدام اقتراح لطيف واسعة مع ملقط غرامة نصائح. يمكن مشاهدة الدم والتخثر يحجب قد سد افتتاح ماصة الحقن.
- القناة القوقعي مع ظهارة حسية المجاورة (القاعدي حليمة) والعقدة تكمن الصوتية مباشرة تحت القحف الغضروفي 6 و يمكن تصور باعتبارها الإسقاط الإصبع تشبه ممدود تمتد من الأذن الداخلية بطنيا، مع الطرف البعيد في أقصى (قمة) بالقرب من الأمامية خط الوسط 5. قد يكون هناك تجمع صغيرة من الدم (الحمراء) من تشريح و / أو تكلس الحصيات السمعية (أبيض) في ذروة القناة قوقعة الأذن (الشكل 2B) التي يمكن أن تساعد في التصور. يعتقد رقعة الحسية في ذروة هو البقعة lagenar، لتكون وظيفة الدهليزي 7،8.
3. انتقائية وصفها من ألياف CN السمعي VIII
- خفض ببطء micropipette إلى ثقب الجمجمة لأول مرة. هذه المنطقة هي الجمجمة أرق من المناطق المحيطة بها، ويتطلب أقل قوة لاختراق. يجب أن تكون الآن micropipette داخل قناة القوقعية. اختياري: يمكن إجراء حقن صغيرة من صبغة تتبع هنا للمساعدة في وضع الرؤية وحليمة القاعدي.
- دون تغيير موضع micropipette، مواصلة خفض المخالفات فقط حتى الحدود العميق للقناة القوقعية (الشكل 1). إجراء الحقن هنا وتكرار في مناطق متعددة على طول الحليمة القاعدي (أرقام 2C، 2D)، باستثناء الطرف الأكثر القريبة حيث يقع الحوقلة الدهليزي. مع تعيين picospritzer بين 10-30 رطل، يتم إجراء الحقن عدة. حجم السائل صبغ حقن يختلف، ويعتمد على مدى لوضع العلامات المطلوبة. ينبغي لكل الحقن يؤدي إلى LA-صبغة الفلورسنتbeled بقعة تقريبا من 200 - 400 ميكرون قطر (الشكل 2D).
- وبمجرد أن حقن اكتمال استخدام ملقط لعينة المسح الشامل فوق جذع الدماغ واستخدام ماصة نقل لوضع جزء الذيلية في جرة صغيرة داخل حاوية من ACSF باستمرار يجري perfused مع 95٪ O 2/5٪ CO 2.
- لكل الجنين، والسماح 20-30 دقيقة لنقل الصبغة، اعتمادا على مسافة تتبع المركزية المطلوب.
- إزالة الأنسجة والاستعداد لباجتزاء النسيجية. في المثال الموضح هنا، يتم غمر الأنسجة في بارافورمالدهيد 4٪ (1X PBS في) بين عشية وضحاها، والسكروز٪ 30 (1X PBS في) بين عشية وضحاها.
4. Counterstaining وتحليل
- Counterstaining مفيد للمساعدة في توجيه المراقب لموقع التشريحية وكذلك تحديد مناطق معينة من الفائدة. وملون مباين فعالة في هذا الإعداد هو immunolabeling خيط عصبي (الشكلان 1، 3B، 3E)، الذي L بقوةabels محاور عصبية ويسمح لترسيم مساحات محور عصبي في الجهاز العصبي المركزي.
- يجب أن يتم تنفيذ تحليل في جميع أنحاء المنطقة المسمى، إذ أن التوقعات يمكن أن تمتد عدة مئات من ميكرون أو أكثر على طول محور rostrocaudal. بعض الأمثلة على التحليلات الأساسية هي: استهداف معدلات الخطأ والتوقيت و / أو تغييرات في أنماط الاختلاف في الإسقاط. محاور عصبية RDA التي تحمل علامات يمكن رؤيتها في النظام العصبي الطرفي والمركزي مع ارتفاع القرار (أرقام 3A، 3D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مكونات العصب VIIIth وتشريح الأعصاب نفسها معقدة ومعقدة (أرقام 1، 3). عن طريق تتبع انتقائي الألياف الناشئة عن خلايا العقدة الصوتية، يمكن شرائح العصب VIIIth وكذلك afferents السمعية الأولية في الدماغ تتبع نظيفة وتمييزها عن نظيراتها الدهليزي (أرقام 2، 3). وبالمثل، يمكن أن تستخدم هذه التقنية لدراسة التوقعات الطرفية للخلايا العقدة الصوتية (الشكل 3G)، أو تعديلها لدراسة التوقعات الناشئة عن أجهزة الدهليزي الفردية. لأن تتبع نظيفة محاور عصبية علي طولها بالكامل، يمكن إجراء تحليلات كمية دقيقة السمعية المميزة من خلال إسقاطات الدهليزي التنمية، بما في ذلك تحديد موعد وأنماط تعصيب الأولية، ومعدلات الخطأ الاستهداف، وما إلى ذلك بالإضافة إلى ذلك، وخلافا للنهج السابق لوضع العلامات الألياف السمعية، هذا النهج هو ادائهاويمكن استخدام ميد على الأنسجة، وغير ثابتة، وبالتالي المعيشة في وقت واحد مع غيرها من التجارب في المختبر.
رغم أن هذا الأسلوب هو مناسبة للأجنة من E9-E6، أفضل النتائج عندما تبدأ في E8 محاور عصبية السمعية ومعصب أهدافها المركزية الابتدائية 3. في المقابل، تصل إسقاطات الدهليزي في الدماغ في وقت سابق 9،10 وبالتالي سيكون بمثابة أفضل المرشحين لتعقب في وقت سابق، على الرغم من الصعب فنيا نظرا لصغر حجم وعدم النضج النسبي للجهاز الدهليزي في هذا العمر. ينبغي دراسة المقاطع النسيجية للتأكد من حقن الصبغة موقع، والمنطقة قمي، معظم حليمة القاعدي يحتوي على قطعة صغيرة الحسية يعتقد أن وظيفة الدهليزي، وإذا وصفت يمكن أن تلوث يحتمل النتائج.
مرة واحدة المحقق على دراية التشريح، وثلاثة من أكثر المشاكل شيوعا التي تواجهها هي كما يلي:
- والقوقعة دويتم تعبئة ط م مع تتبع صبغة، ولكن لا صفت محاور عصبية خلية العقدة. هذه المشكلة يشير المحتمل أن لم يتم تنفيذ الحقن العميق للقناة القوقعية، حيث الخلايا العقدية والألياف العصبية الموجودة. ويمكن تصحيح هذه المشكلة عن طريق التأكد من أن ثقوب الحقن micropipette أولا القحف الغضروفي، ثم تقدمت بلطف وذلك لثقب فقط من خلال الجانب الآخر من القناة. بدلا من ذلك، تم وضع ماصة الحقن بشكل صحيح ولكن تسليم كميات غير كافية من الصبغة. قد زيادة الضغط الحقن أو الحقن التغلب على عدد من هذه المسألة أيضا.
- ومقطوع عن غير قصد العصب نتيجة للسحب على الإفراط في متاهة الغضروفية خلال تشريح. ويمكن تجنب هذه الصعوبة باستخدام التقنيات الدقيقة وتشريح تشريح محدود من الأذن الوسطى.
- حقن واسعة النطاق جدا وتسميات أخرى عن غير قصد خلايا العقدة الحسية أو ألياف العصب الناتجة عن مكونات أخرى. الويمكن أن يكون الحد الأدنى المشكلة عن طريق تحسين بروتوكولات الحقن، وربما تتطلب تخفيض ضغط الحقن أو عدد من البقول، أو تحويل موقع الحقن.
مثالين من التحليلات المحتملة هي:
- الاختلاف في أنماط الإسقاط: يحدد مدى محاور عصبية وصفت على طول محور معين، وكيف أنها قد تتأثر التجريب التالية. ويمكن وصف الاختلاف Rostrocaudal على النحو التالي:
(الأقسام التي تحتوي على محاور عصبية عدد المسمى) قد × (سمك كل قسم) يمكن تصحيح هذا الإجراء لمدى التسمية الصبغة كنسبة من الحليمة القاعدي، أو في الأنسجة counterstained، لنسبة بالخلايا العصبية VIIIth المسمى. هذا هو أداة مفيدة لتحليل التوقعات الطبوغرافية، كما يمكن تتبع محاور عصبية المسمى نظيفة لمحطة المجالات الخاصة بهم في الدماغ المؤخر. لقياسات tonotopy، ينبغي أن يقتصر الحقن الصبغة في المنطقة التي تهم على طول بسILAR حليمة.
- استهداف الأخطاء: يحدد وتيرة محاور عصبية mistargeted لكل منطقة محددة سلفا من الأنسجة تحليل (يمكن أن تكون في القسم، في جنين، وما إلى ذلك). قد يؤدي إلى اضطرابات محاور عصبية بعد مسار غير طبيعي أو الإسقاط تنتهي في منطقة غير لائقة. عندما قياس أخطاء، ينبغي تطبيع الأرقام لمراعاة الفرق بين الحقن بكميات الأجنة. أصغر الحقن هم أكثر عرضة لتؤدي إلى القدرة على تسجيل محاور عصبية واحدة. ويمكن وصف التحليل الأساسي خطأ تستهدف ما يلي:
الشكل 1. الاكليلية نظرا لتبسيط E6 الدماغ معالعقد الصوتية ثنائية سليمة. Schematized الأحمر ماصة دقيقة يوضح استهداف خلايا العقدة الصوتية من نقطة دخول ظهراني جانبي. وimmunolabeled أقسام مع خيط عصبي مكافحة لتسليط الضوء على التوقعات محور عصبي. أجهزة الدهليزي هي منقاري إلى أقسام مبين. أظهرت تعقبها منطقة الحقن RDA للألياف السمعية انتقائية مع التوضيح ماصة الحمراء. ثامنا = العصب الدهليزي القوقعي، AG = العقدة الصوتية، VG = العقدة الدهليزية. الظهرية متروك. شريط النطاق = 300 ميكرومتر.
الشكل 2. تسليخ مجهري وحقن المنطقة المستهدفة. إمالة (A) الموقف المناسب من الجنين على طبق تشريح، مشاهدة بطني مع رئيس ظهريا وتحولت قليلا إلى الجانب للسماح الوصول بشكل أفضل إلى الجانب الأيمن. ه الحقويرد ع ويشار حليمة القاعدي الأساسي مع خط متقطع. رأس السهم في (A) و (B) يوضح موقفه المبدئي من تشريح ماصة (B) بعد الإدراج، كتلة بيضاء otoconial مرئيا، ترسيم الحدود القمي للحليمة القاعدي (السهم). (C، D) يجب أولا توفير الحقن الخطوط العريضة للقناة القوقعية. (D) ينبغي بذل الحقن العميق اللاحقة فقط إلى قوقعة الأذن حليمة القناة والقاعدي في المنطقة العقدة الصوتية. مضان RDA مفيد في تعزيز إدراك عمق الحقن والحقن كل فرد أن خلق بقعة الفلورسنت صبغ المسمى تقريبا من 200 - 400 ميكرون قطر كما رأينا هنا. شريط مقياس = 2 مم.
Figure 3. ممثل الصور من الألياف السمعية انتقائية البحث عن المفقودين في جنين E8. (AC) منخفض الطاقة و(DG) قوة أعلى مستوياته في 25 ميكرومتر المقاطع الاكليلية التي تم جمعها من الجنين نفسه في طائرات مختلفة. (A) يمكن تتبع محاور عصبية RDA صفت من موقع الحقن (رأس السهم )، من خلال العصب القحفي (السهم) ونحو caudally نحو الأهداف السمعية نوى الأساسي (رأس السهم المزدوج). (B) يسلط الضوء على الأجسام المضادة مع Immunolabeling المضادة للخيط عصبي محواري جميع التوقعات والألياف RDA-تتبع من (A) هي في إسقاط السمعية المسار. تراكب منفصلة (A) و (B) القنوات كما هو مبين في دمج لون يوضح (DF) صورة السلطة العليا للجنين نفسه في موقف أكثر الذيلية (C) (A) دقة عالية من الألياف عند مدخل العصب ( سهم) وعلى طول الطريق المركزي (رأس السهم المزدوج). (E) </ STRONG> خيط عصبي وصمة عار لجميع محاور عصبية يسمح ترسيم CNS-PNS وكذلك السمعية المفترضة مقابل التوقعات الدهليزي. ا ف ب نائب الرئيس وتشير كل منها السمعية والمكونات الطرفية الدهليزي في العصب نقطة دخول، في حين التيار المتردد والاستثمار الرأسمالي تشير التوقعات السمعية منها والدهليزي المركزي في العصب نقطة دخول. تراكب منفصلة (D) و (E) كما هو موضح قنوات لون دمج في (F) (G) الفحص نسيجية من العقدة الصوتية يكشف موقع صفت خلايا العقدة الصوتية من (تتبع هو مبين في (AF) واسقاطاتها الطرفية وتعود النجمة) retrogradely إلى حليمة القاعدي. (H) توضيحات من 700 ميكرومتر طريقا تتبع المتوقع مع وضع العلامات السمعية الخاصة في الثامن E8. موقع الحقن (الدائرة الحمراء) هي نقطة دخول لالذيلية العصبية، والإسقاطات المركزية منقاري والسفر مرة واحدة في الدماغ المؤخر نحو caudally. نائب الرئيس = سترة الطرفيةibular، أ ب = الطرفية السمعية، VC = الدهليزي المركزي، AC = المركزية السمعية، AG = العقدة الصوتية، BP = القاعدي حليمة، LM البقعة lagenar =، SVG = العقدة الدهليزية متفوقة، مجموعة التنفيذ = العقدة الدهليزية السفلية. شريط النطاق = 300 ميكرومتر لAC، 100 ميكرومتر لDF، 100 ميكرومتر في G و 500 ميكرومتر في H.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
واقتصرت دراسات التنمية في وقت مبكر من العصب VIIIth ويرجع ذلك جزئيا لصعوبة في تحديد محاور عصبية الجنينية الناجمة عن العقد متميزة متعددة. واستكشفت عدة دراسات الإشارات الجزيئية والخلايا السمعية توجيه الحسية الدهليزي ومصائر خلية العقدة خلال التنمية في وقت مبكر، ولكن 5،11،12 عمليات تنظيم تعصيب المركزي لم يتم تحديدها بعد. تقارير الصوتية التوقعات خلية العقدة عادة تصف العمليات الطرفية الحسية لظهارة 13-15، في حين لا يعرف الكثير عن العمليات المركزية لإسقاط نوى الأولية. دراسات مركزيا إسقاط التقسيمات الثامن خلال مرحلة التطور الجنيني وغالبا ما تكون الكهربية، مثل التسجيلات البصرية في الدماغ المؤخر فرخ الجنينية 16 أو تصوير الكالسيوم في أنسجة الثدييات شريحة 17 وأما لا يمكن أن يؤديها قبل الانتهاء من الدوائر العصبية. استخدام علامات المناعية لتسميةمحاور عصبية في العصب السمعي VIIIth فرخ غير ممكن حاليا. في حين تم تحديد مجموعات متميزة من عوامل النسخ التي ترتبط مع الخلايا العصبية السمعية مقابل الدهليزي 18-23، تم استبعاد التعبير عن هذه العوامل من محاور عصبية. في الفئران، تم العثور على الاختلافات بين العقد والعقد الدهليزية دوامة في التعبير الجيني، بما في ذلك بعض المرشحين واعدة يمكن أن تفرق بين النمو محور عصبي طرائق 23 مزيد من الدراسة لهذه المنتجات قد تسفر عن الجينات أدوات هامة لكلا الدراسات الثدييات والطيور. مع الأساليب المذكورة هنا، يمكن الألياف السمعية في الأنسجة الحية الجنينية مع دائرة السمعية سليمة تتبع انتقائي لأهدافها المركزية.
الجنين الدجاج هو نظام الفقاريات مفيدة بشكل خاص للعلماء البيولوجيا التطورية وقادرة على التغلب على بعض القيود الموجودة في أنظمة الثدييات. تنظيم وقت مبكر الزخرفة الأذن الداخلية والتشكل فيالطيور يظهر التشابه الملحوظ على الثدييات 1،12، في حين الأجنة فرخ تكون أكبر وأكثر سهولة من الأجنة القوارض في المراحل الأولى عندما يتم تشكيل الجهاز السمعي المحيطي. طريقة المقدمة هنا لتتبع الانتقائي للألياف السمعي يسهل التجريب في وقت مبكر على توقعات المركزي الأذن الداخلية النامية.
وضعنا هذا البروتوكول في محاولة لتحديد التوقعات تفاضلي السمعية المركزية للعصب VIIIth، ولكن أيضا يمكن تعديله لتسمية انتقائي من ألياف الحواس الأخرى في الأذن الداخلية. وعلى النقيض من الأساليب المذكورة سابقا، يتم تنفيذ هذا الإجراء على الأنسجة الحية مع الدائرة بأكملها سليمة. تم استخدام طريقة مماثلة لوصف أداء توقيت تعصيب السمعي الثامن وارد خلال مرحلة التطور الجنيني الطيور، ومع ذلك، تم أيضا ألياف الدهليزي المسمى دون قصد 3 هنا نقدم طريقة لتحديد بشكل واضح أو منطقة.igin وإنهاء الخدمة، وكذلك الألياف عالية الدقة واحد من إسقاط حدد مركزيا afferents السمعي خلال مرحلة التطور الجنيني الفقاريات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر الدكتور كانديس هسيه للحصول على اقتراحات والمساعدة مع تقنيات التصوير والدكتور وو دوريس لخبرة في التشريح فرخ الأذن الداخلية خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر. وأيد هذا العمل من قبل NSF-IOS 0642346، NIH-T32 DC010775، NIH-T32 GM008620، NIH-R01 DC010796، وDOE GAANN P200A120165.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Polystyrene Weigh Dish | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
Petri Dish, 35 X 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | Use to make silicone dissection dish |
Sylgard Silicone Elastomer Kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Coat Petri to make dissection dish |
Dissection Pins | Various | Holds embryo in place during dissection | |
NaCL | Various | part of aCSF recipe | |
KCl | Various | part of aCSF recipe | |
KH2PO4 | Various | part of aCSF recipe | |
NaHCO3 | Various | part of aCSF recipe | |
Glucose | Various | part of aCSF recipe | |
CaCl2 | Various | part of aCSF recipe | |
MgSO4 | Various | part of aCSF recipe | |
Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid |
Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial | American Pharmaceutical Partners, Inc | 6332300105 | Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream |
Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler | Various | Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF | |
Glass stem bubbler | Various | To infuse carbogen into aCSF | |
Curved-tip forceps | World Precision Instruments | 501008 | To remove embryo head from egg |
Two fine-tip forceps | World Precision Instruments | 501985 | For micro-dissection |
50 ml Beaker | various | ||
Rhodamine Dextran Amine (RDA) | Invitrogen | various | Fluorescent axon tracer |
Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) | Various | Standard lab reagent | |
Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4" (100 mm) length | World Precision Instruments | TW120F-4 | Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes |
Needle / Pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2 |
Picospritzer | Parker Instrumentation | various | Attach by fine tubing to glass micropipette |
Micromanipulator | Narishige | various | |
Dissection microscope with fluorescence | Various | ||
4% Paraformaldehyde | Various | Standard lab reagent | |
anti-Neurofilament antibody, optional | Millipore | AB1991 | Follow histological protocol recommended by manufacturer |
Cryostat and associated materials for sectioning | Leica | various | |
Epifluorescent microscope for imaging | Zeiss, various |
References
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139, 245-257 (2012).
- Pflieger, J. F., Cabana, T. The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica. Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).
- Molea, D., Rubel, E. W. Timing and topography of nucleus magnocellularis innervation by the cochlear ganglion. The Journal of Comparative Neurology. 466, 577-591 (2003).
- Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of Comparative Neurology. 368, 620-630 (1996).
- Brigande, J. V., Kiernan, A. E., Gao, X., Iten, L. E., Fekete, D. M. Molecular genetics of pattern formation in the inner ear: do compartment boundaries play a role. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11700-11706 (1073).
- Bellairs, R., Osmond, M. The atlas of chick development. , 2nd Edn, Elsevier. (2005).
- Manley, G. A., Haeseler, C., Brix, J. Innervation patterns and spontaneous activity of afferent fibres to the lagenar macula and apical basilar papilla of the chick's cochlea. Hearing Research. 56, 211-226 (1991).
- Code, R. A. Efferent neurons to the macular lagena in the embryonic chick. Hearing Research. 82, 26-30 (1995).
- Maklad, A., Fritzsch, B. Development of vestibular afferent projections into the hindbrain and their central targets. Brain Research Bulletin. 60, 497-510 (2003).
- Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Lineage analysis of inner ear cells using genomic tags for clonal identification. Methods Mol. Biol. 493, 47-63 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 521-533 (2007).
- Appler, J. M., Goodrich, L. V. Connecting the ear to the brain: Molecular mechanisms of auditory circuit assembly. Progress in Neurobiology. 93, 488-508 (2011).
- Bulankina, A. V., Moser, T. Neural circuit development in the mammalian cochlea. Physiology (Bethesda). 27, 100-112 (2012).
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 549-556 (2007).
- Momose-Sato, Y., Glover, J. C., Sato, K. Development of functional synaptic connections in the auditory system visualized with optical recording: afferent-evoked activity is present from early stages. Journal of Neurophysiology. 96, 1949-1962 (2006).
- Marrs, G. S., Spirou, G. A. Embryonic assembly of auditory circuits: spiral ganglion and brainstem. The Journal of Physiology. 590, 2391-2408 (2012).
- Milo, M., et al. Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear. PloS One. 4, e7144 (2009).
- Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).
- Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain. Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).
- Huang, E. J., et al. Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons. Development. 128, 2421-2432 (2001).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).
- Lu, C. C., Appler, J. M., Houseman, E. A., Goodrich, L. V. Developmental profiling of spiral ganglion neurons reveals insights into auditory circuit assembly. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 10903-10918 (2011).