Summary
ここでは、神経と後脳における聴覚軸索線維の選択的なトレースのための初期のニワトリ胚の音響神経節への蛍光色素を注入し顕微解剖法を説明します。
Abstract
ニワトリ胚は、末梢および中枢神経節細胞の突起の研究のために広く使用されているモデルです。聴覚系では、VIIIth脳神経内聴覚軸索の選択的標識は、中枢聴覚回路発達の研究を強化するであろう。内耳の複数の感覚器官がVIIIth神経1に貢献するため、この方法は困難である。また、確実に鳥VIIIth神経軸索内の前庭グループに対して聴覚を区別するマーカーが同定されていない。回路が形成される前に、感覚誘発反応が存在していないとして、聴覚と前庭の経路は、初期胚において機能的に区別することはできません。一元的に突出したVIIIth神経軸索は、いくつかの研究でトレースされているが、聴覚軸索標識は他のVIIIth神経コンポーネント2,3からラベリングを伴っていた。ここでは、音響神経節から選択ラベへのトレースを順行するための方法を説明します開発VIIIth神経内のL聴覚軸索。まず、酸素人工脳脊髄液中に浸漬し、8日、ニワトリ胚の前頭部の部分切開した後、蝸牛管は、解剖学的なランドマークによって識別されます。次に、罰金引かガラスマイクロピペットは、音響神経節細胞が配置されているダクトと隣接深い領域にローダミンデキストランアミンを少量注入するように配置されている。注射後30分以内に、聴覚軸索は後脳に集中的に追跡され、後に、次の組織学的準備を可視化することができる。この方法では、中枢聴覚回路形成に周辺の発達研究のための便利なツールを提供します。
Protocol
1。以下解剖ツールおよび試薬を準備
- 連続して95%Oを流し込んで、人工脳脊髄液(130mMのNaCl、3mMのKClを、1.2mMのKH 2 PO 4、20mMのNaHCO 3を 、3 mMのHEPES、10mMグルコース、2mMのCaCl 2、1.3mMのMgSO 4を ACSF)室温で2/5%CO 2で 。点滴は、2月3日ふたに穴を開けた500ml広口ナルゲン瓶に記入してください。タンクは瓶のふたの穴に通しACSFを貫通ガラスステムバブラーにチューブで接続されます。液体の約1/3に達するが、リムの上に飛散引き起こすのに十分な説得力がありません泡の一定のストリームを取得するために圧力を調整します。互いから、ガス流の乱れから、個々のサンプルを分離するナルゲン瓶に沈める5ミリリットルガラスバイアル(最大6)。 ACSFは、どの組織のインキュベーションの前に少なくとも20分間酸素化されるべきである。
- 小さなシリコーン解剖皿(35ミリメートル×10小さな六角形のポリスチレンに配置された2つの解剖ピン付きシルガード弾性体キットを使用してmmペトリコーティング)(47ミリメートルの下)ボートの重量を量る。
- 二つ精密チップ·鉗子、1湾曲先端鉗子、50mlビーカー、および組織廃棄用のコンテナ。
- ガラスマイクロピペット(1.2外径/ 0.9 ID)の先端の開口は約20から50程度に分割して0.4パーセントと6.25パーセント·ソリューションのトリトンX-100、PBS中におけるローダミンデキストランアミン(RDA、MW = 3000、Invitrogen社製)を充填した引っ張ら。マイクロマニピュレーターにpicospritzerして安定化する細かいチューブで取り付けます。
2。顕微解剖E8 4,5で乳頭基部を明らかにする
- 湾曲したピンセットで、ボートの重量を量る内にシリコーン被覆解剖皿に直接頭を置いて、ちょうど脳幹下E8胚を切った。
- 興味のある側の耳が少し見えるように位置腹望むヘッドは、解剖のピンを使って、頭がわずかに背側に傾けて、CEから10から30度を指しているNTER( 図2A)。すぐにピンと頭を固定します。二国間のトレースは、中心0度ヘッド、または両側がアクセスできるように、完全な腹ビューを希望する場合は。左側がアクセスしやすいように同様に、左サイド注入のために、中心から-30度〜-10で頭部を固定します。
- 50ミリリットルのビーカーを使用して、完全に組織を浸漬、皿に酸素化ACSFの30ミリリットルを転送します。
- そっとつかんで、精密チップ·鉗子を用いて下顎ダウンはがし、次に興味のある側に下瞼を削除します。
- 残りの口蓋と食道を含め、上層の血管組織を削除します。これらの軟部組織が剥がれ、その表面に独特の椎骨動脈と軟骨頭蓋の開発の滑らかな表面を明らかにする必要があります。この時点では、特徴的な白いotoconial質量が見えるはずです。
- に残したまま、慎重に外尿道口、顎関節の軟骨、中耳の周りの皮膚を切開NERの耳無傷。そっとこれらの軟骨構造を切り取るために鉗子を使用しています。
- 椎骨動脈を外し、細かい鉗子のヒントと穏やかな弧を描く動きを用いて血液をプール。血がビューと凝固がインジェクションピペットの開口部を塞ぐことが見えにくくなる場合があります。
- 隣接感覚上皮(乳頭基部)と聴神経節と蝸牛管は軟骨頭蓋6の直下に位置し、前方の近くの最も遠位の先端(頂点)で、腹側内耳から延びる細長い指状の突起として可視化することができる正中線5。視覚化するのを助けることができる蝸牛管( 図2B)の頂点に解離および/ またはotolithic石灰(白)から少量の血液プーリング(赤)があるかもしれません。頂点にlagenar黄斑ですが、感覚パッチは前庭機能7,8であると思った。
3。 CN VIII聴覚繊維の選択的標識
- 最初はゆっくり穿刺頭蓋にマイクロピペットを下げます。この頭蓋領域は、周辺地域よりも薄く、小さい力が浸透している必要があります。マイクロピペットは現在、蝸牛管の内側になければなりません。オプション:トレース染料の小さな注射は乳頭基部を視覚化するのを助けるためにここで行うことができます。
- マイクロピペットの位置を変更せずに、単に侵害それまで蝸牛管( 図1)の深い境界線を下げ続けている。ここに注射を行うと前庭つぼが置かれている最も近位チップを除く、乳頭基部( 図2C、2D)の長さ方向に沿って複数の地域で繰り返す。 10から30 psiの間に設定picospritzerで、いくつかの注射が行われます。注入された色素の流体の体積は変化し、所望の標識の程度に依存する。各注射は蛍光色素ラをもたらすべきである約200のbeledスポット- 400μmの直径( 図2D)。
- 注入が完了すると、脳幹上記サンプルを横断すると、継続的に95%O 2/5%CO 2下で灌流さACSFのコンテナ内に小さな瓶に尾部を配置するためにホールピペットを使用する鉗子を使用しています。
- 各胚については、目的の中央トレースの距離に応じて、移染のために20-30分を許可します。
- 組織を除去し、組織学的切片の準備をします。ここに示す例では、組織は4%パラホルムアルデヒド(1X PBS中)を一晩一晩、30%スクロース(1X PBS中)に浸漬されている。
4。対比と分析
- 対比は、解剖学的位置に向きをオブザーバを助けるだけでなく、関心のある特定の領域を識別するのに便利です。この製剤における有効対比を強くリットルニューロフィラメント免疫標識( 図1、図3B、3E)であり、abelsは、軸索と中枢神経の軸索路の区分を可能にします。
- 予測はrostrocaudal軸に沿って数百ミクロン以上を拡張することができますように分析は、標識された地域全体で行うべきである。基本的な分析のいくつかの例は以下のとおりです。ターゲットエラーレート、タイミングおよび/または投影パターンの発散の変化。 RDA-標識軸索は、高解像度( 図3A、3D)と末梢および中枢神経系において可視化される。
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Representative Results
VIIIth神経と神経自体の解剖学的構造のコンポーネント( 図1、図3)、複雑で入り組んである。選択的に音響神経節細胞から生じる繊維をトレースすることにより、脳幹内VIIIth神経だけでなく、一次聴覚求心性神経のセグメントがきれいにトレースすることができるとその前庭の対応( 図2、図3)とは区別される。同様に、この技術は、音響神経節細胞の周辺の突起( 図3G)を研究するために使用、または個々の前庭器官から生じる予測を研究するために変更することができます。軸索が正常に彼らの全体の長さに沿ってトレースされますので、正確な定量分析を加えて、聴覚繊維標識の前のアプローチとは異なり、初期の神経支配の正確なタイミングやパターンなど、開発時前庭予測、ターゲティングエラー率などから区別聴覚を行うことができますこのアプローチは、性能です非固定、生体組織のMEDとは、このようにin vitroの実験で 、他に同時使用することができます。
このテクニックはE6-E9から胚に適していますけれども、聴覚軸索は、彼らの主要な中央のターゲット3を支配したときに、最良の結果を得るにはE8で開始。これとは対照的に、前庭の予測は以前9,10脳幹に届くので、技術的に小さなサイズと、この年齢で前庭器の相対的な未熟さが原因で挑戦しても、以前のトレースするための良い候補となるだろう。組織切片は乳頭基部の頂端 - ほとんどの領域は前庭機能のように標識された場合は、潜在的な結果を汚染する可能性があると思った小さな感覚のパッチが含まれているとして、色素注入の場所を確認するために調べられるべきです。
治験責任医師は、解剖学に精通しているしたら、最も一般的に発生する問題の3は、次のとおりです。
- 蝸牛デュCTはトレース染料で満たされているが、神経節細胞の軸索は、標識されていません。この問題は、おそらく注射は神経細胞と神経線維が存在する蝸牛管に深く実行されなかったことを示しています。この問題は、注入マイクロピペット第一刺し軟骨頭蓋が、その後静かにダクトのもう一方の側を通ってちょうど穿刺するように進められることを保証することによって補正することができる。あるいは、インジェクションピペットの位置が正しくなく、染料の不十分な量を納入された可能性があります。噴射の噴射圧力、またはノード数を増やすと、この問題を克服することができる。
- 神経が誤って解剖中に軟骨迷路を引っ張る過度の結果として離断されています。この困難は、微細解剖のテクニックと中耳の限られた解剖を使用することで回避できます。
- 注射はあまりにも広範であり、誤って他の神経部品から生じる他の感覚神経節細胞または繊維にラベルを付けます。木曜日問題は、注入プロトコルを最適化することにより、最小限に抑えることができており、射出圧力またはパルスの数を減らす、または注射の位置をずらす必要がある場合があります。
潜在的な分析の2つの例を示します。
- 投影パターンの発散は:ラベルの付いた特定の軸に沿って軸索と、それらがどのように次の実験に影響を与えたかもしれないの程度を決定する。 Rostrocaudal発散は次のように記述することができます:
(標識軸索を含む数値セクション)×(各セクションの厚さ)は今回の措置は、標識VIIIth神経軸索の割合は、乳頭基部の割合として、または対比組織における色素標識の程度について補正することができる。これは、標識された軸索が正常に後脳におけるそれらの端末の分野にたどることができるように、地形の予測を分析するための便利なツールです。 tonotopyの測定では、色素注射はBASに沿って関心領域に限定されるべきであるILAR乳頭。
- エラーを標的にすること:分析された組織のすべての所定の領域(胚等ごとに、セクションごとにすることができます)のためにmistargeted軸索の周波数を決定します。摂動は異常突出パスに従って、または不適切な地域で終端軸索になることがあります。エラーを定量化するとき、数字は胚の間に注入量の差を考慮するために正規化する必要があります。小さい注射は単一軸索を獲得する能力につながる可能性が高くなります。基本的なターゲティングエラー解析は次のように記述することができます:
図1。と単純化のためのE6脳幹冠状断像両側性聴神経の神経無傷。図式赤ピペットは背のエントリポイントから音響神経節細胞の標的正確示しています。セクションは、軸索突起を強調するために抗ニューロフィラメントで免疫標識されています。前庭器官が示すセクションに吻側です。赤ピペットイラストで実証トレース選択聴覚繊維のRDA注入の領域。 VIII =内耳神経、AG =音響ガングリオン、VG =前庭神経節。背がアップしています。スケールバー=300μmである。
図2。顕微解剖と対象領域の注入は。解剖皿に胚の(a)適切な位置に、頭と腹側のビューには、背側に傾いて、右側へのより良いアクセスを許可する側に少し変わった。右のeARが表示され、基礎となる乳頭基部は破線で示されている。で矢じり()とピペット挿入の初期位置(b)以下の解離を示し、(B)、ホワイトotoconial質量は乳頭基部(矢印)の頂端国境を画定する、見えるようになります。(C、D)の最初の注入は、提供すべきである蝸牛管の輪郭は(D)以降の注射は、音響神経節領域への蝸牛管と乳頭基部にだけ深くなされるべきである。 RDAの蛍光が強化射出奥行き知覚に有用であり、個々の注射は、約200の蛍光色素で標識されたスポットを作成する必要があります - 400μmの直径をここに見られるように。スケールバーは= 2ミリメートル。
Figure 3。 E8胚でトレースを選択聴覚繊維の代表的な画像。(AC)は低消費電力と異なる平面で同じ胚から採取した(DG)のハイパワー25μmの冠状切片は()RDAというラベルの付いた軸索は、注射部位(矢頭からたどることができる)、脳神経(矢印)を通って尾側に一次聴覚原子核ターゲット(二重矢印)に向かって、(B)抗ニューロフィラメント抗体で免疫標識からすべての軸索突起とRDA-トレース繊維は()聴覚投影内にある浮き彫り経路。別個のオーバーレイ(A)と(B)の色はもっと尾位置で同じ胚の(C)(DF)のハイパワーの画像にマージするように示さチャネルは神経エントリポイントで繊維の()の高解像度を示しています(矢印)と中央の経路に沿って(二重矢印)(E)</すべての軸索の染色強い>ニューロフィラメントは、PNS-CNSの境界だけでなく、推定上の聴覚に対する前庭予測を可能にします。 Ac及びVcは神経のエントリポイントの中心にそれぞれの聴覚と前庭の予測を示しているのに対し、APおよびVpは、神経のエントリポイントに周辺それぞれの聴覚と前庭のコンポーネントを示します。別個のオーバーレイ(D)及び(E)の色として示さチャンネル(F)(G)のアコースティック神経節の組織学的検査では(AF)に示すトレースおよびその周辺の突起からラベル音響神経節細胞の位置を明らかに(に合併アスタリスク)は乳頭基部に逆行トレースされます(H)が 700μmのトレース経路のイラストはE8で聴覚特有の第VIIIラベリングと予想。注射部位(赤丸)は神経のエントリポイントに尾であり、中央の突起が吻側と尾側後脳回の旅行。 VP =末梢チョッキibular、AP =末梢聴覚、VC =中枢前庭、AC =中枢聴覚、AG =劣っ前庭神経節をIVG =音響ガングリオン、BP =乳頭基部、LM = lagenarの黄斑、SVG =優れた前庭神経節、。 ACのスケールバーは=300μmで、DFの100μmで、Gは100μmとHは500μm。
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Discussion
VIIIth神経の早期開発の研究があるため、複数の別個の神経節から生じる胚軸索を識別するのに難しさの一部に限られていた。いくつかの研究は、初期の開発中に、聴覚と前庭感覚細胞と神経節細胞の運命を導く分子シグナル、5,11,12を検討されているが、中枢神経支配を規制するプロセスがまだ決定されています。レスがプライマリ核に投射する中央のプロセスについてはほとんど知られていないのに対し、音響神経節細胞突起のレポートは、通常、感覚上皮13から15に周辺プロセスについて説明します。胚発生時の中央に突出する第VIII因子の細分の研究では、哺乳類の組織切片17にニワトリ胚後脳16またはカルシウムイメージングでは、このような光学録音のように、頻繁に電気生理学的であるが、神経回路の完了前に実行することはできません。ラベルへの免疫学的マーカーの使用ひよこVIIIth神経における聴覚軸索は現在可能ではありません。転写因子の異なるグループが前庭ニューロン18から23対聴覚との相関が発見されましたが、これらの因子の発現は、軸索から除外されます。マウスでは、違いがモダリティ間の軸索成長を区別することができます。これらの遺伝子産物の23さらなる研究は、哺乳類と鳥類の両方の研究のための重要なツールをもたらす可能性がありますいくつかの有望な候補を含む遺伝子発現のらせん神経節及び前庭神経節の間に発見されています。ここで説明する方法で、無傷の聴覚回路と胚組織を生体内で聴覚繊維は、選択的にそれらの中心ターゲットにさかのぼることができます。
ニワトリ胚は、発生生物学者のために特に有用脊椎動物のシステムであり、哺乳動物系で見つかった制限のいくつかを克服する可能性がある。早い段階で内耳のパターニングと形態形成の調節末梢聴覚系が形成されているときのニワトリ胚の初期段階で、げっ歯類の胚より大きく、より簡単にアクセス可能ですが鳥類は、哺乳類1,12に著しい類似性を示しています。聴覚繊維の選択的なトレースのためにここに示す方法は、途上内耳の中央の突起に初期の実験を容易にします。
我々は、差動VIIIth神経の中枢聴覚予測を識別するための努力で、このプロトコルを開発したが、同様にそれを選択的に内耳の他の感覚器官からの繊維を標識するために変更することができます。前述の方法とは対照的に、この手順は、無傷の回路全体で組織を生きた上で行われる。行われた同様のメソッドは、鳥類の胚発生時VIII聴覚求心性神経支配のタイミングを記述するために使用されていましたが、前庭繊維もうっかり標識した3はここで我々は明らかに領域を特定したりするためのメソッドを提供します。selectのiginと終了、ならびに高い単繊維の解像度は、脊椎動物の胚発生時の聴覚求心性神経を集中的に突出する。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されていません。
Acknowledgments
著者らは、初期胚発生時にひよこ内耳の解剖学上の専門知識のためのイメージング技術と博士ドリス·ウーとの提案と支援博士キャンディHsieh氏に感謝したいと思います。この作品は、NSF、IOS-0642346、NIH T32-DC010775、NIH T32-GM008620、NIHのR01-DC010796、とDOE GAANN P200A120165によってサポートされていました。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Polystyrene Weigh Dish | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
Petri Dish, 35 X 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | Use to make silicone dissection dish |
Sylgard Silicone Elastomer Kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Coat Petri to make dissection dish |
Dissection Pins | Various | Holds embryo in place during dissection | |
NaCL | Various | part of aCSF recipe | |
KCl | Various | part of aCSF recipe | |
KH2PO4 | Various | part of aCSF recipe | |
NaHCO3 | Various | part of aCSF recipe | |
Glucose | Various | part of aCSF recipe | |
CaCl2 | Various | part of aCSF recipe | |
MgSO4 | Various | part of aCSF recipe | |
Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid |
Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial | American Pharmaceutical Partners, Inc | 6332300105 | Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream |
Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler | Various | Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF | |
Glass stem bubbler | Various | To infuse carbogen into aCSF | |
Curved-tip forceps | World Precision Instruments | 501008 | To remove embryo head from egg |
Two fine-tip forceps | World Precision Instruments | 501985 | For micro-dissection |
50 ml Beaker | various | ||
Rhodamine Dextran Amine (RDA) | Invitrogen | various | Fluorescent axon tracer |
Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) | Various | Standard lab reagent | |
Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4" (100 mm) length | World Precision Instruments | TW120F-4 | Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes |
Needle / Pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2 |
Picospritzer | Parker Instrumentation | various | Attach by fine tubing to glass micropipette |
Micromanipulator | Narishige | various | |
Dissection microscope with fluorescence | Various | ||
4% Paraformaldehyde | Various | Standard lab reagent | |
anti-Neurofilament antibody, optional | Millipore | AB1991 | Follow histological protocol recommended by manufacturer |
Cryostat and associated materials for sectioning | Leica | various | |
Epifluorescent microscope for imaging | Zeiss, various |
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